（法医学专业论文）三个str基因座荧光标记复合扩增的研究及其法医学应用.pdf

四川大学硕士论文刘志勇中文摘要 中文摘要 三个s t r 基因座荧光标记复合扩增的研究及其法医学应用 研究生：刘志勇 导师：陈国弟副教授 四川大学华西基础医学与法医学院成都( 6 1 0 0 4 1 ) 【摘要】目的本课题旨在寻找新的有应用价值的s t r 基因座，并建立 d 1 2 s 1 0 6 4 、g a t a l 4 0 e 0 3 、d 1 8 s 5 3 6 基因座的荧光标记复合扩增体系按 照美国d n a 分析方法技术工作组( t 霄g d a l o 的指导方案，进行了法医学应 用性研究。方法首先对5 个新的s t r 基因座，即d 9 s i l l 9 、d 1 2 s 1 0 6 4 、 d 1 8 s 5 3 6 、g a t a l 5 6 d i l 和g a t a l 4 0 e 0 3 ，进行群体遗传学研究。从中获得 三个多态性好、个人识别机率高的三个基因座，即d 1 2 s 1 0 6 4 、g a t a l 4 0 e 0 3 、 d 1 8 s 5 3 6 ，利用传统的复合扩增的方法，用美国a b i 一3 l o 毛细管电泳仪进 行荧光标记复合扩增的研究。并对复合扩增系统的灵敏度和准确度，基 因座的种属特异性，不同退火温度下复合扩增的效果等进行了重复性研 究。结果获得了5 个s t r 基因座的基因频率、个人识别率、非父排除率 等法医鉴定中所需要的遗传学数据；成功建立了d 1 2 s 1 0 6 4 、6 a t a l 4 0 e 0 3 ， 四川大学硕士论文刘志勇中文摘要 d 1 8 s 5 3 6 的荧光标记复合扩增体系。而且，这一扩增体系条件易于优化， 采用国产t a q 酶不需热启动进行扩增，即可得到满意的扩增产物和分型 结果。因此相对于国外昂贵的试剂盒，它是一种成本低廉但效率高的s t r 基因座复合扩增体系法医学应用性研究表明，该体系的检测灵敏度为 2 n g 模板d n a ，而且三个基因座有较高的种属特异性。通过8 个实际检案 证明，该体系能用于法医学个人识别和亲权鉴定结论d 1 2 s 1 0 6 4 、 g a t a l 4 0 e 0 3 、d 1 8 s 5 3 6 的荧光标记复合扩增体系可应用a b i 一3 1 0 检测平 台，获得可靠的遗传学数据。法医学应用研究证明，该体系扩增条件易 于优化、成本低廉、分型结果稳定，灵敏度和准确度高，种属特异性好， 可以应用于法医学实际检案。 【关键词】法医学d n a 分型短串联重复序列聚合酶链式反应 复合扩增毛细管电泳群体遗传学 2 坚型! 里竺坚垫! ! 塑竺坐塑! ! 坠! 垫垫塑! 些墅型垫丝竺坚 s t u d yo ft h r e es t rl o c if l u o r e s c e n tm u l t i p l e xp c r a m p l i f i c a t i o ns y s t e ma n di t sa p p l i c a t i o ni nf o r e n s i c g e n e t i c s g r a d u a t e ：z h i y o n gl i n a d v i s o r ：g u o d ic h e n , a s s o c i a t ep r o f e s s o r w e s tc h i n ac o i e g eo fp r e d n i c a la n df o r e n s i cm e d i c i n e , s i c h u a nu n i v e r s i t y , c h e n g d n ，6 1 0 0 4 1 ，只r c h i n a a b s t r a c t o b j e c t i v en ep u r p o s eo ft h i sp r o j e c ti st of l n dn c w s t rl o c u su s e f u la n da p p l i c a b l ei nf o r e n s i cg e n e t i c s ，t oe s t a b l i s ht h e f l u o r e s c e n tm u l t i p l e xs t rs y s t e mo fd 1 2 s 1 0 6 4 ，g a t a l 4 0 e 0 3a n d d 1 8 s 5 3 6 a c c o r d i n gt ot h eg u i d e l i n e so ft m g d a m i nu n i t e ds t a t e s , w ea l s ov a l i d a t et h ef o r e n s i ca p p l i c a t i o no ft h i sm u l t i p l e xs y s t e m m e t h o d sf i r s t , w eu n d e r t a k et h ep o p u l a t i o ng