TLR3在抗病毒天然免疫中的研究进展.doc

TLR3在抗天然病毒免疫中的研究进展摘要:Toll样受体3(TLR3)作为病毒双链RNA识别受体在机体抗病毒天然免疫中发挥十分重要的作用。TLR3识别配体后通过含TIR结构域的转接蛋白(TRIF)途径活化转录因子NF-B和干扰素调节因子3( IRF3),诱导炎症细胞释放炎症因子并介导炎症反应,同时诱导I型干扰素的释放,介导抗病毒天然免疫。在一些病毒感染中TLR3通过诱导组织损伤介导病毒的扩散从而加重疾病的严重程度。 本文对 TLR3 在 RSV 感染中的作用研究进展作一综述。关键词:Toll样受体3；信号转导；呼吸道合胞病毒 ；天然免疫 Toll样受体是最新发现的一类受体家族。1985年及其同事最早发现存在与果蝇中，基因缺失果蝇不能正常发育，胚胎缺失完整的神经系统和中胚层。1996年等证实基因突变对真菌感染的易感性增加。1997年等发现人和其他哺乳动物中存在有与结构类似的蛋白，称为TLR。目前，在人和其他哺乳动物中至少发现12个TLR成员。TLR3定位与胞浆的内体中，能识别病毒和细菌核酸。天然免疫是抵御病毒感染的第一道防线。固有免疫是否健全，决定了是否能够充分启动适应性免疫。病毒感染早期，病毒诱导固有免疫，由模式识别受体（pattern recognition receptors, PRRs）识别病原相关分子模式（PAMP）,并通过不同的信号转导途径诱导促进体内功能最为强大的专职抗原提呈细胞树突状细胞（dendritic cells,DC）生成型干扰素等细胞因子，遏制病毒复制。TLR3 是最早发现能特异性地识别 dsRNA 的一种病原体相关分子模式识别受体。大多数病毒在其复制的同时就在启动 dsRNA 的合成，感染病毒的濒死细胞会释放 dsRNA，这些 dsRNA 就会成为感染状况的预警指标，因此 TLR3 在抗病毒免疫反应中发挥着很重要的作用。1.TLR3 基因定位及其蛋白结构 TLR3基因定位于染色体4q35上,全长为3029bp，主要有两种转录产物：4.0kb和6.0kb的mRNA。TLR3基因共编码904个氨基酸。通过比较人类TLR110氨基酸的相似性、进化关系和亲缘性，发现TLR3和TLR7、TLR8、TLR9较相近同其他TLR一样，人类TLR3属于I型跨膜蛋白，由胞外区、跨膜区、胞内区三部分组成。胞外区有23个富含亮氨酸重复序列和N、C末端侧翼区，能够识别不同的疾病相关分子模式。胞内区结构与白介素1受体1(Interleukin-1 Receptor 1,IL-1R1) 的胞内区相似,称为TIL区(TLR/IL-1 homologous region)，和胞内信号传导有关。胞外结构域含15个假定的碳水化合物结合基序。最近的人TLR3结构分析显示LRRs形成一个大马蹄形、螺线形结构，一面富含碳水化合物，而另一面未被糖基化1.2。TLR3分子排列成水晶二聚体，C端高保守区残基和TLR3特有的LRR20位点插入物外观似大马蹄形1。Bell等阐明，TLR3不含多聚糖面第20亮氨酸重复序列上H539、H541位点是结合配体、传导信号的重要氨基酸3。两面的正电荷残基和碳水复合物成分与TLR3的功能无关。在既往研究基础上，Bell提出一个dsRNA诱导的对称受体交联模型4。研究表明，当LRR缺失时TLR3C末端LRR20-LRR22受体的聚合、信号传导控制着。受体胞内TIR区的重构对于TICAM-1的结合与活化很必要。然而，细胞外的受体间的结合是如何诱导胞内TIR区的重构,目前尚不清楚。2.TLR3 的配体 TLR3能够识别机体合成的dsRNA、人工合成的dsRNA类似物PolyI:C,说明双TLR3活化起主要作用的是双链RNA，而不是5三磷酸根。TLR3主要表达在细胞内，所以配体需要借助阳离子脂质体如Lipofectin、DOTAP转染进入胞内。