南方水稻黑条矮缩病测报调查技术规程

ICS     点击此处添加中国标准文献分类号DB 贵 州 省 地 方 标 准DB XX/ XXXXXXXXX南方水稻黑条矮缩病测报调查技术规程点击此处添加标准英文译名点击此处添加与国际标准一致性程度的标识（送审讨论稿）本稿完成时间：2015 年 7 月 10 日XXXX - XX - XX 发布 XXXX - XX - XX 实施贵 州 省 质 量 技 术 监 督 局 发 布 目次前言 .21 范围 .32 术语和定义 .33 南方水稻黑条矮缩病田间症状与识别 .34 南方水稻黑条矮缩病检测方法 .35 南方水稻黑条矮缩病发生程度 .46 系统调查 .47 大田普查 .48 测报资料收集和汇总 .5附录 A（资料性附录） 南方水稻黑条矮缩病田间症状与识别 .6附录 B（规范性附录） 南方水稻黑条矮缩病检测方法 .7附录 C（资料性附录） 南方水稻黑条矮缩病病情严重度分级标准 .9附录 D（资料性附录） 南方水稻黑条矮缩病病情指数计算 .10附录 E（资料性附录） 南方水稻黑条矮缩病发生程度分级标准 .11附录 F（资料性附录） 南方水稻黑条矮缩病模式报表 .12附录 G（资料性附录） 南方水稻黑条矮缩病发生防治基本情况调查记载表 .14 前言本标准按GB/T 1.12009标准化工作导则第1 部分：标准的结构和编写给出的规则起草。本标准起草单位：贵州大学，贵州省植保植检站 本标准主要起草人：金林红、宋宝安、金星、谈孝凤、贺鸣本标准为首次发布。 南方水稻黑条矮缩病测报调查技术规程1范围本标准规定了南方水稻黑条矮缩病田间症状与识别、检测方法、病害发生程度、系统调查、大田普查、测报资料收集和汇总。本标准适用于贵州省南方水稻黑条矮缩病的测报调查。2术语和定义下列术语和定义适用于本文件。2.1南方水稻黑条矮缩病毒南方水稻黑条矮缩病毒 (Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)是一种粒体球状斐济属水稻病毒病，白背飞虱（ Sogatella furcifera Horvth）是其主要的田间传毒介体。病毒存在于寄主植物韧皮部筛管及伴胞内，导致寄主植物矮化、茎表纵向条状排列小瘤突等症状。2.2传毒介体南方水稻黑条矮缩病毒传毒介体为白背飞虱 (Sogatella furcifera Horvth)，属昆虫纲、同翅目、飞虱科。成虫与若虫皆能传毒。2.3带毒率检测样本（水稻植株或白背飞虱）病毒数占样本（水稻植株或白背飞虱）数量的百分率。、2.4病株率调查发病株数占调查总株数的百分率。2.5病丛率调查发病丛数占调查总丛数的百分率。2.6病田率调查已发病田块数占总田块数的百分率。3田间症状与识别南方水稻黑条矮缩病田间症状与识别，参见附录A。4检测方法南方水稻黑条矮缩病检测方法，参见附录B。 5病发生程度5.1病情严重度分级标准南方水稻黑条矮缩病病情严重度分级标准，参见附录C。5.2病情指数计算南方水稻黑条矮缩病病情指数计算，参见附录D。5.3发生程度分级南方水稻黑条矮缩病发生程度分级, 参见附录E。6系统调查6.1调查时间自白背飞虱迁入水稻田高峰后起（一般早稻4月下旬至5月上旬，中稻5月下旬至6月上旬，晚稻7月下旬至8月上旬），每15 d调查1次（可结合白背飞虱虫量调查同时进行），至9月中旬调查植株结束。每次调查后，随机取白背飞虱100头，检测带毒率。6.2调查方法水稻秧田和大田，在白背飞虱带毒虫量高、常年南方黑条矮缩病发病比较重、有代表性的地区，选取不同感病品种、不同播栽期具有代表性的类型田各1块进行调查。秧田采取对角线5点取样法，每点随机取20株秧苗，共100株，检测带毒率，检测方法见附录B。大田采取平行线上等距离多点取样法，每块内调查100丛（即两边各10个点，每点5丛），记录发病丛数、发病株数、严重度，计算病株率、病丛率、病情指数。结果记入表1。