e n e t i cr e s e a r c ho ff i v e s t rl o c i , d 9 s 1 1 1 9 ，d 1 2 s 1 0 “，d 1 8 s 5 3 6 , g 筒r a l 5 6 d 1 1 ，a n d 3 g a t a l 4 0 嘞3 s e c o n d , w e s e l e c tt h r e e l o c i , d 1 2 s 1 0 6 4 ， g a t a l 4 0 e 0 3a n dd 1 8 s 5 3 6 , w i t hg o o dp o l y m o r p h i s m sa n dh i g h d i s c r i m i n a t ep r o b a b i l i t y , a n db e g i nt h er e s e a r c ho ft h i sf l u o r e s c e n t m u l t i p l e xs y s t e mu s i n gt h et r a d i t i o n a lm u l t i p l e xm e t h o d s 弧w e d e t e c tt h es e n s i t i v i t y , a c c u r a c y , 删髂s p e c i f i c i t y , a n dd i f f e r e n tp c r o u t c o m eu n d e re a c ha n n e a lt e m p e r a t u r e r e s u l t sw eo b t a i nt h e g e n e t i cp a r a m e t e r u s e di nf o r e n s i ci d e n t i f i c a t i o ns u c ha sg e n e f r e q u e n c y , d i s c r i m i n a t i o np r o b a b i l i t y , p r o b a b i l i t yo fe x c l u s i o n , o f t h e s ef i v es t rl o c i ；s u c c e s s f u l l ye s t a b l i s ht h ef l u o r e s c e n tm u l t i p l e x s y s t e mo fd 1 2 s 1 0 6 4 ，g a t a l 4 0 e 0 3a n dd 1 8 s 5 3 6 m o r e o v e r , i ti s e a s yt ou s e t h i sm u l 虹p l e xs y s t e ma n dd o e s n tn e e dt h eh o ts t a r to f p c r w ec a ng e tt h es a t i s f i e da n a l y t i cr e s u l to n l yu s i n gt h el o c a lt a q p o l y m e r a s e t h e r e f o r e , c o m p a r e dw i t ht h ee x p e n s i v ef o r e i g nl 【j li t i s ac h e a pm u l t i p l e xs y s t e mb u tw i t hh i g he f f i c i e n c y i ts h o w st h a tt h e s a m p l es e n s i t i v i t yo ft h i ss y s t e mi s2 n gt e m p l a t ed n a , a n di 协s p 。d 髂 s p e c i f i c i t yi sg o o d w ea l s ou t i l i z ee i g h td n as a m p l et e s te , a s c si n d e p a r t m e n to ff o r e n s i cg e n e t i c s , t ow o v e i t sa p p l i c a t i o ni nf o r e n s i c i n d i v i d u a li d e n t i f i c a t i o na n d p a t e r n i t y t e s t c o n c l u s i o n st h i s m u l t i p l e xs y s t e mc a nb es u c c e s s f u l l yu s e di nt h ea b i - 3 1 0d e t e c t i o n p l a t f o r mt og e t t h er e l i a b l e g e n e t i cd a t a t h ef o r e n s i cg e n e t i c s r e s e a