dsRNA脂质体复合物到达内涵体，活化TLR3。这样细菌总RNA以及体内转录的ssRNA（不是哺乳动物富含的总RNA），能够活化表达TLR3的HEK293细胞。使用修饰的RNA证实，双链RNA的核苷酸的修饰如甲基化能抑制TLR3对体内转录的ssRNA的识别。TLR3能识别未经过修饰的dsRNA。TLR3能否识别来自正链或者负链ssRNA病毒的病毒RNA，尚不清楚。有必要用裸细胞进行试验，来确定TLR3的配体。3.TLR3 介导的胞内信号传导通路 髓样细胞分化因子88(myelold differentiation factor,MyD88)，能和所有已知的TLRs的TH结构域相互作用。TLR3识别病毒的dsRNA或PolyI:C后，通过依赖或不依赖MyD88的信号通路，激活细胞内信号传导通路，诱导NF-B、Ap-1、Elkl等转录因子的产生，调节免疫细胞因子的表达，介导天然免疫应答，进而抵御病毒的感染。病毒dsRNA或PolyI:C激活TLR3后，还能经由独立于MyD88的信号通路激发NF-B和MAPK的活性，诱导树突状细胞的成熟。而且在TLR3细胞内信号传导中，不依赖MyD88的信号通路可能具有更重要的地位，因为在MyD88缺失的巨噬细胞中PolyI:C也可诱导NF-B和MAPK的激活，且其活化程度与野生型巨噬细胞基本相同。在MyD88缺失的细胞中，TLR3依然能够诱导IFN-的产生，这势必有其它相关分子的存在。Oshiumi H等人分离鉴定了一种选择性的调节蛋白，指定其为具有TIR区域的调节分子1(Toll-interleukin 1 receptor domain (TIR)-containing adaptor molecule，TICAM-1)，也叫TRIF。在PolyI:C的刺激下，TRIF与TLR3的TIR结构域物理性的结合，诱导IFN-、IFN-的分泌5；分泌的IFN-、IFN-又可通过其受体诱导TLR3的表达。IRF3的激活 当dsRNA与TLR3结合，TLR3招募TIR接头分子TRIF,TBK1TANK（肿瘤坏死因子受体相关因子家族膜相关NF-kB激活剂）结合激酶1再被招募到TRIF氨基末端诱导IFR3激活。这一途径对于I型IFN的产生极为重要。另一个与IRF3活化有关的分子是磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K），TLR3在激活时其胞内区的两个酪氨酸残基被磷酸化，PI3K则被有序地招募到这些磷酸化残基上，IRF3完全活化需要此过程参与。4TLR3在抗病毒感染的固有免疫中作用 TLR3 是最早发现能特异性地识别 dsRNA 的一种病原体相关分子模式识别受体。大多数病毒在其复制的同时就在启动 dsRNA 的合成，感染病毒的濒死细胞会释放 dsRNA，这些 dsRNA 就会成为感染状况的预警指标，因此 TLR3 在抗病毒免疫反应中发挥着很重要的作用。6TLR3 的特异性配体是 dsRNA(double-stranded RNA)，RSV 在复制和转录过程中可产生大量 dsRNA。Groskreutz D.J.7等用 RSV 感染 A549 细胞和人支气管上皮细胞发现，RSV可上调TLR3和双链RNA依赖的蛋白激酶(dsRNAdependent proteinkinase，PKR)，上调 TLR3mRNA、蛋白的表达量，且其在细胞膜上的分布量也增加。TLR3 和 dsRNA 结合后，可经由 MyD88 依赖和非依赖两条途径来诱导 NF-B的激活，促进其转位进入细胞核内和 DNA 片段结合，启动相应的炎性因子和细胞因子的转录和翻译，如 IL-8、IL-12、TNF、IFN等，从而引起抗病毒免疫反应，抵抗病毒的进一步感染。