（环境工程专业论文）杠板归的锰超富集机制研究.pdf

中南大学硕士学位论文 摘要 摘要 超富集植物是一种极端的金属积累型植物，因其超寻常的重金属 积累能力而被广泛应用于污染环境修复。因此，筛选生长快、地理分 布广，适应性强的锰超富集植物，探讨植物的锰超富集机制，是开展 锰污染环境植物修复的关键科学问题。 通过对湘潭锰尾矿废弃地系统调查，发现杠板归( p o l y g o n u m p e r f o l i a t u ml ) 对锰具有很强的耐性。通过温室培养，采用电感耦合 等离子体发射光谱仪( i c p o e s ) 、透射电镜能谱联用技术、傅里 叶红外光谱分析技术( f t i r ) 等分析手段研究杠板归的锰富集特性、 杠板归锰耐性的f t i r 分析、杠板归锰富集的生理响应，以期探讨杠 板归的锰超富集机制，为锰污染环境修复和锰尾矿废弃地生态重建提 供科学依据。 研究表明，杠板归是一种新发现的锰超富集植物。杠板归叶中的 m n 含量远远高于茎和根中的m n 含量；水培条件下，在m n 处理浓 度为5 0 0t t m o l l 。时，杠板归叶片中m n 含量高达1 3 1 4 0m g k g 一，而 无明显受害症状；随着m n 供应水平的提高，杠板归叶中的m n 含量 持续增加，并在m n 处理浓度为1 5 0 0 0i - t m o l l 1 时达到最大值 4 1 5 4 0 m g k g 一。随m n 处理浓度的提高，杠板归不同组织器官内m n 含量逐渐增加，c a 、m g 和f e 含量则随m n 含量的增加而减少，但都 维持在正常水平范围内。 红外光谱研究表明，杠板归茎组织在处理浓度5 0 0 p m o l l 1 后3 4 2 0 矛d 2 9 2 6c m l 处峰高先上升后下降，反映糖类和氨基酸等有机物在低 m n 处理浓度下往往作为渗透性调节物质出现，其含量升高，但随着 中南大学硕士学位论文摘要 m n 含量的升高，其合成和运输受限，含量逐渐下降；杠板归根2 9 2 6 c m 1 处2 0 0 9 m o l l j 后峰高先减弱后增强，说明杠板归分泌的有机酸 不断螯合m n 2 + ，造成羧酸o h 的减少，随着锰毒害的加重，其羧酸螯 合能力变弱。叶组织在1 6 4 0 c m _ 处的显着吸收峰可能与杠板归叶中 氨基酸、多肽和蛋白质类物质含量升高有关，或与根部输送的羧酸盐 过多有关，且与根部此处峰值的下降趋势吻合；杠板归根、茎、叶的 1 0 6 0c m l 处在最高浓度下峰值的变化，主要表现是膜脂过氧化，这可 能是杠板归的锰耐性有关。 透射电镜一能谱联用仪研究分析结果表明，当m n 处理浓度为 1 0 0 0 1 t m o l l 。时，杠板归根、茎和叶细胞结构完整，细胞器清晰可见， 未发生任何损伤。当m n 处理浓度为1 0 0 0 0 9 m o l l 。时，杠板归组织 细胞内细胞器未发生缺失。然而，根细胞内线粒体数量减少，茎细胞 的线粒体嵴数量减少变得稀疏、叶绿体开始受损，叶细胞叶绿体膜结 构出现破损，基粒片层结构减少，嗜锇颗粒数量明显减少。随着锰 处理浓度的提高，锰在杠板归叶细胞内和细胞间隙以针状结晶物出 现。 关键词杠板归，锰，超富集植物，生理响应，植物修复 中南大学硕士学位论文 a b s t r a c t a bs t r a c t h y p e r a c c u m u l a t o ri s a ne x t r e m em e t a la c c u m u l a t i n gp l a n t sa sa p o t e n t i a l l yc o s t - e f f e c t i v e ，e n g i n e e r i n g e c o n o m i c a la n dg r e e nt e c h n i q u e t o c l e a n u ph e a v ym e t a l p o l l u t e ds o i l u s i n gh y p e r a c c u m u l a t o r s a c c o r d i n g l y ，e x p l o r i n g t h em e c h a n i s mo fm a n g a n e s et o l e r a n c ea n d h y p e r a c c u m u l a t i o ni si m p o r t a n t t of o u n do rc r e a t en e wm a n g a n e s e h y p e r a c c n m u l a t o rp l a n tw h i c hg r o w sr a p i d l y , h a ss u b s t a n t i a l b io m a s s ， w i d ed i s t r i b u t i o na n dab r o a de c o l o g i c a la m p l i t u d e p o l y g o n u mp e r f o l i a t u ml h a sb e e nf