r c hi m p l i e st h a ti ti sa ne a s i l y - r e g u l a t e d , l o wc o s tm u l t i p l e x s y s t e mw i t hs t a b l eo u t c o m e , h i g hs e n s i t i v i t ya n da c c u r a c y , g o o d s p e c i e ss p e c i f i c i t y b a s e d o nt h ea b o v ea d v a n t a g e s ，i tc o u l db e r e c o m m e n d e dt ot h ef o r e n s i cg e n e t i c sp r a c t i c e t k e yw o r d s f o r e n s i cm e d i c i n e ，d n at y p e , s h o r tt a n d e mr e p e a t , p c r , f l u o r e s c e n tm u l t i p l e xa m p l i f i c a t i o n , a b i - 3 1 0 , p o p u l a t i o n g e n e t i c s 5 d 1 8 s 5 3 6 、d 1 2 s 1 0 6 4 、g a t a l 4 0 e 0 3 基因座荧光标记复合扩增检 测及其法医学应用 前言 复合扩增( m u l t i p l e xp c r ) 又称多重p c r ，即在一个反应体系中同 时扩增两个或两个以上的基因座。这样的扩增方法能节约试剂、时间和 样本，同时也减少了污染的可能性复合扩增技术的特点有：高效性； 系统性；经济简便性。在法医学领域，要求在尽量短的时间内对多 个遗传标志作出分析结果。如果碰到微量检材的案子，复合扩增技术更 是显示出无法代替的重要性 本课题旨在应用传统的复合扩增的方法，建立新的s t r 荧光复合扩 增体系用群体遗传学的方法调查五个新的$ t r 基因座在中国汉族人群 中的分布特征，挑选出三个多态性分布好、个人识别能力高的基因座。 用荧光标记的引物同时扩增这三个s t r 基因座，在a b i 一3 1 0 毛细管电泳 仪上进行结果的检测、分析最后，按照美国d n a 分析方法技术工作组 ( t 胃g d a i j ) 的指导方案，对荧光标记复合系统进行灵敏度和准确度，基因 座的种属特异性，不同退火温度下复合扩增的效果等进行了重复性研究。 6 四川大学硕士论文刘志勇 第一部分 五个常染色体s t r 基因座多态性研究 短串联重复序列( s h o r tt a n d e mr e p e a t ，s t r ) 是群体遗传学和法医 学实践中上非常有用的遗传标记。虽然最近几年伴随着生命科学的迅猛 发展，已经发现大量的其他遗传标记如s n p 等，但是，正如美国n u ( n a t i o n a li n s t i t u t eo fj u s t i c e ) 预言，在法医学领域，s t r 的主导 地位短期内还不可能被其他遗传标记所取代，原因就是目前世界各个国 家已经建立了庞大的s t r 数据库近年来，国内外学者陆续报道了一些 新的可供法医学鉴定采用的s t r 遗传标记“，但有的基因座缺少中国汉 族的群体遗传数据为了了解中国汉族人群中5 个新的s t r 基因座 d 9 s l l l 9 、d 1 2 s 1 0 6 4 、d 1 8 s 5 3 6 、g a t a l 5 6 d 1 l 和g a t a l 4 0 e 0 3 的遗传学数 据。在本课题中，我们分析了这五个常染色体s t r 基因座的等位基因序 列，并根据国际法医血液遗传学会( i n t e r n a t i o n a ls o c i e t yo ff o r e n s i c h a e m o g e n e t i c s 。i s f h ) 推荐的命名原则埘，对这些s t r 基因座的等位基 因进行命名；并调查这些基因座在成都汉族群体的等位基因频率，为提 高常染色体遗传标记的个人识别能力和非父排除能力提供更多的选择。 1 材料与方法 1 1 材料 1 1 1 群体样本 取自成都地区汉族1 0 0 份无血缘关系个体的血样本，e d t a 抗凝。 1 1 2 试剂 7 第一部分五个常染色体s t r 基因座多态性研究 五个基因座均查自c h i c ( 惭c h l e o r g ) 数据库所有引物均由上 海i n v i t r o g e n 公司合成。各基因座名称和引物序列见表卜i 。 