基因工程名词解释笔记.doc

1.基因：基因是一种具有遗传功能的DNA序列，编码功能性多肽或DNA分子。基因工程的定义：通过或者不通过载体，无论生物体是否独立，外源基因被转移到其他活细胞或有机体，创造出新的物种并克隆出很大数量的过程。启动子：DNA分子上能与RNA聚合酶结合并形成转录起始复合体的区域。2.增强子：增强基因启动子工作效率的顺式作用序列，能够在相对于启动子的任何方向和任何位置(上游或下游)上都发挥作用。3.操纵子：转录的功能单位。很多功能上相关的基因前后相连成串，由一个共同的控制区进行转录的控制，包括结构基因以及调节基因的整个DNA序列。4.基因工程的应用：a增强生物天然存在的功能b改变生物的基因型c特异性增强生物没有的功能d增强生物对外部伤害的抵抗能力e提供作研究材料生物的DNA和RNA序列f给人类和用于研究的生物体的基因组作用。5.基因工程中常用的酶：核酸酶（内切酶和外切酶）、连接酶、聚合酶、修饰酶、DNA结合蛋白6.星号活力：在极端环境下，如高PH或低离子浓度下，限制性内切酶特异性降低，会造成对许多位点的识别，产生许多不想得到的片段。7.a同位酶：识别相同序列，但在不同位点切割。b同裂酶：识别序列及酶切位点均相同，但来源不同。C同尾酶：识别序列不同，但产生相同末端。8.RE的特点：a在大多数细菌中发现b其基本作用是当破坏入侵DNA时作为一种保护机制的酶来保护自身的DNA c限制性修饰系统中的修饰能力，通过在识别位点进行修饰防止RE切割反射d在对称序列中进行切割e只能识别一小段序列，通常为4-6bps。F切割产生粘性末端g在DNA内部切割。9.DNA pol I：5-3聚合酶活性、5-3外切酶活性（切除引物）、3-5外切酶活性（校正）10.Taq：无3-5外切酶活性，用此错配率高，逆转录。11.klenow fragment：无5-3外切酶活性。修饰酶：常用的有碱性磷酸酶、末端转移酶。12.碱性磷酸酶，从5端移除磷酸集团，防止载体自连。末端转移酶（TdT），不需要模板进行DNA的合成，只是将核苷酸加到已知的DNA分子的3-OH末端。14.克隆载体的性质：1、分子量小，易于分离和纯化。2、有一个或多个限制性酶切位点3、有选择标记基因。4、有复制起始点和整合位点。5、易于转入载体。15.低分子量质粒的有点：1、能容纳大分子量外源DNA2、便于操作3、常有高拷贝数4、含多个酶切位点的可能性低16.质粒的性质：1、自我复制2、扩增3、可转移4、不相容质粒作为载体的优点：1.易与宿主细胞分离2.分子量小，易容纳较大的外源DNA3.有两个以上的选择标记基因便于重组子的筛选和鉴定4.有一个复制起始位点5.可转入宿主细胞6.有一个或多个限制性酶切位点7.对于表达载体还要有启动子，增强子，SD序列，终止子17.基因制备的方法：cDNA文库法、基因组文库法、PCR法、化学合成法、鸟枪法。18.基因筛选的方法：应用核酸探针、应用差别杂交、应用mRNA差显技术、酵母双杂交、表达蛋白的特性、插入失活。19.cDNA文库：是对不同生物的cDNA片段的收集，将每个cDNA片段克隆到一个载体上，便于纯化、贮存、分析，这些片段是由mRNA为模板，用逆转录酶合称双链cDNA，再接到载体上，转化到宿主细胞后建立的基因方法。构建cDNA文库的步骤：1、cDNA的合成。2、mRNA完整性的检测。3、第一条链的合成。4、第二条链的合成。5、cDNA的尾部处理。20.构建基因组文库的步骤：1、目的片段的获得2、克隆全部的外源DNA片段3、目的重组子筛选4、目的基因定位21.基因组文库：代表一个生物整个基因组的所有DNA的重组克隆物的集合。22.扣除杂交：扣除杂交又叫扣除cDNA克隆，它是通过构建扣除文库得以实现的。它的本质是除去那些普遍共同存在的、或是非诱发产生的cDNA序列，从而使欲分离的目的基因的序列得到有效的富集，提高了分离的敏感性。23.PCR（聚合酶链式反应）特点：（1）用单链dna为模板合成互补链，其方法与细胞内DNA复制相似。（2）首先单链DNA不需要纯化，因为PCR有两个引物，结合到DNA特定位点。（3）两个引物之间的DNA片段通过DNA聚合酶作用而精确复制。（4）共有3个步骤，即变性，退火，聚合步骤：1.DNA变性（90-96）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA 2.退火（25-65）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。 