（食品科学专业论文）高产色素及Monacolin+K的红曲霉菌固态发酵工艺研究.pdf

高产色素及m o n a c o l i nk 的红曲霉菌固态发酵 工艺研究 摘要 红曲霉固态发酵技术起源于我国，已有悠久的历史。过去主要 是利用其发酵生产红曲色素，其作为天然色素，被认为是安全性高 的食用色素之一，被用来代替人工合成色素广泛应用于医药、食品、 日用化工、酿造领域、肉制品、饮料、化妆品中。近年来，有研究 者发现红曲霉发酵可产生降低血压和胆固醇的物质m o n a c o l i nk 之 后，国内外学者掀起了针对降脂红曲霉的研究热潮，它的药用价值 开始逐渐得到人们的重视。最近研究还发现，m o n a c o l i nk 同时还可 能具有预防和治疗胆结石、前列腺肿大和肿瘤等作用，具有广阔的 应用前景。因此本论文旨在进一步优化红曲霉固态发酵生产食用色 素和m o n a c o l i nk 工艺条件，为提高我国工业化生产技术水平提供依 据。本论文主要完成的研究内容如下： 1 通过单因素和正交试验确定了利用红曲霉固态发酵高产红曲色素 和m o n a c o l i nk 的最佳工艺条件：2 5 0 m l 三角瓶中装2 0 9 糯米，并 调整培养基初始含水量为55 ，再加入2 葡萄糖、o 1 甘油、3 酵母粉、2 蛋白胨、o 1 硝酸铵、o 2 氯化铵、o 4 硫酸镁和 o 2 磷酸二氢钾，在1 2l 、0 1m p a 、3 0 m i n 灭菌，冷却。麦芽汁 斜面直接接种，发酵时间15 天，采取变温培养，即3 2 - - 3 5 培养7 天后降至2 3 2 5 培养到12 天，p h 自然条件( 偏酸) 。按以上条 件，色价值可达到1 1 0 8 5u g ，m o n a c o l i nk 产量可达到3 1 8 4m g g 。 2 以酵母、酵母滤液、固态酵母为诱导剂加入固态发酵培养基中， 通过试验得出，在培养2 天后添加lm l 酵母滤液时m o n a c o l i nk 的 产率达3 2 0 0m g g ，色价值也达到1 5 0 0 5u g 。 3 确定了h p l c 测定m o n a c o l i nk 含量的色谱条件：色谱柱 ( p h e n o m e n e xc 18 ，5 l x m ，2 5 0 m m x 4 6 m m ) ，流动相选用乙腈：o 18 磷酸( v v ) = 7 7 ：2 3 ，流速选用1 0m l m i n 。在这一条件下可以更为 准确的对m o n a c o l i nk 含量进行测定。 4 通过单因素和正交试验确定了m o n a c o l i nk 的复合萃取条件：溶 剂为乙醇( 7 0 ) ：乙酸乙酯：甲苯= 5 ：5 ：l 、超声波处理时间为 2 0 m i n 、温度为6 0 。此条件下，可以在一定程度上使m o n a c o l i nk 与色素分离。 5 通过正交试验确定了红曲色素最佳萃取条件：选用7 0 乙醇为溶 剂，在6 0 下浸提2 h 。 通过试验确定了自选红曲霉菌株发酵主产红曲色素和 m o n a c o l i nk 的最佳发酵条件及工艺流程；m o n a c o l i nk 的复合萃取 条件；诱导剂的添加量和添加时间及m o n a c o l i nk 快速简便测定方 法。 关键词：红曲霉，m o n a c o l i nk ，色素，固态发酵 i i r es e a r ho fp i g m e n ta n dm o n a co l i nk p r o d u c t i o nb ys o l i df e r m e n t a t i o no f m o n a s c u s a b s t r a c t t h et e c h n o l o g yo fs o l i df e r m e n t a t i o no fm o n a s c u sw a sc a m eo fc h i n a i nt h ep a s t ，p e o p l em a i n l yu s em o n a s c u sp i g m e n t s a san a t u r ep i g m e n t ， m o n a s c u sp i g m e n t sa r ec o n s i d e r e dt h eh i g h e rs a f e t ya se d i b l ep i g m e n t r e c e n t l y ，i ts u b s t i t u t es