表卜15 个常染色体s t r 基因座的基本参数 基因座引物序列 d 9 s 1 l1 9f ： 1 1 - t c g g c c c r 1 1 _ r c t ( ) c r ：娲c 喀虬 c h 峨弧吼啦 d 1 2 s 1 0 6 4f ： c t c t o c 6 g n l 姒6 0 c r ： t r 弼 a 盯r c c 1 - r g c r c ( = c d 1 8 s 5 3 6f ：删t c c i 脚 6 t o 口c r g r ：c a c a g l l b t g l b a ( ；0 g 1 g a t a l 5 6 d 1 1f ： 觥t c c t t g t g 6 1 - r 6 g r ：c ；g g a c t c a g g a g a g g a a t g t g a l a 1 4 0 e 0 3f ：a a g a t g g g 僦 t r r ： c a ( = c a c g g c i t c c a t g t t a q 酶( 申能博采，中国) 、d n t p ( p h a r m a c i a ，瑞典) 、p r o t e a s e k ( p h a r m a c i a ，瑞典) 、丙烯酰胺( 分析纯，国产) 、甲叉双丙烯酰胺( f l u k a ， 瑞士) 、t r i s ( p h a r m a c i a ，瑞典) 、硼酸( 分析纯，国产) 、碳酸钠( 分 析纯，国产) 、硝酸银( 分析纯，国产) 、e d t a ( 分析纯，国产) ；其余试 剂均为国产分析纯 1 1 3 仪器 p e 9 6 0 0 扩增仪( a b i 公司，美国) 、高速离心机( e p p e n d o r f 公司， 德国) 、多功能电泳仪( p h a r m a c i a ，瑞典) 、可调移液器( e p p e n d o r f 公 司，德国) 、垂直电泳槽( 北京六一仪器厂) 、恒温摇床、烤箱、水浴箱 等。 1 2 方法 8 四川大学硕士论文刘志勇 1 2 1 蹦a 提取 采用c h e l e x 一1 0 0 法提取d n a m ( 参见附录1 ) 。 1 2 2p c r 扩增 p c r 反应体系为2 0 l ll ，其中含有每种引物0 5um 0 1 l - ，l o x p c r 缓 冲液2 1 1 1 ，1 5m m 0 1 l 4u g c l2 2 0ut a q 聚合酶，2 0 0l l m 0 1 l - ld n t p ， 模板d n a 约2 0n g 。采用p e9 6 0 0 型热循环仪( 总循环周期为3 0 次，最 后7 2 延伸1 0m i n ) 各基因座p c r 反应条件见表1 - 2 。 表l _ 25 个常染色体s t r 基因座的扩增条件 1 2 3p c r 产物的检测与分型 所有基因座的p c r 产物用非变性聚丙烯酰胺凝胶连续缓冲系统垂直 电泳检测；银染法显色阿( 参见附录2 、3 ) 各个基因座通过与各自的等 位基因分型标准物比对来进行分型 1 2 4 等位基因分型标准物的制备 本实验等位基因分型标准物在本实验室构建，具体方法如下首先 从电泳、染色后的聚丙烯酰胺凝胶上取出不同的等位基因的片段( 取纯合 子) ，然后放入0 5 m le p 管中，加入1 0 0g l 纯水；在3 7 1 2 条件下间歇 9 第一部分 五个常染色体s t r 摹因座多卷性研究 振荡4 8 h ；将浸泡液中的d n a 作为模板d n a ，按照各个基因座的p c r 反应 条件扩增，各基因型扩增产物等比例混合后即可作为分子量标准物，在 电泳过程中与不同个体的d n a 扩增产物同步电泳。 1 2 5 等位基因的测序 每个s t r 基因座选择一个等位基因片段的扩增产物，送上海 i n v i t r o g e n 公司测序，分析各个s t r 基因座的结构特征。 1 2 6 等位基因的命名 根据测序结果，所有基因座的等位基因命名按照i s f h 推荐的命名原 则进行命名嘲 1 2 7 数据分析 采用p r o m e g a 公司的法医学统计软件p o w e r s t a t s 计算基因频率、杂 合度( h ) 、个人识别机率( p d ) 、非父排除率( p e ) 采用h w e 统计学 软件进行h a r d y - w e i n b e r g 平衡检验脚。 2 结果 2 1 等位基因测序结果 送测的目的等位基因片段纯化用a b i 自动测序仪器进行d n a 序列测 定。图2 - 1 、2 - 2 ，2 - 3 、2 - 4 、2 - 5 为各个基因座的d n a 测序图。 图2 - 1d 9 s i l l 9 的测序图显示重复序列为g a t a 1 0 四川大学硕士论文 刘志勇 图2 - 2d 1 2 s 1 0 6 4 的测序图显示重复序列为a t a g 图2 - 3d 1 8 s 5 3 6 的测序图显示重复序列为g a t a 图2 - 4g a t a l 4 0 e 0 3 的测序图显示重复序列为a g a t 图2 巧g a t a l 5 6 d l l 的测序图显示重复序列为g a t a 2 2 等位基因标准物的制备图 五个基因座的等位基因分子量标准物用前述方法构建。图2 - 6 为例， g a t a l 5 6 d l l 的标准物制备电泳图。 