o u n dt ob ean e wm a n g a n e s e h y p e r a c c u m u l a t o rb ym e a n so ff i e l ds u r v e y sa tx i a n g t a nm a n g a n e s e r a i l i n g sw a s t e l a n d s ，h u n a n p r o v i n c e t h ep r e s e n ts t u d yc a r r i e do u ts e r i e s o fe x p e r i m e n t s ，i n c l u d i n gh y d r o p o n i cc u l t u r e ，s c a n n i n g e l e c t r o n i c m i c r o s c o p y ( s e m ) a n dt r a n s m i s s i o n e l e c t r o n i cm i c r o s c o p y ( t e m ) ， i n d u c t i v e l yc o u p l e dp l a s m ao p t i c a le m i s s i o ns p e c t r o m e t e r ( i c p o e s ) ， f o u r i e rt r a n s f o r mi n f r a r e d s p e c t r o s c o p y ( f t i r ) ，t oi n v e s t i g a t e t h e r e s p o n s e so fp o k e w e e d st r e a t e dw i t hd i f f e r e n tl e v e l so fm n ，d e t e c tm n u p t a k e ，a c c u m u l a t i o na n ds u b c e l l u l a rd i s t r i b u t i o ni np o k e w e e d ，a n a l y z e t h ec o r r e l a t i o nb e t w e e nt h ep o s s i b l ef a c t o r si n v o l v e dw i t hm nr e s i s t a n c e a n dm na c c u m u l a t i o na n dd e t o x i f i c a t i o n ，a n df u r t h e re x p l o r et h ep o t e n t i a l m e c h a n i s m so fm nr e s i s t a n c ei nt h ep l a n t t h i sr e s e a r c hc o u l da d v a n c e o u ru n d e r s t a n d i n go fm nr e s i s t a n c ei np l a n t ，a n dp r o v i d et h e o r e t i c a l e v i d e n c ea n ds c i e n t i f i cd i r e c t i o n sf o rt h ec o r r e c t i o no fm nt o x i c i t yt o c r o p s a n d p h y t o r e m e d i a t i o n o fa c i ds o i l so rr e l a t i v e h e a v y m e t a l c o n t a m i n a t e ds o i l s t h em a j o rr e s u l t so b t a i n e da r ea sf o l l o w s t h eg r o w t ho ft h ep l a n tw a sn o ta f f e c t e db yl o wc o n c e n t r a t i o no fm n ， w h i l ed i f f e r e n c e sw e r es h o w e da th i g hc o n c e n t r a t i o no fm nl i k eg r o w t h ! i i 中南大学硕士学位论文a b s t r a c t w a ss l o w , b i o m a s sr e d u c e d s i g n i f i c a n t l y a n d m a n g a n e s et o x i c i t y s y m p t o m sr e v e a l e di nt h ef i n a lp h a s e ，b u tl i f ec y c l ew a ss t i l lf i n i s h e d c o m p l e t e l ya tt h ee n d a sm nt r e a t m e n