3.聚合（60-70）：在耐高温的DNA聚合酶下进行扩增。基本成分：模板链，dNTP，含Mg2+的缓冲液，耐高温的DNA聚合酶，引物。引物设计：1.长度1830bp。 2.避免引物内部或引物之间存在互补序列。 3.两引物之间Tm值差异最好在25 ，以保证两引物正常退火。 4.G+C含量在4060之间 5.引物的3端最好为G或C，但不要GC连排。24.核酸探针标记方法（1）末端标记法：a.碱性磷酸酶除去5P基团，再用多核苷酸激酶加上ATP和32P。 b.利用CIP（磷酸化酶）的可催化反应，在5端加上或去掉磷酸基团（2）切口平移法：先用DNase产生单链切口，然后用DNA聚合酶不断切除旧链，合成新链（加标记酶dNTP）（3）引物延伸法：双联变性后，加入随机引物，和标记的dNTP，合成新链。（4）非放射性杂交探针标记法。25.电泳：带电物质或细胞在电场中的泳动。根据大分子或颗粒的电荷、大小和形状不同，使其在通过电场中的凝胶或介质时发生分离的方法。种类：1.琼脂糖凝胶电泳：分离大片段DNA分子（5020000bp）2.聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）：分离小片段DNA分子（5500）3.脉冲场凝胶电泳（PFGE）：可分离10mb以上DNA26.Western杂交：Western杂交是将蛋白质电泳、印迹、免疫测定融为一体的特异性蛋白质的检测方法。Western杂交方法灵敏度高，通常可从植物总蛋白中检测出50ng的特异性的目的蛋白。其原理是：生物中含有一定量的目的蛋白。先从生物细胞中提取总蛋白或目的蛋白，将蛋白质样品溶解于含有去污剂和还原剂的溶液中，经PAGE电泳将蛋白质按分子量大小分离，再把分离的各蛋白质条带原位转移到固相膜上，接着将膜浸泡在高浓度的蛋白质溶液中温育，以封闭其非特异性位点。然后加入特异抗性体（一抗），膜上的目的蛋白（抗原）与一抗结合后，再加入能与一抗专一性结合的带标记的二抗（通常一抗用兔来源的抗体时，二抗常用羊抗兔免疫球蛋白抗体），最后通过二抗上带标记化合物（一般为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶）的特异性反应进行检测。根据检测结果，从而可得知被检生物（植物）细胞内目的蛋白的表达与否、表达量及分子量等情况。27.DNA测序 化学法：使用特殊化学试剂处理，使DNA链在特定的碱基断裂，电泳分析。步骤：a形成被放射性标记的单链DNA b将含有被放射性标记的DNA分成4个样品c将DNA上的碱基进行化学修饰后移去d用六氢吡啶使磷酸断开e5末端标记的不同长度的一组片段产物f电泳分析优点：可测定短片段序列、不需重新合成DNA链，准确度高、不需亚克隆和测序载体缺点：费时间，不安全。sanger法：对待测链进行PCR扩增，其中加入少量标记有不同颜色，因此扩增产物为一系列长短不同且标有不同颜色的片段，经电泳及电脑分析，确定序列顺序优点：快速，简便 缺点：pcr合成可能有误、不能准确测小片段DNA序列、某些序列的组分或二级结构可能使链不能扩增28.定点突变：定点突变是指通过PCR等方法向目的DNA片段中引入所需变化（通常是表征有利方向的变化），包括碱基的添加、删除、点突变等。定点突变能迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。盒式诱变：用一段人工合成的片段取代原野生型中相应片段引物延伸：使用化学合成的突变碱基的片段作为引物，启动单链DNA子链的一部分，因此新产生的链便具有了已发生突变的碱基序列。PCR法：使用含突变碱基的oligo引物进行PCR。第一种是设计4个引物，从诱变点设计互补引物a，a扩增，再设计b,c末端引物扩增。第二种是需要3个引物，先设计诱变引物a，再以b引物扩增短片段，以扩增出的片段为大引物扩增，设计引物c末端扩增。29.PCR的种类：1、RT-PCR（逆转录PCR），可用来检测HIV，以RNA形式存在，需要逆转录。2、竞争性PCR：将标准DNA与检测样品DNA进行同样的处理，进行增值放大，共同竞争已知数量的引物，扩增后经电泳分离，根据凝胶上的荧光强度即可推测出检测样品的浓度。3、不对称PCR：使用两种引物，浓度相差50100倍，低浓度的引物称为限制性引物，在限制性引物用完之前，扩增产物主要是双链DNA，且以指数的形式上升，经过一段时间后，只剩下高浓度引物，继续扩增，就会合成单链DNA，且以线性的方式增加。