第一部分五个常染色体s t r 基因座多态性研究 图2 - 6g a t a l 5 6 d ii 的等位基因标准物制备图 1 ，8 为等位基因标准物：8 - 1 3 ；2 ：8 咱；3 ：9 _ 9 ；4 ；1 0 - 1 0 , , 5 ：i i l l ； 6 ：1 2 - 1 2 ：7 ：1 3 - 1 3 。 2 3 电泳分型结果 以d 9 s i l l 9 、d 1 8 s 5 3 6 、g a t a l 4 0 e 0 3 为例，图2 - 7 、2 - 8 、2 - 9 是p a g 电泳分型结果。 图2 - 7d 9 s 1 1 1 9 的电泳分型结果 泳道7 ：等位基因标准物1 0 1 6 ：泳道1 ：1 1 - 1 3 ；泳道2 ：1 4 - 1 5 ；泳道3 ： 1 4 - 1 6 ：泳道4 ：1 1 - 1 5 ；泳道5 ：1 5 - 1 5 ：泳道6 ：1 5 - 1 6 ；泳道8 ：1 2 一1 5 图2 8d 1 8 s 5 3 6 的电泳分型结果 泳道3 ：等位基因标准物8 - 1 4 ：泳道l ：9 - 1 3 ；泳道2 ：1 3 - 1 4 ；泳道4 ：1 2 - 1 4 泳道5 ：1 1 - 1 2 ：泳道6 ：1 4 - 1 4 ；泳道7 ：1 0 - i i ：泳道8 ：1 3 - 1 4 ；泳道9 ： 1 2 - 1 3 1 2 四川大学硕士论文刘志勇 图2 - 9g a t a l 4 0 e 0 3 的电泳分型结果 泳道2 ：等位基因标准物1 1 - 1 6 ；泳道1 ：1 5 - 1 6 ；泳道3 ：1 2 - 1 6 ：泳道4 ：1 1 - 1 1 ： 泳道5 ：1 2 - 1 6 ：泳道6 ：1 5 - 1 6 ；泳道7 ：1 3 - 1 5 ：泳道8 ：1 2 - 1 3 ：泳道9 ：1 3 - 1 4 。 2 4 群体遗传学数据 5 个常染色体s t r 基因座的等位基因频率、基因型分布以及 h a r d y - w e i n b e r g 平衡检验( h w e ) 等结果见表2 - 1 、2 - 2 、2 - 3 。 表2 - 1 成都汉族群体i ) 9 s 1 1 1 9 、d 1 8 s 5 3 6 、6 a t a l 5 6 d l l 等位基因频率 1 3 第一部分五个常染色体s t r 基因座多态性研究 表2 - 2 成都汉族群体d 1 2 s 1 0 6 4 、6 a t 1 0 4 e 0 3 等位基因频率 d 1 2 s 1 0 6 4 g a t a l 0 4 e 0 3 基因频率基因频率 表2 - 3 成都汉族群体d 1 2 s 1 0 6 4 的基因型分布( 举例) 等位基因 l o1 11 21 3 1 41 51 61 71 8 3 36 n 1 39 361 5 222 1 l 1 1 4 m n 屹n h 垢埔 掩 四川大学硕士论文刘志勇 2 5s t r 基因座的法医遗传学参数 根据群体调查结果，求得各基因座的法医遗传学各参数值，见表2 - 4 。 表2 - 45 个s t r 基因座的法医遗传学参数 p i c ：多态信息总量；d p ：个人识别能力；p 噩：匹配概率；e p ：非父捧除率； h o ：观察杂合度；h e ：期望杂合度 3 讨论 人类短串连重复序列( s h o r tt a n d e mr e p e a t ，s t r ) 是由2 6 b p 的重复 单位构成的微卫星d n a 位点；是继限制性片段长度多态性( r f l p s ) 之后的 第二代遗传学标记因其分布于整个基因组中，平均每1 5 - 2 0k b 就存在 一个s t r 基因座，具有分布广泛、易于检测、信息量大和高度遗传多态性， 并遵循孟德尔共显性遗传等优点，因此被广泛应用于法医学中的个人识 别和亲子鉴定、遗传作图以及肿瘤生化研究等领域”目前在国内外法 医学界，s t r 分型技术已经成为个人识别和亲子鉴定的主流技术 d 9 s 1 1 1 9 、d 1 2 s 1 0 6 4 、d 1 8 s 5 3 6 、6 a t a l 5 6 d l l 和6 t a l 4 0 e 0 3 基因座 分别定位予人类第9 、1 2 、1 8 、6 、1 6 号染色体上，均是较为简单的s t r 基因座，易于标准化分型。法医学个人识别和亲子鉴定应用的s t r 基因 座要求等位基因突变率低、稳定性好、易于标准化“。，这五个基因座即 第一部分五个常染色体s t r 基因座多态性研究 属于这类较为理想的s t r 基因座。目前，国内尚无它们的群体遗传学的 研究报道本研究的主要且的是建立五个基因座快速分型的方法及标准 化等位基因片段的大小，本实验室构建等位基因分型标准物，同时调查 五个基因座在我国成都汉族人群中的基因频率分布情况，获得群体遗传 学数据，为群体遗传学研究及其在法医学实践中的应用提供理论依据 3 1 等位基因碱基重复序列分析 d 9 s l l l 9 、d 1 2 s 1 0 6 4 、d 1 8 s 5 3 6 、g a t a l 5 6 d 1 1 、g a t a l 4 0 e 0 3 五个s t r 基因座均为四碱基重复序列结构其中d 9 s 1 1 1 9 、g a t a l 5 6 d i i 、d 1 8 s 5 3 6 的重复序列为 g a t a ，d 1 2 s 1 0 6 4 的重复序列为 a t a g 。