tc o n c e n t r a t i o ni n c r e a s i n g ，m n c o n t e n ti np e r f o l i a t ek n o t w e e dt i s s u e si sh i g h e r m nc o n t e n ti nl e a v e so f p e r f o l i a t ek n o t w e e di s1 31 3 8 m g k g a t 5 0 0 p m o l l m n a t 10 0 0 0 p m o l l ，m nc o n t e n ti ns t e m sa n dl e a v e sr e a c h e st h em a x i m u m ， t h a ti s16 0 7 7a n d414 0 4m g 。k g ，r e s p e c t i v e l y a n dm nd i s t r i b u t i o n s e q u e n c ei s ：l e a v e s r o o t s s t e m s ， m e a n w h i l et h et r a n s l o c a t i o n f a c t o r 1 t h i s i m p l i e s t h a t p o l y g o n u mp e r f o l i a t u m l w a sa m a n g a n e s e r e s i s t a n tp l a n t ，a n dw a sap o t e n t i a lm nh y p e r a c c u m u l a t o r f t i ra n a l y s i ss h o w e dt h a tu s i n gt h er o o t s ，s t e m sa n dl e a v e so f p o l y g o n u mp e r f o l i a t u ml ，a b s o r p t i o n b a n d s c o r r e s p o n d i n g t o c a r b o h y d r a t e s ，e s t e ra n dp r o t e i n sv a r i e dd i f f e r e n t l y t h ea b s o r p t i o nb a n d h e i g h t s a t3 4 2 0a n d2 9 2 6c m 。1 0 fs t e mt i s s u e sr o s e f i r s t l ya n dt h e n d e c r e a s e d ，i n d i c a t i n gt h ee x u d a t i o na n dt r a n s p o r t i n gs i t u a t i o no fo r g a n i c s u b s t a n c e sw h i c hs e r v e da s o r g a n i c o s m o t i cc o n t e n t st oe n h a n c e m a n g a n e s et o l e r a n c eu n d e rl o wt r e a t m e n t s ；m e a n w h i l e ，t h eb a n dh e i g h t s a t2 9 2 6c m 。1 ( r o o t s ) a n d16 4 0c m 。1 ( 1 e a v e s ) w h i c hh a v ed i f f e r e n tt e n d e n c y i na c c o r d a n c ew i t hm nt r e a t m e n t ss h o w e dt h a tt h ec a p a b i l i t yt oc h e l a t e m nd e c r e a s e du n d e rh i g h e rm a n g a n e s ec o n c e n t r a t i o n i na d d i t i o n ，t h e c h a n g e so ft h eb a n d sa t10 6 0c m 。1d i f f e r e df r o me a c ho t h e r , s u g g e s t i n g t h a tu n d e rt h ec o n d i t i o n so fs e v e r em ns t r e s st h ee x - o x i d a t i o no f m e m b r a n el i p i di n c r e a s e d a l lt h er e s u l ti m p l i e dt h a ti ti sp r a c t i c a lt o a p p l yf t i rt ot h er e s e a r c hc o m p a r i n gt h ec h e m i c