RSV 预感染的 A549 细胞和人支气管上皮细胞对 poly(I:C)（人工合成的双链 RNA，模拟病毒感染）的反应性要比未作 RSV 预处理的细胞强，NF-B 和 IL-8 的表达量升高更显著。这说明 RSV 感染后通过上调 TLR3 和其在细胞膜上的分布量，能提高宿主细胞对随后的病毒感染的反应敏感性。Spann K.M.8等的研究结果显示，RSV 的 NS1 蛋白和 NS2 蛋白可通过干扰 IRF-3 的活化而阻断TLR3 和 TLR4 的 MyD88 非依赖途径的干扰素产生，从而逃避宿主细胞的免疫清除作用。而 Rudd B.D.等人用等量的 RSV 感染 TLR3 转染的人胚肾（humanembryonic kidney，HEK）293 细胞（稳定表达 TLR3）和媒介对照细胞发现，TLR3在 RSV 复制中没有作用。稳定表达 TLR3 的 HEK293 细胞中，活的 RSV 诱导趋化因子 CXCL10(Chemokine X-X-C motif ligand 10)、CCL5（Chemokine C-C motifligand 5）、CXCL8(Chemokine X-X-C motif ligand 8)等的表达具有时间和量的依赖性，用针对 TLR3 表达的小干扰性 RNA（siRNA）可以显著降低 CXCL10 和 CCL5的表达水平，而对 CXCL8 的表达影响不大。而且 RSV 诱导 CXCL8 的表达是通过TLR3 介导的 MyD88 依赖途径，而诱导 CCL5 则是通过 MyD88 非依赖途径. RSV 感染和病毒复制时可以上调 TLR3 基因和蛋白的表达。有研究表明，在 RSV 感染宿主细胞不仅 TLR3 的表达上调，而且在细胞膜上的分布量也增加，提高了宿主细胞对随后的刺激因素（如病毒、细菌等感染）的反应敏感性9。RSV 感染后，TLR3 与病毒复制和转录过程中形成的 dsRNA 结合，上调 TLR3 的表达而且其在细胞膜上的分布增加，并进一步与 dsRNA 结合，形成一种正反馈调节。5. 小结和展望 TLR 家族是从果蝇到人类进化中保留下来的高度保守的分子家族，在启动宿主细胞对病毒的天然免疫和调节获得性免疫中发挥重要作用。RSV 感染宿主细胞后，可通过不同的 TLRs 和 RSV 不同的 PAMPs 特异性结合，启动依赖 MyD88 和非依赖 MyD88 的信号转导途径，诱导 NF-B 的激活和核转位，调控多种细胞因子、趋化因子、炎性因子等的转录和翻译，引起炎症反应，抵抗病毒的进一步感染。而 RSV 也可通过抑制 TLRs 的信号级联转导途径，抑制宿主细胞产生干扰素，从而逃避宿主细胞的免疫防御反应。因此，研究并阐明呼吸道合胞病毒激活和抑制TLRs 的胞内信号转导途径及机制，对 RSV 诱发的婴幼儿毛细支气管炎、肺炎、哮喘等疾病的防治有着十分重要意义。多年来对 RSV 疫苗研究进展缓慢，这一机制的研究提示我们在进行重组疫苗病毒时应考虑消除或降低宿主免疫反应的破坏能力，随着研究的深入可能会给疫苗的研制提供新的思路和策略。【参考文献】1 J. Choe,M.S. Kelker,I.A. Wilson,et al.Crystal structure of human Toll-like receptor 3(TLR3)ectodomain,Science. 2005,309:581585.2 J.K. Bell,I. Botos,P.R. Hall,et al,The molecular structure of the Toll-like receptor 3 ligand-bindingdomain.Proc. Natl. Acad. Sci. USA . 2005,102:1097610980.3 J.K. Bell, J. Askins,P.R. 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