表 1南方水稻黑条矮缩病田间发病系统调查表调查地点：      州（市）      县(市、区)      乡村       调查日期：     年     月     日严重度调查点数 类型田 品种调查总丛数(丛)病丛数 (丛)病丛率（%）调查总株数(株)病株数(株)病株率%0 1 2 3 4病情指数备注127大田普查7.1调查时间秧田期、分蘖初期、成熟期各一次。7.2调查范围 南方水稻黑条矮缩病发生区。7.3调查方法秧田采取对角线5点取样法，每点随机取20株秧苗，共100株，检测发病率。大田期分别选择不同类型田共20-30块，采取平行线上等距离多点取样法，每块内调查100丛（即两边各10个点，每点5丛），记载总丛数、病丛数，计算病丛率。结果记入表2。表 2南方水稻黑条矮缩病田间病情普查表调查地点：     州（市）      县(市、区)       乡村调查时间(月-日)品种 生育期调查田块（块）发病田块（块）病田率（%）调查丛数（丛发病丛数（丛）病丛率()8测报资料收集和汇总8.1测报资料收集(1)水稻播种期和各期播种的水稻面积及其它必须的栽培管理资料；(2)主要品种的栽培面积、生育期和抗性情况；(3)当地气象台（站）主要气象要素的预测值和实测值。8.2模式报表测报站每年定时填写南方水稻黑条矮缩病模式报表（参见附件录 F） ，报上级测报部门。8.3基本情况统计基本情况统计，参见附录G。 A A附录A（资料性附录）南方水稻黑条矮缩病田间症状与识别南方水稻黑条矮缩病主要田间症状表现为：分蘖增加，叶片僵直，叶色深绿，叶背的叶脉和茎秆上现初蜡白色，后变褐色的短条瘤状隆起（蜡白条），不抽穗，或穗小，空秕率高，不同生育期染病后的症状略有差异。苗期发病，心叶生长缓慢，叶片短宽、僵直、浓绿，叶脉有不规则蜡白色瘤状突起，后变黑褐色，根短小，植株矮小，不抽穗，常提早枯死。分蘖期发病，新生分蘖先显症，主茎和早期分蘖尚能抽出短小病穗，但病穗缩藏于叶鞘内。拔节期发病，剑叶短阔，穗颈短缩，结实率低。叶背和茎秆上有白色蜡条。水稻发病后典型表现为：高位分蘖、茎节部倒生须根、茎秆上有白色（或黑褐色）蜡条。 B B附录B（规范性附录）南方水稻黑条矮缩病检测方法B.1原理和方法针对南方水稻黑条矮缩病基因，设计特异性引物,采用RT-PCR方法检测的水稻和白背飞虱体内南方水稻黑条矮缩病。B.2仪器设备(1)高速台式冷冻离心机； (2)琼脂糖凝胶电泳仪；(3)电泳凝胶成像系统；(4)超净工作台；(5)水浴锅； (6)液氮罐。(7)研钵；B.3实验耗材(1)乳胶手套；(2)Tip头(10 L, 100 L, 1000 L)；(3)EPP管(1.0 mL和1.5 mL)；(4)烧杯：10 mL、50 mL、100 mL和1000 mL；(5)液氮；(6)量筒：10 mL、50 mL、100 mL和1000 mL；(7)试剂瓶：50 mL、100 mL、500 mL和1000 mL；(8)RNAiso plus总RNA提取试剂盒；(9)RNA酶抑制剂 (Inhibitor)；(10)Reverse Transcriptase M-MLV试剂盒；(11)dNTP Mixture；(12)DNA Marker 2000 bp；(13)Taq TM DNA Polymerase；(14)DEPC、Oligo18 (dT)；(15)50TAE电泳缓冲液。B.4试验步骤B.4.1样本总RNA的提取 (1) 剪取0.1 g疑似水稻样本茎部或5头飞虱样本组织至研钵中，液氮下充分研磨至粉末状，加入1 mL RNAiso Plus (RNA提取液)，继续研磨匀浆并转移至1.5 mL离心管；(2) 4 ，12,000 rpm离心5 min，将上清转移至无RNA酶的1.5 mL离心管中；(3) 按照上清的总体积，加入1/5体积的氯仿，盖好试管盖，剧烈震荡30 s，室温放置5 min至液体明显分层；(4) 4 ，12,000 rpm离心15 min，取上层无色的氯仿相转移至新的无RNA酶的1.5 mL离心管中；(5) 加入等体积的异丙醇，混匀，冰箱中冻存20 min；(6) 4 ，12,000 rpm离心10 min；(7) 加入1 mL 75% 乙醇 (DEPC处理过的水配制) 洗涤沉淀；(8) 4 ，12,000 rpm离心5 min，弃上清，短暂离心后，使用Tips吸净残留的上清，在超净台上吹干沉淀，加入30 L的DEPC水溶解RNA  (0.1 g 水稻、5头白背飞虱)。