a ld i f f e r e n c e so ft h e t o l e r a t ep l a n t su n d e rm e t a lt r e a t m e n t s s c a n n i n g e l e c t r o n i c m i c r o s c o p y a n dt r a n s m i s s i o ne l e c t r o n i c m i c r o s c o p yr e s u l t s s h o w e dt h a t ，c o m p a r e dw i t ht h ec k ，u n d e r10 0 0 p m o l l m nt r e a t m e n t ，t h e r ei sn oo b v i o u sd a m a g ef o u n di nl e a fa n dr o o t c e l l ss t r u c t u r ea n do r g a n e l l e so fp o l y g o n u mp e r f o l i a t u ml ，s t r u c t u r ea n d i v - 中南大学硕士学位论文 a b s t r a c t f u n c t i o ni n t e g r i t y a n dw h e nm ns u p p l yl e v e lr e a c h e d10 0 0 0g m o l l ， t h es t r u c t u r eo f p a r tc e l l sa n do r g a n e l l e s ( m i t o c h o n d r i a ，c h l o r o p l a s t s ，e ta 1 ) h a v es i g n i f i c a n td a m a g e a tt h es a m et i m e ，ak i n do fu n k n o w na c e r o s e s u b s t a n c ew a sf o u n di nt h em nt r e a t m e n tc e l l s ，t h i sc o u l db et h el o w b i o l o g i c a la c t i v i t yf o r m a t i o no fm nd e p o s i t so rc r y s t a l sw h i c hp r o d u c tb y t h ed e t o x i f i c a t i o nm e c h a n i s m so fp o l y g o n u m p e r f o l i a t u ml k e yw o r d s p o l y g o n u mp e r f o l i a t u ml ，m a n g a n e s e , h y p e r a c c u m u l a t o r p l a n t , p h y s i o l o g i c a lr e s p o n s e s , p h y t o r e m e d i a t i o n v 感谢 国家自然科学基金资助项目( 4 0 7 7 11 8 1 ) 国家公益性( 环保) 行业科研专项( 2 0 0 9 0 9 0 6 5 ) 对本论文的资助! 中南大学硕士学位论文第1 章绪论 1 1 引言 第一章文献综述 土壤是人类赖以生存的、不可再生或再生极为缓慢的资源。然而，无序的矿 山开采和冶炼、技术水平落后的工业生产和高强度的农业活动在推动社会经济发 展的同时，也将大量的重金属带入土壤环境。据统计全世界每年平均排放h g 约 1 1 5 万吨、p b 约5 0 0 万吨、c u 约3 4 0 万吨、n i 约1 0 0 万吨、m n 约1 5 0 0 万 吨。重金属污染不仅会导致土壤退化，农作物产量和品质下降，还通过径流和淋 洗作用污染地表水和地下水、恶化水文环境，并通过食物链、直接接触等方式危 害人体健康。据不完全调查，目前全国受污染的耕地约1 0 0 0 万h m 2 ，污水灌溉 污染耕地2 1 6 7 万h m 2 ，固体废弃物堆存占地和毁田1 3 3 万h m 2 ，三项合计约占 全国耕地总面积的1 1 0 以上。耕地污染已经对我国经济社会造成巨大的危害， 全国每年重金属污染区域生产的粮食达1 2 0 0 万t ，造成的直接经济损失超过2 0 0 亿元。在此背景下，土壤的重金属污染日益引起政府和公众的关注，土壤重金属 污染环境修复也成为当前国际环境科学研究的热点，如何修复受污染的土壤已成 为关系到改善生态环境和缓解人口压力的严峻问题之一。 2 0 世纪8 0 年代以前，重金属污染土壤治理大多数采用挖掘、填埋等异位 修复技术，不仅费用高、存在二次污染的风险，还占用大量土地。如据报道， 对l h m 2 面积的污染土壤进行工程法治理( 客土法) ，每1 m 深度土体的耗费高达 8 0 0 2 4 0 0 万美元【2 1 。针对填埋法和客土法存在的负面影响，世界各国都在寻找创 新性的土壤修复技术。