4、锚定PCR：一个引物是根据已知序列设计的特异性引物，另一条则是根据序列的共同特征设计的非特异性引物，这种特异性的通用引物起到在其中一端附着的作用，故成为锚定引物。5、RACE（rapid-amplification of cDNA ends）：是一种基于mRNA反转录和PCR技术建立起来的，以部分的已知序列为起点，扩增基因转录本未知区域，从而获得mRNA完整的序列的方法。6、差显PCR（diffierential-display PCR）：以不同来源的细胞或不同状态的同种细胞作为研究对象，分别抽提各自的总RNA然后以oligo-dT12MN为锚定引物，在反转录酶的左右能够下将mRNA逆转录成cDNA，随后采用5端随机引物和3端oligo-dT12MN引物以及同位素标记的dNTP进行PCR扩增反应，然后电泳，作放射性显影，对X光片上显示的条带对比分析，从中推出差异表达的cDNA片段。30.包涵体（IB，inclusion body）：在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体。优点：1.易分离纯化 2.防止蛋白酶酶切缺点：1.提取过程部分丢失 2.溶解需高浓度变性剂，复性之前先去除IB形成的影响因素：1.温度2.表达量3.细菌基因型4.外源蛋白aa序列IB的分离：菌体破碎离心收集清洗31.融合蛋白(fusion protein)：将外源基因与受体菌自身蛋白编码基因拼接在一起，作为同一阅读框架进行表达，由这种混合基因表达产生的蛋白成为融合蛋白。 优点：1.稳定性高2.易分离纯化3.可能含信号肽，使蛋白质在细胞内正确定位4.表达效率高缺点：1.可能重组蛋白活性，需去掉2.酶切位点不能再外源蛋白内部构建融合蛋白的原则：1.受体菌结构是能高效表达且表打产物可通过亲和层析等进行特异性简单纯化2.外源基因应在受体菌结构基因下游区域并为融合蛋白提供终止密码子。3.外源基因的表达须有正确的orf32.在E.coli内表达重组蛋白的问题1、外源基因的问题：有内含子、含终止信号、密码子偏好性。2、E.coli的问题：不能正确的修饰（如糖基化）、不能正确折叠、酶解。 对策：1、使用突变E.coli菌株2、选择特定宿主菌株3、融合蛋白33.工程菌的遗传不稳定性：不稳定的类型：1、重排DNA片段的缺失、重排、修饰2、质粒的逃逸，分配和不稳定。不稳定的原因：1、被宿主细胞降解2、高表达影响宿主正常代谢3、载体分配不稳定4、宿主细胞中内源性转座元件促进重组分子DNA的缺失和重排。对策：1、改进载体、宿主细胞体系：增强质粒稳定性、选择稳定的宿主细胞。2、增强选择压力：抗生素添加法、抗生素依赖法、营养缺陷型。3、控制外源基因定量表达4、优化培养条件34.酵母表达系统：1、优点：易培养、安全、表达载体为真核表达载体，更易表达高等生物蛋白、背景清楚、有强的可调控启动子。 2、缺点：糖基化位点过多、缺乏有效的分泌系统、密码子偏爱性。35.DNA重组的步骤：目的DNA片段的分离纯化将DNA连接到克隆载体上连接载体将重组克隆载体导入到受体细胞鉴定、筛选含有重组DNA的细胞36.碱法抽取质粒DNA：1、细菌的培养收获2、裂解细菌3、酚、氯仿提纯4、无水乙醇沉淀DNA。5、75%乙醇洗DNA。6、干燥。7、溶解保存37.连接的类别：相同粘性末端的连接、平末端的连接、不同粘性末端的连接、人工黏性末端的连接、酶切位点的点更换。38.Linker（连接子）：人工设计的一段双链dna序列，中间含有限制酶序列，用于DNA的链接。间隙连接的多亚基复合体单元，每一个连接子由6个穿膜的连接蛋白组成，中央有直径1.5nm的通道。相邻细胞的两个连接子构成一个间隙连接。39.Adapter（适配子）：是DNA的人工接头或插口，双链cDNA在与载体连接之前，要经过均聚物加尾、加接头等一系列处理，cDNA两端加不同的适配子。40.转化：感受态细胞从外界环境中摄取任何外源遗传物质，引起细菌遗传变化的现象。感受态：细胞处于能够吸收DNA的状态。处于感受态的细胞称感受态细胞。转化方法：化学法、物理法（电穿孔、显微注射、微粒枪法）电穿孔方法优点：简单快速可重复性好、转化效率高、可使用于大片段DNA分子转化缺点：对非细菌细胞，需制备原生质体、成本高41.蓝白斑筛选：当E.coli菌株表达Lac阻抑物时，载体上的LacZ基因由IPTG诱导表达，产生的-半乳糖苷酶可与底物x-ga