，g a t 1 4 0 e 0 3 的 重复序列为 a g a t 。 3 2 群体遗传学和法医学分析 五个s t r 基因座经法医学遗传多态性分析后，d 9 s 1 1 1 9 、d 1 2 s 1 0 6 4 、 d 1 8 s 5 3 6 、g a t a l 5 6 d 1 1 和g t a l 4 0 e 0 3 的等位基因数目分别是：7 、9 、7 、 6 、6 。对5 个基因座进行卡方检验，结果表明各基因座基因型分布符合 h a r d y - w e i n b e r g 平衡其中基因座d 1 2 s 1 0 6 4 、d 1 8 s 5 3 6 、6 a t a l 4 0 e 0 3 的 等位基因频率分布较均匀，其个人识别能力分别达到0 9 2 4 、0 8 6 6 、 0 8 7 4 ，有较高的法医学应用价值；而d 9 s 1 1 1 9 和g a t a l 5 6 d 1 1 的多态性 稍差，因此法医学应用价值有限 4 结论 本课题调查研究了五个s t r 基因座其中d 1 2 s 1 0 6 4 、d 1 8 s 5 3 6 、 g a t a l 4 0 e 0 3 三个基因座对成都汉族人群来讲，其基因频率分布均衡，提 供的信息量较大，个人识别率和非父排除能力高，具有较高的法医学应 用价值。因此，被挑选出来用于第二部分的荧光复合扩增系统。 四川大学硕士论文刘志勇 参考文献 1 h t t p ：w w w c h l c o r g 2 陈国弟，辛军平，李英碧等中国成都地区汉族群体5 个s t r 基因 座的遗传多态性研究中华医学遗传学杂志，1 9 9 9 ，1 6 ( 2 ) ：7 7 8 0 3 b a e r 吼b r i n k m a n nb ，b u d o w e lb ，口fa 1 d n ar e c o m m e n d a t i o n s ： f u r t h e rr e p o r to ft h ed n ac o m m i s s i o no ft h ei s f hr e g a r d i n gt h e u s eo fs h o r tt a n d e mr e p e a ts y s t e m s ，i n t e r n a t i o n a ls o c i e t yf o r f o r e n s i ch a e m o g e n e t i c s i n tjl e g a lm e d ，1 9 9 7 ，1 1 0 ( 4 ) ：1 7 5 4 w a i s hp s ，m e t z g e rd a ，h i g n c h ir c h e l e x - 1 0 0a sam e d i u mf o r s i m p l ee x t r a c t i o no fd n af o rp c rb a s e dt y p i n gf r o mf o r e n s i c m a t e r i a l b i ot e c h n i q u e s ，1 9 9 1 ，1 0 ：5 0 6 5 1 3 5 a l l e nc r , g r a v e sg b u d o w l eb p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n a m p l i f i c a t i o np r o d u c t ss e p a r a t e d o n r e h y d r a t a b l e p o l y a c r y l a m i d eg e l sa n ds t a i n e dw i t hs i l v e r b i o t e c h n i q u e s ， 1 9 9 0 , 7 ：7 3 6 4 4 6 g u os w , t h o m p s o ne a p e r f o r m i n gt h ee x a c tt e s to f h a r d y - w e i n b e r gp r o p o r t i o nf o rm u l t i p l ea l l e l e s b i o m e t r i c s 。 1 9 9 2 ，4 8 ( 2 ) ：3 6 1 7 徐振波，陈林，吴梅筠等成都汉族a c t b p - 2 位点多态性研究以及 三个位点的复合扩增四川大学学报( 医学版) ，2 0 0 3 ，3 4 ( 1 ) ：7 9 8 侯一平，吴谨，李英碧等中国汉族群体五个s t r 基因座遗传多态性研 究中华遗传学杂志，1 9 9 9 ，1 6 ( 4 ) ：2 2 8 - 2 3 2 9 侯一平，苟清，吴梅筠等人类短串联重复序列v w a 基因座的群体遗 传学研究中华医学遗传学杂志，1 9 9 6 ，1 3 ：6 5 1 9 。 