重金属污染土壤修复的基本原理大致可归纳为固化作用和 活化作用两类，目前，重金属污染环境的修复主要采用物理化学修复技术( 动电 修复、土壤固化稳定化、土壤淋洗、隔离包埋技术和热冶分离技术等) 和生物 修复技术( 植物修复、微生物修复和动物修复等) 。 1 2 锰超富集植物研究现状 1 2 1 植物修复 1 9 8 3 年美国科学家c h a n e y 【3 1 首次提出了利用能够富集重金属的植物来清除 土壤重金属污染的设想，即植物修复技术。植物修复4 1 是指利用植物本身特有的 中南大学硕士学位论文第1 章绪论 吸收富集污染物、转化固定污染物以及通过氧化还原或水解反应等化学过程， 使土壤环境中有机污染物得以降解，使重金属等无机物被固定脱毒；同时还利用 植物根际圈特殊的生态条件加速土壤污染物的分解能力，以及利用某些植物特殊 的积累与固定能力取出土壤中的重金属元素【5 j 。植物修复技术已被各界广泛接 受，是一个比较便宜且便捷的控制土壤重金属污染的方法，甚至有科学家提出， 可使用植物此特性在土壤中提取有价金属。它有一个传统的环境修复技术不具备 的优势，体现在治理效果永久性、就地治理( 不造成土壤环境变化) 、治理费用 低、环境美学的兼容性。修复过程一般无二次污染，某些金属元素甚至可回收利 用，但也存在一些缺陷性和局限性1 6 7 j ，主要表现在：( 1 ) 适宜开展植物修复的植 物种类资源较少。( 2 ) 植物修复的效果除了与植物资源种类、土壤中污染物的种 类和有效性等因素相关，还往往受其它环境因素影响。 ( 3 ) 修复植物可被昆虫、 啮齿类动物、草食动物等摄取，土壤重金属存在进入食物链的风险。( 4 ) 受到植 物根系长度的影响，植物修复只适用于土壤表层或浅层地下水的污染治理。( 5 ) 受植物生长和提取转运重金属能力的限制，植物修复土壤重金属污染一般所需时 间较长。 植物修复在中国，在国家”8 6 3 ”计划、“9 7 3 ”计划和国家自然科学基金重点项 目的支持下，地理科学与资源研究所环境修复中心研究员陈同斌带领的研究组筛 选出一种砷的超富集植物一蜈蚣草脾1 ，解决了砷污染土地植物修复技术中的一系 列关键难题，在国际上首次建立了砷污染土地的植物修复示范工程，目前已经在 广西河池和云南红河州推广应用。 1 2 2 超富集植物 超富集植物( h y p e r a c c u m u l a t o r )词最初由b r o o k s 9 1 ( 1 9 7 7 ) 提出，1 9 8 3 年 c h a n e y i i o 提出利用超富集植物清除土壤重金属污染的思想。超富集植物是能够 超量吸收土壤中重金属并将其转运到地上部的植物，一般认为超富集植物富集重 金属能力超过一般植物1 0 0 倍【l 。超富集植物至少应同时具有2 个基本特征：其 一是目前广泛采用的参考数值对比，即植物地上部( 主要是茎或叶) 干物质中重 金属的临界含量为1 0 0 或1 0 0 0 或1 0 0 0 0 m g k g ( 具体见表1 1 ) 。；其二是转移特征， 即植物地上部重金属含量大于其根部重金属含量【l2 1 。有学者认为超富集植物还 应具有耐性特征和富集系数特征。耐性特征是指重金属胁迫下植物地上部生物量 与对照相比没有下降；富集系数特征是指植物地上部富集系数大于1 u 3 1 。 中南大学硕士学位论文 第1 章绪论 世界上已报道的超富集植物超过5 0 0 种，广泛分布于植物界的5 0 余科，以n i 的超富集植物最多，主要发现于非洲砂坝哈铜矿地区，但有人认为c u 矛n c o 的含 量是因为大气中重金属颗粒吸附到叶片表面所致，而并非从根系吸收而获得i l 训。 近年来z n 、c d 、p b 的超富集植物有增加趋势，分别达至1 j 2 4 、1 4 和1 4 种，能同时 超富集两种或以上重金属的达至l j l 4 种。从科的分布看，以十字花科植物为主，尤 其遏蓝菜属t h l a s p i 种类占优势；按地域分布来看，以欧洲的种类最多。目前，我 国发现的超积累植物总数量相当稀少，己报道的超积累植物主要有：c u 一鸭拓草 【1 5 】；a s 蜈蚣草【8 1 ：z n 东南景天【1 6 】；m n 垂序商陆【1 7 】；p b ，z n 断续菊、圆锥南 芥等【1 8 】。这与我国丰富的植被资源很不相称。究其原因一方面可能与超积累植 物较强的区域分布性有关；另一方面，也可能和我国在超积累植物方面的研究起 步较晚有关。 1 2 3 锰超富集植物 截止至今，国际上报道的锰超积累植物仅1 4 种，分布在夹竹桃科、卫矛科、 藤黄科、桃金娘科、山龙眼科、商陆科、蓼科，多数是生长在亚热带地区的木本 中南大学硕士学位论文 第1 章绪论 植物【1 9 】。