y n t h e t i cp i g m e n tw i d e l yu s e di nm e d i c i n e ，f o o d ， d a i l yc h e m i c a l ，b r e w i n ga r e a ，m e a tp r o d u c t s ，b e v e r a g e s ，c o s m e t i c s h o w e v e r ，t h er e s e a r c h e r sd i s c o v e r e dar e dm o n a s c u sc a np r o d u c ea s t r o n g b l o o d p r e s s u r e l o w e r i n g a n dc h o l e s t e r o l - l o w e r i n gs u b s t a n c e m o n a c o l i nk a f t e rl9 7 9 ，t h es c h o l a r sa th o m ea n da b r o a ds e to f fa n u p s u r g eo ft h em o n a s c u sp u r p u r e u sr e s e a r c h i t sm e d i c i n a lv a l u es t a r t e d t og e tp e o p l e sa t t e n t i o n r e c e n t l ys t u d i e sa l s of o u n dt h a t ：m o n a c o l i nk a l s ol i k e l yt op r e v e n ta n dt r e a tg a l l s t o n e s ，p r o s t a t ee n l a r g e m e n ta n d t u m o r t h e r e f o r e ，i th a sb r o a da p p l i c a t i o np r o s p e c t s b u tn o w ，w e m a i n l ym a k eu s eo fo v e r s e a st e c h n i q u e s o ，t h em a i np u r p o s eo ft h e t h e s i si s t o s t u d y t h ef e r m e n t a t i o n t e c h n o l o g y o fp i g m e n ta n d m o n a c o l i nk b ys o l i df e r m e n t a t i o no fm o n a s c u s t h em a i nr e s u l t sa r e a sf o l l o w s 1 a no p t i m u mm e d i u mw a so b t a i n e dt h r o u g hs i n g l ef a c t o rt e s t sa n d o p t i m i z a t i o nt e s t s w eg o tt h eo p t i m u mm e d i u m ：s e n d2 0 9s t i c k yr i c e i n t o2 5 0 m lc o n i c a lf l a s k ，a n da d j u s tt h ei n i t i a lw a t e rc o n t e n tf o r m e d i u mi s5 5 ，t h e np u ti n t og l u c o s e5 ，g l y c e r o l0 1 ，y e a s tp o w d e r 3 ，p e p t o n e2 ，n h 4 n 0 40 1 ，n h 4 c 1o 2 ，m g s 0 4o 4 ，k h 2 p 0 4 0 2 ，t h e ni ts t e r i l i z e di nt h el21 a n d0 1m p a ，f o r3 0 m i n ，c o o l i n g i n o c u l a t e db yw o r ts l a n t ，f e r m e n t a t i o nt i m ei s15d a y s t a k i n gc h a n g e d - t e m p e r a t u r et r a i n i