1 0 侯一平，李英碧，唐剑频等成都汉族群体八个s t r 基因座遗传多态 1 7 第一郝分 五个常染色体s t r 基因座多态性研究 性研究中华医学遗传学杂志，2 0 0 0 ，1 7 ( 4 ) ：2 3 6 - 2 4 0 1 1 刘雅诚，霍振义，唐晖等北京汉族群体9 个s t r 位点的频率分布及 法医学应用中国法医学杂志，1 9 9 8 ，1 3 ：2 1 0 2 1 2 1 2 e d w a r d sa 。c i v i t e l l o ，h a m m o n dh a ，p fa 上d n at y p i n ga n d g e n e t i cm a p p i n gw i t ht r i m e t r i ca n dt e t r 铀e t r i ct a n d e mr e p e a t s mjh u m6 e n e t 。1 9 9 1 ，4 9 ( 4 ) ：7 4 6 四川大学硬士论文刘志勇 第二部分d 1 8 s 5 3 6 、d 1 2 s 1 0 6 4 、g a t a l 4 0 e 0 3 基因座荧光标 记复合扩增检测及其法医学应用 检测s t r 遗传标记已经成为法医学亲权鉴定与个人识别的主流 手段目前许多实验室采用多色荧光标记的复合扩增检测技术来进 行s t r 遗传标记的等位基因分型，该方法具有灵敏度高、快速、复 合扩增的基因座数目多、自动化程度高、分型准确、重现性好等优 点。该系统主要采用a b i 公司生产的毛细管电泳检测仪和a b i 、 p r o m e g a 公司的商品试剂盒“”由于不同区域、不同种族和不同民 族的遗传学差异，无疑需增加一些新的遗传标记以满足个人识别和 亲权鉴定的要求，同时也达到降低鉴定成本的目的。 本课题旨在研究自主开发的荧光标记复合扩增体系，调节 a b i - 3 1 0 毛细管电泳仪的各项参数，达到自动分析结果的目的。 l 材料与方法 1 1 材料 1 1 1 样本 i 1 1 1 第一组 用于荧光标记复合扩增体系的建立及参数优化的样本同第一 部分。 1 1 1 2 第二组 法医学可行性研究样本 ( a ) 系统灵敏度分析 ( b ) 种属特异性研究 ( c ) 8 例检案样本( 由法医物证学教研室提供) 第二部分d 1 8 s 5 3 6 、d 1 2 s 1 0 6 4 、g a t a l 4 0 e 0 3 基因座荧光标记复合扩增检测及其法医学戌用 1 1 2 试剂 t a qd n a 聚合酶( 上海申能博采生物有限公司，国产) ； d n t p ( p h a r m a c i 8 ，瑞典) ：蛋白酶k ( 6 i b c o b r l ，美国) ；a b i 的r o x 内标；去离子甲酰胺( a b i 公司，美国) ；电极缓冲液( a b i 公司， 美国) ；p o p 4 液体胶( a b i 公司，美国) 荧光引物分别由上海i n v i t r o g e n 和大连宝生物公司合成 1 1 3 仪器 p c r 仪器( p e9 6 0 0 ) a b ip r i s m 3 1 0 毛细管电泳仪( a b i 公司， 美国) ；高速离心机( e p p e n d o r f ，德国) ；连续可调移液器( e p p e n d o r f ， 德国) ；紫外分光光度计( s h i m a d z uu v 一2 6 0 ，日本) 纯水系统 ( m i i i i p u r e ，法国) ；超纯水系统( e a s y p u r er f ，美国) l 2 方法 1 2 1 基因座的筛选 选择符合s t r 基因座复合扩增的原则：各个等位基因频率分布 较好，个人识别机率高、杂合度在7 0 以上；引物之间特别是3 端不出现互补序列；各个s t r 基因座扩增条件相近。 根据上述原则，从前期遗传频率调查的五个s t r 基因座中选择 d 1 8 s 5 3 6 、d 1 2 s 1 0 6 4 、g a t a l 4 0 e 0 3 三个基因座进行复合扩增。 1 2 2 洲a 的提取 d n 的提取采用c h e l e x - 1 0 0 法 1 2 3 复合扩增的p c r 反应 1 2 3 1 引物 各个基因座中的某一条引物的5 端标记荧光分子为了保证 扩增过程中加a 完全，在另一条引物的5 端人为地增加了g t t c t t 序列( 表卜1 ) 。 2 0 四川大学硕士论文宴町志勇 表i - 1 复合扩增时各个基因座的引物序列 基因座引物序列 d 1 2 s 1 0 6 4f ：i g t t c t l l c t a c t c c a g g m c a g c c r ：瓢掀秘从t t t g c l r 丌c t 盯r g c t c c c d 1 8 s 5 3 6f ：$ e 飘争 m t c c t g g t g t t a g t c c t c t g r ：b t t c t l l c a c a g t t g t g t g a g c c g t c g a t a l 4 0 e 0 3f ：髓鹫- 从g t g t g t g g g a c t g c a t