j a f f r e 等发现生长在新喀里多尼亚超碱性土壤上的6 种植物m y x i a r u b r i c a u l i s ( r b r ) g u i l l 、m a y t e n u sb u r e a v i a n a ( l o e s ) l o e s 、ms e b e r t i a n a ( l o e s ) l o e s 、mp a n c h e r i a n a 、m a c a d a m i a a n g u s t i f o l i av i r o t 、膨n e u r o p h y l l a ( g u i l l ) v i r o t 平均锰含量超过1 00 0 0m g k g _ 1 2 0 j ；b i d w e l l 等在昆士兰州发现的澳大利亚原生锰 超富集植物a u s t r o m y r t u sb i d w i l l i i 叶锰含量高达1 92 0 0m g k g 。1 【2 1 】；p r o c t o r 等在马 来西亚s a b a h ) i i l 发现的蒲桃属植物e u g e n i as p 等。它们主要是生长在亚热带地区 的木本植物，多数种类来 刍n e wc a l e d o n i a 的超碱性土壤【2 2 1 。 目前，锰超富集植物的研究在国内已经开始受到关注，有关学者已开展了一 些很有价值的研究工作。国内已经发现并研究较多的锰超富集植物主要有2 种， 分别为垂序商陆和水蓼瞳。垂序商陆自然条件下叶锰含量高达1 93 0 0 m g & g d w ，温室培养条件下可达3 63 8 0m g l ( g d w 。研究表明，生长在土壤锰含 最为2 0 0 0m g & g 的水蓼，叶、根和茎在1 50 0 0 t m o l l 。1 锰供应水平下锰含量分别 为2 44 5 0m g k g 、1 1 5 7 0m g 。k g 1 和1 03 4 0m g k g 一，转移系数达到1 3 7 。 1 2 4 锰超富集机制 一般植物体锰的含量约为2 0 5 0 0m g l ( g d w ，而研究发现的锰超积累植物可 以吸收并超富集锰，重金属含量可以达到l ( 干重) 以上【2 5 。2 7 1 。植物体富集大量 的锰却不发生毒害效应，表明植物体内存在特别的锰超积累机制：( 1 ) 可以将锰 准确运输至所需靶器官正常利用；( 2 ) 可以有效地应对过量的锰，或将其钝化、 失活，或将其区隔化储存，使其不具有植物毒性，或消除过量的锰所引起的毒性 效应。 目前，关于植物的锰耐性机理研究较少，目前主要是通过对其它重金属的研 究探索，尝试探索植物在锰毒与其它金属毒害共通的耐受机制【2 8 1 。一直以来， 研究人员尝试利用详细研究锰在植物体内的分布、累积，迁移、化学形态及相关 生理指标的变化，从而探索出植物的锰耐性和锰解毒机制【2 ”9 1 。在分子和细胞水 平研究上，部分涉及锰耐性与超积累植物基因片段及其作用机理研究取得了一定 的成果【2 6 , 4 0 。结合锰富集机制方面已有的研究成果，在此从植物组织器官水平到 细胞分子水平详细论述植物对锰的超积累机制 1 2 4 1 组织器官水平 m n 2 + 是植物锰吸收的主要形式，少数锰的络合物也可以被植物吸收。锰主要 通过植物体根系吸收进入根表皮和皮层细胞。土壤溶液中i 拘m n 2 + 极其容易进入表 皮和皮层细胞的非原生质体空间，参与细胞壁表面e 一的离子交换。经过共质体运 输作用，锰进入细胞的细胞质，进而引起一些生理反应【1 5 】。然而，植物体不同 中南大学硕士学位论文 第1 章绪论 组织细胞对锰的响应机制存在差异，且不同组织器官内的锰含量与锰的形态存在 联系。因此，锰在植物体内组织器官的差异分布可能也是一种锰超富集的生物学 机制。 研究表明【3 3 1 ，韧皮部中锰的含量明显大于其在木质部中的含量。锰在木质 部中为自由的离子形态，而在韧皮部中主要为稳定的络合物。锰的这种形态差异 分布，可以有效的降低其运输效率，进而减少对植物体地上茎叶的毒害。研究表 明，锰在植物根部的富集主要是在韧皮部。另外，x u 等发现，锰在垂序商陆叶 表皮结构中的含量要远高于其他组织【2 8 , 3 4 ，这与f e m a n d o 对锰富集植物叶片锰分 布的p i x e e d a x 检测结果锰主要是在叶肉栅栏组织中积累是相一致的【3 0 川。 1 2 4 2 细胞水平 植物细胞对锰的超富集主要表现在：植物对锰的适量使用；将过量的锰 胁迫消除【4 卜4 引，其主要机制包括：区室化作用，螯合作用，抗氧化系统保护等。 ( 1 ) 区室化作用 区室化作用是目前重金属超富集植物研究中关注的热点问题。植物通过将金 属离子转运和贮存在特定的组织器官或细胞的特定区域，从而降低代谢活性区 域的重金属离子浓度，减轻重金属离子对植物靶器官毒害的作用即区室化作用， 是超富集植物保持重金属强耐性和富集能力的主要机制。区域化分布一般分为： 细胞水平区域化；亚细胞水平区域化。相关研究【4 5 , 4 6 】表明，液泡和质外体区 室化是植物对重金属超富集与解毒的重要机制。一般认为，锰在组织细胞中的区 室化作用钝化细胞中的锰，降低其对植物组织和细胞的毒害，体现了植物对锰的 超富集能力。已有研究【l7 j 表明，锰在垂序商陆液泡中快速大量富集，而这一现 象恰好解释了扩展中的新生组织具有较强的锰耐性。不少研究发现【2 3 , 3 6 , 4 7 - 4 9 1 ，除 了液泡以外，植物细胞壁、内质网及高尔基复合体也是锰的富集细胞器。目前， 区室化分布已经在多种超富集植物中发现，这一机理是否可以推广到其它超富集 植物，还有待科研工作人员的进一步探索研究。 ( 2 ) 螯合作用 超富集植物能够超量吸收富集重金属而未表现出明显的中毒症状的另一重 要机制就是产生能与重金属络合的特定配位物质，一方面可以形成较为稳定的金 属螯合物以降低重金属毒性，另一方面，可以通过影响植物对重金属的吸收和转 运效率来降低重金属对植物体的毒性伤害。目前研究较多特定配位物质主要包 含：巯基的金属硫蛋白m t ；植物螫合肽p c s ：氨基酸类；有机酸类( 如 苹果酸、柠檬酸、丙二酸、琥珀酸、草酸等) 。对于植物对m n 的螯合机制，已 有研究主要集中在有机酸螫合方面。m e m o n 等l4 8 4 9 j 提出，苹果酸可能是m n 在细 中南大学硕士学位论文 第l 章绪论 胞质和液泡之间的穿梭载体，在m n 进入液泡后，草酸将与苹果酸上的m n 螯合， 使m n 富集稳定在液泡中。h o r s t 等的研究发现，锰耐受型豇豆叶片液泡中富集的 m n 以有机酸( 苹果酸、柠檬酸、琥珀酸、戊二酸、延胡索酸和草酸) 的稳定复 合物的形态存在，且有机酸含量随m n 处理浓度的增加而升耐5 0 】。x u 等【5 1 】通过化 学提取、色谱分析和扫描电镜能谱结合分析，证明了草酸与m n 络合的可能性， 并进一步利用中科院高能所上海同步辐射e x a f s 实验证实草酸锰是垂序商陆叶 片中m n 的主要存在形态。上述研究说明锰超富集植物主要是通过螯合作用，即 形成可溶性锰有机酸盐并将其富集在液泡等部位实现对m n 的解毒。 ( 3 ) 抗氧化系统的保护作用 锰是植物体生长发育所必需的微量元素之一，直接参与了植物光合作用中的 电子传递，并是许多重要代谢途径关键酶( 如超氧化物歧化酶( s o d ) ) 的辅助因 子和活化剂，对维持叶绿体等细胞器的正常结构有重要作用1 4 6 1 。锰是变价金属 元素，高锰外部条件将诱导植物产生氧化胁迫，引起植物体产生大量的活性氧自 由基，而大量的活性氧自由基对植物将会对植物器官和组织造成损害【4 6 】因此， 植物抗氧化系统的保护作用是植物对锰的耐性的重要因素，可以清除细胞内在锰 外部条件下诱导产生的氧自由基，保护植物细胞免受氧化胁迫的伤害。国内外大 量研究表明，高锰外部条件将改变植物体内的抗氧化保护酶的活性及抗氧化剂的 含量。如高锰条件下，菜豆体内超氧化物歧化酶( s o d ) 和抗坏血酸过氧化物酶的 活性上升，抗坏血酸含量下降哺；黄瓜根系细胞内丙二醛( m d a ) 含量上升， m n s o d 、f e s o d 和过氧化物酶等活性增强，而过氧化氢酶活性下斛5 2 】：豇 豆叶片质外体过氧化物氧化酶、过氧化物酶等活性显着上升【5 3 , 5 4 】。其中，抗氧化 系统的自我调节是植物体响应逆境胁迫中普遍存在的一种适应机制。在高锰条件 下，超富集植物能够通过提高s o d 活性来减轻锰带来的氧自由基对细胞的损伤。 m n s o d 是植物三种类型s o d 酶中最重要的。逆境条件下锰诱导植物体提高 m n s o d 活性是抵制氧化胁迫所产生的毒害重要机制之一【5 1 1 。同时，植物体分泌 的部分抗氧化物质，如谷胱甘肽、抗坏血酸等，也是植物抗氧化保护系统的重要 组成物质。研究表明1 55 5 6 】，谷胱甘肽和抗坏血酸将形成氧化还原缓冲体系保护 植物膜系统。 1 2 4 3 分子水平 目前，有关在分子水平上对超富集植物吸收重金属机理的探索研究较少，尤 其是在超富集植物对重金属吸收、转运、耐性和富集的生理生化机制研究方面进 展缓慢，阻碍了转基因超积累植物的应用研究。伴随着分子生物学的发展，采用 分子生物学手段调控植物对重金属的耐性和富集能力，研究出生长迅速、生物量 中南大学硕士学位论文第1 章绪论 大和可富集多种重金属的超富集植物，也将是植物修复重要研究方向【5 ”。如， 利用汞离子还原酶基因( m e r a p e 9 ，m e r a l 8 ) 提高汞抗性和植物萃取能力1 5 引，通过 m t s 基因( h m t i ，m e i a ，m t - i ，p s m t a ，c u p l 等) 加强植物对镉的忍耐1 5 ，通过f e ( r i ) 还原酶基因( f r 0 2 ，f r e l ，f r e 2 ) 增强植物对铁的富集 5 9 1 。目前有关植物重金属 耐性和超富集的研究主要集中在少量超积累植物，还有大量超富集植物有待进一 步研究。近年来，植物体内钙、铁、锌和铜等离子通道或转运蛋白的确定，表明 植物细胞锰转运的分子机制是进一步探索植物锰耐受机理的重要组成。 i 3 研究目的 植物修复技术因其成本低廉、环境友好、可回收有价金属等优点成为目前国 际上的研究热点，而植物修复成功的关键在于：( 1 ) 超富集植物种质资源的收集； ( 2 ) 植物对重金属的吸收转运机理研究；( 3 ) 植物对重金属耐性和超富集机制研 究。目前，我国科研工作人员在植物修复方面做了大量工作，筛选并发现了a s 、 z n 、c d 、m n 、c r 的超富集植物。但是相对国际研究工作者的发现，我国目前可 供选择用来进行植物修复的超富集植物资源相对缺乏。因此，对超富集植物的筛 选和对植物重金属耐性和超富集机理研究将是未来很长一段时间内的热点课题。 