n g t h a ti s ，3 2t o3 5 f o r 7d a y sa n df a l lt o2 3t o2 5 f o r12d a y s ，t h en a t u r a lp hc o n d i t i o n s ( a c e r b i c ) i na c c o r d i n gt ot h e a b o v ec o n d i t i o n s ，t h ec o n c e n t r a t i o no fp i g m e n tc o n t e n tc a nb er e a c h e d t o110 8 5 u g t h ey i e l do fm o n a c o l i nkc a nr e a c h3 18 4m g g i i i 2 a st h ed e r i v a t i v e ，t o o kt h ey e a s t ，t h ey e a s tf i l t r a t e ，t h es o l i dy e a s t i n t ot h es o l i df e r m e n t a t i o nm e d i u m ，f r o me x p e r i m e n t sw ec a no b t a i n ： a f t e r c u l t i v a t i n g 2 d a y s ，w ea p p e n d t h elm ly e a s tf i l t r a t e ，t h e p r o d u c t i o nr a t eo fm o n a c o l i nkr e a c h e s3 2 0 0m g g ，t h ec o n c e n t r a t i o n o fp i g m e n tc o n t e n ta l s oa c h i e v e s15 0 0 5u g 3 t h em e t h o dw h i c hd e t e r m i n e st h ec o n t e n to fm o n a c o l i nkw a s s t u d i e d t h eo p t i o n a lc o n d i t i o nf o rh p l cw a sd e c i d e d ：c h r o m a t o g r a m c o l u m n ( p h e n o m e n e xc 18 ，5 9 m ，2 5 0 m m x 4 6 m m ) ；c h o o s ea c e t o n i t r i l e a sm o b i l ep h a s e ：0 18 p h o s p h o r i ca c i d ( v v ) = 7 7 ：2 3 ；f l o wv e l o c i t yi s 1 0m l m i n u n d e rt h i sc o n d i t i o nw ec a nm o r ea c c u r a t e l yd e t e c tt h e c o n t e n to fm o n a c o l i nk 4 a no p t i m u mm e d i u mo fc o m p l e xe x t r a c t i o no fm o n a c o l i nkw a s o b t a i n e dt h r o u g hs i n g l ef a c t o rt e s t sa n do p t i m i z a t i o nt e s t s ：t a k ee t h a n o l ( 7 0 ) ：e t h y la c e t a t e ：t o l u e n e = 5 ：5 ：1a ss o l v e n t u l t r a s o n i ct i m e sa r e 2 0 m i n ，t e m p e r a t u r ea r e6 0 u n d e rt h e s ec o n d i t i o n s ，w ec a ns e p a r a t e m o n a c o l i nka n dt h ep i g m e n t 5 a no p t i m u mm e d i u mo fe x t r a c t i o no fm o n a s c u sp i g m e n t sw a s o b t a i n e dt h r o u