t r ：| g ”咖c a c c a c a g g c t t a c c a t g t 1 2 3 2 反应体系 p c r 反应体系为2 0 u1 其中含有i o x p c r 缓冲液2 pl ，1 5 m 0 1 l - m g c l b 4 0ut a q 聚合酶，4 0 0l i m 0 1 l - 1d n t p ，模板d n a 约1 5n g 该扩增体系中d 1 8 s 5 3 6 的引物浓度为0 6 2 5l im 0 1 l 一， d 1 2 s 1 0 6 4 的引物浓度为0 5 i im 0 1 l ，g a t a l 4 0 e 0 3 的引物浓度为 0 3 7 5 m 0 1 l - 1 1 2 3 3 扩增循环条件 9 4 。c 预变性3m i n 后，9 4 。c3 5s e c 、6 0 。c3 5s e c 、7 2 。c 5 5s e c 循环3 0 个周期后，7 2 。c 保温2 0m i n 硼 1 2 4a b i - 3 1 0 的数据收集 a b i - 3 1 0 毛细管电泳仪的参数设置和操作步骤详见附录4 1 2 5 等位基因分型标准物的构建 制作方法同第一部分所不同的只是d n a 模板进行扩增时所用 的引物是标记有荧光物质的。 1 2 6 热启动方法 除t a q 聚合酶以外的所有p c r 反应成份在室温下混合，分装于 0 2 m l 扩增管，放置于扩增仪中，启动扩增仪，当温度升至9 4 c 时 打开管盖，迅速加入t a q 聚合酶进行循环扩增。 第二部分d l 豁5 3 6 、d 1 2 s i 4 、g t 1 4 0 3 基因摩荧光标记复合扩增检测及其法医学应用 2 结果 2 i d 1 8 s 5 3 6 、d 1 2 s 1 0 6 4 、g a t 1 4 0 e 0 3 复合扩增荧光检测体系的建 立 2 1 1 等位基因分型标准物构建的电泳图 三个基因座的荧光标记分子量标准物电泳图( t y p e r ) ，见图2 - i ， 2 2 。2 3 。 图2 - 1d 1 8 s 5 3 6 的分型标准物 函亟函 图2 - 26 a t a l 4 0 e 0 3 的分型标准物 亡= j 函亟 = 图2 - 3d 1 2 s 1 0 6 4 的分型标准物 四川大学硕士论文刘志勇 2 1 2 等位基因分型标准物荧光检测结果 等位基因分型标准物的g e n e s c a n 分析结果见图2 - 4 圈2 - 4 等位基因分型标准物g e n e s c a n 分析结果 蓝色为6 一f 删标记的d 1 8 $ 5 3 6 的等位基因分型标准物；绿色为h e x 标记的 6 a t a l 4 0 e 0 3 的等位基因分型标准物：黄色( 黑色) 为t 删r a 标记的d 1 2 $ 1 0 6 4 的等位基因分型标准物。 2 1 3 a b i - 3 1 0 毛细管电泳自动分析仪对荧光标记片段的检测分 型 通过对荧光标记引物复合扩增条件的优化和a b i - 3 1 0 毛细管 电泳自动分析仪的参数设置“1 ，我们得到了荧光标记引物复合扩增 毛细管电泳激光自动分析的结果，见图2 - 5 、2 - 6 、2 - 7 。峰形对称 尖锐，无双肩峰出现，峰之间的基本平衡。蓝色为d 1 8 s 5 3 6 的产物 峰；黑色为v 1 2 $ 1 0 6 4 的产物峰；绿色为g a t a l 4 0 e 0 3 的产物峰。其 中图2 5 ，三个基因座的产物均为杂合子：图2 - 6 ，g a t a l 4 0 e 0 3 基 因座为纯合子，因此绿色产物锋明显高；图2 - 7 ，d 1 2 s 1 0 6 4 和d 1 8 s 5 3 6 基因座均为纯合子，因此其产物峰较6 a t a l 4 0 e 0 3 基因座为高。 第二部分d 1 8 s 5 3 6 、d 1 2 s 1 0 6 4 、g t a l 4 0 e 0 3 基因座荧光标记复合扩增检铡及其法医学戍用 圈2 5 三个基因座全部为杂合子 图2 _ 6g a t a l 4 0 e 0 3 ( 绿色) 基因座为纯合子 忡 1 h 一 一1 四川大学硕士论文刘志勇 锱翕 图2 - 7d 1 2 s 1 0 6 4 ( 黑色) 和d 1 8 s 5 3 6 ( 蓝色) 基因座均为纯合子 2 1 4 复合扩增体系分型的准确性 随机抽取群体调查的1 0 个d n a 样本进行荧光复合扩增，其分 型结果均与单独扩增每个基因座等位基因的结果完全一致。说明该 复合扩增体系有较高的分型准确性。 2 2 不同扩增参数对扩增产物的影响结果 2 2 i 热启动与非热启动的扩增效果的比较 对同一样本进行热启动与非热启动的比较。两种扩增方式均能得 到满意的分型结果，无显著性差异，见图2 - 8 。 第二部分d 1 8 s 5 3 6 、d 1 2 s 1 0 6 4 、g a t 1 4 0 e 0 3 摹因座荧光标记复合扩增检测及其法医学应用 图2 - 8 热启动与非热启动效果的比较 a 非热启动方式的效果图；b 热启动方式的效果图。 2 2 2 不同退火温度的研究 在其它扩增条件不变的条件下，