B.4.2反转录及PCR扩增B.4.2.1反转录反应以提取的总RNA为模板，在M-MLV反转录酶作用下，用随机引物合成 cDNA；B.4.2.2PCR扩增以合成 cDNA为模板，进行 PCR 扩增。使用常规 PCR 反应体系，PCR反应条件为：94 变性2 min；94 变性30 s，58 退火30 s，72 延伸70 s，35个循环；72 保持10 min；12 保持10 min。B.4.2.3琼脂糖凝胶电泳PCR 产物于 10 g /L 琼脂糖凝胶中电泳，用溴化乙锭染色后在凝胶成像系统下观察记录，并与核酸分子量标准 Marker 比较被扩增产物的大小，确定样本是否带毒。B.5结果计算水稻植株带毒率=感病植株株数/检测总株数（）白背飞虱带毒率=感病飞虱虫量/检测总虫量（） C C附录C（资料性附录）南方水稻黑条矮缩病病情严重度分级标准南方水稻黑条矮缩病病情严重度分级标准见表C.1。表 C.1南方水稻黑条矮缩病病情严重度分级标准级  别 症       状0  级 健株，无症状；1  级植株矮缩不明显，能抽穗，但穗小，结实率低，在中上部叶片基部可见纵向皱褶；在茎秆下部节间和节上可见蜡白色或黑褐色隆起的纵向排列小瘤突；2  级植株矮缩丛生，高度不及正常株的 3/4，有的能抽穗，但相对抽穗迟而小、实粒少、粒重轻，半包在叶鞘里，剑叶短小僵直；3  级植株分蘖增多丛生，矮缩明显，高度不及正常株的 1/2，主茎及早生分蘖尚能抽穗，但穗头难以结实，或包穗，或穗小，似侏儒病；4  级 植株严重矮缩，高度不及正常株的 1/3，后期不能抽穗，常提早枯死。 D D附录D（资料性附录）南方水稻黑条矮缩病病情指数计算南方水稻黑条矮缩病病情指数计算公式如下：10MIiBAd式中：A 病情指数；Bi 各级严重度病丛数；I 各级严重度代表值；M 调查总丛数；Id 严重度最高级代表值； E E附录E（资料性附录）南方水稻黑条矮缩病发生程度分级标准南方水稻黑条矮缩病流行程度以当地发病的平均病情指数表示，划分为5级，各级指标见表E.1。表 E.1南方水稻黑条矮缩病发生程度分级标准发生程度类型田 轻发生（1 级）中等偏轻发生（2 级）中等发生（3 级）中等偏重发生（4 级）大发生（5 级）平均病情指数 1.0 1.13.0 3.110.0 10.120 20 F F附录F（资料性附录）南方水稻黑条矮缩病模式报表表 F.1南方水稻黑条矮缩病灯下、田间白背飞虱带毒率检测模式报表序号 报表内容 结果 调查日期 灯下白背飞虱样本量（头） 灯下白背飞虱样本带毒量（头） 灯下白背飞虱样本带毒率（%） 带毒率比上年增减（%） 带毒率比历年平均数增减（%） 田间白背飞虱样本量（头） 田间白背飞虱样本带毒量（头） 田间白背飞虱样本带毒率（%） 带毒率比上年增减（%） 带毒率比历年平均数增减（%） 预 计 南 方 水 稻 黑 条 矮 缩 病 发 生 程 度 (级 ) 预 计 南 方 水 稻 黑 条 矮 缩 病 发生面积（万亩）注：此表在5-6月第一个灯下虫量高峰期开始，调查两次。表 F.2南方水稻黑条矮缩病田间植株发生情况系统调查模式报表序号 报表内容 调查结果 调查日期 稻作类型 秧田病株率（%） 本田病丛率（%） 平均严重度（%） 病情指数注：此表自田间见病后每月逢1、15日调查汇报1次。 表 F.3南方黑条矮缩病田间发生情况普查模式报表序号 报表内容 调查结果 调查日期 稻作类型 生育期 本田病田率（%） 本田病丛率（%） 发病面积（hm 2） 防治面积（hm 2）注：秧田期、分蘖初期、成熟期各调查一次，并于调查后第二个工作日上报。 G G附录G（资料性附录）南方水稻黑条矮缩病发生防治基本情况调查记载表表 G.1南方水稻黑条矮缩病发生防治基本情况调查记载表填报单位：      州（市）                       &nbs