g ho p t i m i z a t i o nt e s t s ：t a k ee t h a n o l ( 7 0 ) a ss o l v e n t ，d i p 2 hu n d e r6 0 a no p t i m u mf e r m e n tm e d i u ma n dt e c h n i c sf l o wo fo p t i o n a lm o n a s c u s p u r p u r e u sf e r m e n ta n dm o n a c o l i nkw a so b t a i n e dt h r o u g he x p e r i m e n t s w eg o tt h e c o m p l e xe x t r a c t i o nc o n d i t i o no f m o n a c o l i nk ，t h e a c c e s s i o nm e t e sa n dt i m e so fr e v u l s a n ta n dc o n v e n i e n td e t e r m i n em e a n s o fm o n a c o l i nk k e yw o r d s ：m o n a s c u sp u r p u r e u s ，m o n a c o l i n k ，p i g m e n t ，s o l i d f e r m e n t a t io n i v 原创性声明及关于学位论文使用授权的声明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文 不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的科研成果。对本文 的研究做出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。 本人完全意识到本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名： ：2 虱盈迦 日 期：2 q q 堡生( 月 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解陕西科技大学有关保留、使用学位论文的规定， 同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅和借阅；本人授权陕西科技大学可以将本学位 论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。同时授权中国科 学技术信息研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据 库，并通过网络向社会公众提供信息服务。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名： j 至l3 迦导师签名： 5 7 日期：2 q 呼生篁月 高产色素及m o n a c o l i nk 的红曲霉菌固态发酵t 艺研究 1 文献综述 1 1 红曲霉 1 1 1 红曲霉的分类 红曲霉是我国最早应用于食品加工的有益真菌之一。按真菌学的分类方 法，红曲霉属真菌门，子囊菌纲，真子囊菌亚纲，红曲霉属l ：l 。布谷昭( 1 9 8 8 ) 从中国、朝鲜、台湾和香港的酒曲、腐乳、酒库及土壤和腐败果实中共分离到 约2 0 种红曲霉。中国科学院微生物研究所和轻工部食品发酵研究所( 19 8 3 ) 正式 收集编录的重要红曲霉有8 种4 8 个菌株。这8 种分别为：紫红曲霉( m o n a s e u s p u r p u r e u s ) 、安卡红曲霉( m a n k a ) 、红色红曲霉( m r u b e r ) 、巴克红曲霉( m b a k e r i ) 、烟色红曲霉( m f u l i g m o s u s ) 、发白红曲霉( m a l b i d u s ) 、锈色红曲霉 ( m r u b i g i n o s u s ) 、变红红曲霉( m s e r o r u b e s c e n s ) f 3 】。 1 1 2 红曲霉的培养特征和生理生化特征 红曲霉是腐生真菌，其生长的最适p h 为3 5 5 0 ，能耐p h3 5 。它的生 长温度为2 6 4 2 ，而最适温度为3 2 3 5o c ，同时能耐1 0 乙醇【，i 。