本论文以筛选出的一种新的m n 超富集植物杠板归为研究对象，通过温室培 养，借助于电感耦合等离子体发射光谱仪、傅里叶红外光谱分析仪、透射电子显 微镜、能谱分析仪和植物显微技术，研究不同锰处理条件下杠板归的锰富集特性、 锰对植物生长的影响、杠板归化学组分的变化、杠板归不同组织细胞和细胞器的 变化、锰在植物亚细胞水平的可能积聚方式等，探讨杠板归的锰超富集机制，以 期为锰污染土壤的植物修复等提供理论据和实践参考。 1 4 研究内容 本实验拟选择蓼科植物的杠板归( p o l y g o n u mp e r f o l i a t u m ) 为研究对象，采 用温室营养液培养法，利用电感耦合等离子体发射光谱分析技术、傅里叶红外光 谱分析技术和透射电子显微镜和能谱结合技术研究杠板归的锰富集特性，从器 官、组织、细胞等不同水平研究杠板归对锰胁迫的生理响应。研究内容包括：( 1 ) 杠板归的锰锰富集特性研究；( 2 ) 杠板归锰耐性的f t i r 分析研究；( 3 ) 杠板归锰 富集的的生理响应。 根据前期研究成果，在湖南湘潭锰尾矿废弃地于果实成熟季节收集杠板归种 子。( 1 ) 通过温室实验方法，研究杠板归在不同锰处理条件下( 5 、2 0 0 、5 0 0 、1 0 0 0 、 2 0 0 0 、5 0 0 0 、1 0 0 0 0 、1 5 0 0 0i ，t m o l l 。) 的生长情况，并用电感耦合等离子发射光谱 中南大学硕士学位论文第1 章绪论 仪( i c p o e s ) n 定不同组织器官的锰含量及其它元素含量，分析不同组织器官的 锰积累与分布规律；( 2 ) 矛w j 用傅里叶红外光谱分析仪，研究不同锰处理条件下杠 板归不同组织器官化学组成上的差异，揭示杠板归的锰耐性机制；( 3 ) 采用透射 电镜技术研究不同锰处理浓度条件下，杠板归细胞和细胞器对锰胁迫的生理响 应，借助能谱分析仪研究锰在杠板归亚细胞内的可能的积聚位点。 1 5 技术路线 以新发现的蓼科植物杠板归为研究对象，通过温室培养法，研究其在模拟条 件下的锰耐性和富集特性，利用傅罩叶红外光谱分析技术、透射电镜技术和能谱 分析技术研究杠板归可能的锰超富集机制。技术路线见图1 1 ： 杠板归种子采集 杠板归锰吸收特性研究 图卜1 技术路线 中南大学硕士学位论文第二章杠板归的锰吸收和富集特征 第二章杠板归的锰富集特性研究 植物修复技术因其成本低廉、环境友好、可回收有价金属等优点成为目前国 际环境科学的研究热点，而植物修复成功的关键在于：( 1 ) 超富集植物种质资源 的收集；( 2 ) 植物对重金属的吸收转运机理研究；( 3 ) 植物对重金属耐性和超富 集机制研究。目前，我国科研工作人员在植物修复方面做了大量工作，筛选并发 现了a s 、z n 、c d 、m n 、c r 的超富集植物。但是相对国际研究工作者的发现， 我国目前可供选择用来进行植物修复的超富集植物资源相对缺乏。因此，超富集 植物的筛选和植物重金属耐性和超富集机理研究将是未来很长一段时间内的热 点课题。 为了验证蓼科植物杠板归的锰富集特性并筛选新的锰超富集植物种质资源， 通过对野外调查并结合温室营养液培养试验，研究杠板归( p o l y g o n u m p e r f o l i a t u ml ) 在不同锰供应条件下的生长状况，考察其锰富集特性和矿质元 素的吸收，并对其锰累积进行研究。 2 1 材料和方法 2 1 1 研究材料 实验植物为杠板归( 图2 1 ) ，种子采自湖南省湘潭锰尾矿废弃地。多年生蓼 生草本。茎有棱，红褐色，有倒生钩刺。叶互生，盾状着生；叶片近三角形，长 4 6 c m ，宽5 - 8c m ，先端尖，基部近心形或截形，下面沿脉疏生钩刺：托叶鞘 近圆形，抱茎；叶柄长，疏生倒钩刺。花序短穗状；苞片圆形；花被5 深裂，淡 红色或白色，结果时增大，肉质，变为深蓝色：雄蕊8 ；花柱3 裂。瘦果球形， 包于蓝色多汁的花被内。花期6 8 月，果期9 - - - , 1 0 月。 中南大学硕士学位论文 第二章杠板归的锰吸收和富集特征 2 1 2 温室培养 图2 - 1生长在湘潭锰尾矿废弃地的杠板归 在人工温室内控制植物生长环境( 1 4 h 光照，2 5 。c 白天2 0 晚上，相对湿度 ( 7 0 一7 5 ) ，采用h o a g l a n d 营养液( 表2 1 ) 培养m j ，完全营养液组分见表2 1 。将 采集到的杠板归成熟种子经冷冻及浓h 2 s 0 4 浸泡等预处理后播种于湿的灭菌沙 土中，待萌发将幼苗移入0 2 5h o a g l a n d 营养液预培养1 5 天，长至3 片叶时选择 生长一致的幼苗开始m n 重金属h o a g l a n d 营养液处理。其中m n 以m n c l 2 4 h e o 的形式加入，依次设置5 ( c k ) 、5 0 0 、1 0 0 0 、2 0 0 0 、5 0 0 0 、1 0 0 0 0 和1 5 0 0 0 9 m 0 1 l 1 7 种m n 浓度梯度，每种处理设至少3 个重复。每天用0 1m 0 1 l jn a o h 或0 1 m o l l 。1h c i 调节p h 值，使其稳定在4 5 左右，以维持营养液中m n 主要以植物 有效态的m _ 1