红曲霉在 普通的马铃薯琼脂培养基上就能正常生长，包括葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、半乳 糖、淀粉和麦芽糖醇在内的大多数糖类都可被其利用；而乳糖、木糖、果糖和 甘油等则不易被其利用。然而经研究发现，当葡萄糖浓度过大时，会导致菌体 生长缓慢、色素和酒精产量减少；而添加适量的甘油也有助于色素和其它次级 代谢产物的生产。同时，不同氮源对红曲色素产量的影响很大。研究发现，红 曲霉对有机氮的利用要优于无机氮。以n h 4 + 为氮源时，易产桔色素：硝酸盐、 谷氨酸钠或酵母提取物作氮源时则产较多的红色素；氯化铵和蛋白胨的混合氮 源较n 0 3 产更多的色素【4 】。邢旺兴等试验也证明红曲霉所有的菌种都能利用有 机态氮而不能利用亚硝基态氮和脲作为氮源，能利用大部分糖类而不能利用乳 糖醛酸作为碳源【s 】。 红曲霉广泛存在于新鲜的牧草、泥土、橡胶、鱼干、河川表面沉淀物及松 树根组织中。其菌落结构有呈绒毡状、皮膜状、少褶皱皮膜状或具有辐射纹。 红曲霉是同宗配合的，其菌丝具有横隔，多核，分枝甚繁且不规则的特点【s 1 。 细胞幼时含有颗粒，老后含空泡及油滴。分生孢子着生在菌丝及其分支的顶端， 单生或以向基式生出，2 6 个成链。闭囊壳呈球形，有柄，但长短不一。闭囊 壳内散生十多个子囊，子囊呈球形，一个子囊含8 个子囊孢子，当成熟子囊壁 解体时，孢子留在薄壁的闭囊壳内( 7 1 。红曲霉的孢子产量普遍较少，菌丝初为 白色，老熟后因菌种的不同而变为淡红色、紫红色、赭红色、橙红色或烟灰色 等。 陕西科技大学硕士学位论文 1 2 红曲霉发酵产物 1 2 1 红曲 红曲起源于我国，古时称为丹曲。它是以大米为主要原料，经红曲霉发酵 而制成的一种紫红色米曲，是一种食疗兼备的传统药。红曲在食品及中药上的 应用已逾千年，北宋初年陶古提到“用红曲煮肉”是较早的记述。而后，元朝吴 瑞撰写的日用本草中记录到：“红曲酿酒，破血行药势。”明末清初的宋应 星撰写天工开物中提到：“丹曲，一种世间鱼肉最腐朽物，而此物薄施涂 抹，能固其质于炎暑之中，经历旬月，蛆蝇不敢近，色味不离初，盖奇药也。” 以及李时珍撰写的本草纲目中也记录到：“红曲主治消食活血，健脾燥胃。 治赤白痢，下水谷，治打扑伤损，治女人血气痛及产后恶露不尽。 近代中医 药理论把红曲的药用功能主要概括为“除湿痰，活血化淤，健脾消食，治赤白 痢，下水谷”等几点。这些都一再证明了我们祖先发明的红曲在食品染色、食 品防腐及医疗上有着卓著功效i s 9 】。红曲有库曲、轻曲、色曲3 个品种。库曲主 要用于酿制黄酒、果酒和药酒；轻曲主要用于酿造腐乳、酱菜、果酒、药酒及 食品着色；色曲主要用于食品着色。它们生产的不同之处主要在于菌种、发酵 周期及其他区别。红曲性温、味甘、无毒，是深受我国人民喜爱的一种红色天 然色素和多功能中药【- o 】。然而红曲这种颇具东方色彩的传统产品所蕴含的医用 及药用价值却在近几十年的研究中才被真正挖掘出来。随着人们对红曲霉生产 的有效生理活性物质的深入研究，越来越多具有高药用价值的代谢产物被发 现，这不仅为红曲酿酒、制醋及生产色素的开发提供理论基础，而且为降低胆 固醇、血压、血脂等的功能性保健红曲的大规模开发利用提供了技术保障。因 而，蕴含着东方智慧的红曲霉成为了世界性的话题1 。 红曲研究大致分为三个阶段：7 0 年代以前，主要是研究红曲菌的分类和 鉴定、高产色素菌株选育和发酵工艺；1 9 7 9 年，日本学者远藤章从红曲霉中发 现m o n a c o l i nk 生理活性物质后，引起全世界科学家的关注，国内外研究者开 始对红曲霉进行药用生理价值的探讨，并利用现代生物技术进行分离、分析及 提取其有效生理活性物质，对红曲霉的功能因子的功能性、分子结构、作用机 理、代谢途径和安全性等方面进行广泛而深入的研究，因此，在8 0 年代掀起 了功能性红曲研究的高峰；19 9 5 年p l a n e 等人从红曲霉发酵产物分离出桔霉素 后，引起科学家对红曲安全性的关注。而在我国，红曲研究自6 0 年代起，主 要在红曲菌种的分类、色素红曲和酒用红曲的发酵工艺领域开展了研究【”】。 1 2 2 初级代谢产物 1 2 2 1 酶 2 高产色素及m o n a c o l i nk 的红曲霉菌同态发酵工艺研究 红曲霉在生长过程中能产生多种酶类，如淀粉酶、糖化酶、糊精化酶、麦 芽糖酶、蛋白酶、果胶酶等。不同种类菌株产酶的类型及产量有所差异【- 2 1 。7 0 年代以来，中国科学院微生物研究所开展了红曲霉葡萄糖淀粉酶方面的理论研 究。试验证明：红曲霉的葡萄糖淀粉酶具有多型性，能将淀粉百分之百水解为 葡萄糖。19 7 6 年得到该酶结晶，并且进行了电镜观察，其中的第4 带即e 4 还 纯化到凝胶电泳均一，并进行了一系列物理化学性质的测定。为了比较e 3 和 e 4 ，又用板型凝胶制备电泳分别将e 3 和e 4 纯化，进一步比较研究了两型组 成及某些性质。通过对葡萄糖淀粉酶的底物特异性的研究，发现该酶的粗提取液 可以完全分解可溶性淀粉、直链淀粉、支链淀粉等多种底物。此外，还研究了 该酶的紫外差光谱，色氨酸残基的修饰与酶活力的关系，肽图谱以及该酶的形 成过程和糖肽结合方式，并对其构象进行了研究。同时通过对红曲a s 3 3 4 9 1 葡萄糖淀粉酶的生物合成调节机制和形成过程的研究，证实了迅速利用的碳源 对该酶的阻碍作用是因为培养基p h 降低的结果，而“葡萄糖效应 只是表现 效应。以上研究为利用红曲霉生产葡萄糖淀粉酶提供了理论基础。此后，工业 上利用红曲霉这一特性代替了酸水解法生产葡萄糖的工艺。采用红曲霉生产葡 萄糖，具有水解率高、节约粮食、降低成本及提高产品质量的特性 1 3 1 。 ； 红曲霉的蛋白酶活性较高，故可用以盐渍鱼肉、豆腐等高蛋白食品1 1 3 1 。安 田和昭等从红曲霉中提取了高纤性蛋白酶，并研究了豆腐乳成熟过程中使用红 曲霉后的化学成分变化 1 4 - ，一为红曲霉的应用提供了理论依据。红曲霉中糖化酶 也是酿造业所应用的重要酶类之一，如在豆豉生产中应用糖化增香曲增加其色 泽和风味，提高氨基酸态氮和蛋白质的含量 15 1 。此外，红曲霉某些菌种能分泌 直接催化己酸和乙醇合成己酸乙酯的胞外酶，例如从烟色红曲霉中可筛选得酯 化酶活性较强的酯化红曲，有效提高了大曲的糖化力、发酵力和酯化力，从而 影响白酒中的乙酸乙酯、乳酸乙酯、己酸乙酯和丁酸乙酯等风味物质的含量， 同时，因其耐酸性较强，可将有机酸转化成相应的酯，解除了酸对细胞的毒害 作用，且产生的蛋白酶丰富了酒的香味成分，因此成为影响浓香型大曲的重要 酶系。杜礼泉等对红曲霉酯化酶的酯化特性进行了研究，结果证实：烟色红曲 霉产生的酯化酶活性较高，且其最适催化温度为4 0 ，最适催化酒精度为1 2 v o l ，最适催化p h 为3 0 1 6 1 。谢国排运用超强己酸溶液和红曲酯化酶进行夹 层发酵提高浓香型大曲酒优级品率达4 2 9 ，提高出酒率达12 4 【1 7 ，1 8 】。 1 2 2 2 脂肪酸 19 8 9 年，日本学者研究认为，不同红曲霉菌株产生的脂肪酸成分有很高 的相似性。国内宋洪涛采用了气相色谱进行分析，结果表明不饱和脂肪酸含量 3 陕西科技大学硕士学位论文 达6 4 7 7 ，多烯不饱和脂肪酸含量达1 6 2 7 。经过活性测定，认为它 们可能有增强m o n a c o l i n 类物质分解甘油三酯，降低极低密度脂蛋白胆固醇的 功能。19 9 2 年，德国学者发现红曲霉能将短链脂肪酸转变为甲基酮，并对其代 谢途径进行了初步探讨d 9 ) 。在不饱和脂肪酸方面，尚有待深人研究，以便对红 曲的降脂作用能有较为全面的了解。 1 2 2 3 有机酸 日本有人在利用红曲霉突变株生产酒精饮料时对产生的有机酸进行了分 析，发现突变株与亲株产生的有机酸成分很相近。泰国研究者对收集到的4 0 株红曲霉菌株进行筛选 1 9 1 ，发现m o n a s e u sa r a n e o s u sa h u9 0 8 7 菌株在含有1 0 葡萄糖、0 0 2 5 肉膏提取物的培养基中进行发酵培养，其l 一苹果酸产量达到 2 8 1g l ，随后又对菌株进行诱变处理，分离得到的白化突变株最大产量可达 4 8 7 9 l 。 1 2 3 次级代谢产物 1 2 3 1 红曲色素 红曲色素是由红曲霉属的丝状真菌经发酵而合成的天然色素，是红曲霉的 次级代谢产物。近年来，愈来愈多的人认识到合成色素的毒副作用，天然色素 日渐受到消费者的青睐，特别是具有保健功能的天然红曲色素一直是国内外学 者研究的焦点。以此代替合成色素应用于食品、化妆品、药品方面已引起了全 球的关注。 ( 1 ) 红曲色素的性质 红曲色素是红曲菌在生长代谢过程中产生的天然色素，它是由化学结构不 同、性质相近( 即a r p h i l o n e 类有机物) 的黄、红、紫3 类不同色谱组成的混 杂色素物质。红曲色素主要包括2 种黄色素( m o n a s e i n 梦那红，a n k a f l a v i n 安 卡黄素) ，2 种红色素( r u b r o p u n c t a i n 潘红，m o n a s c o r u b i n 梦那玉红) ，2 种紫 色素( r u b r o p u n c t a m i n e 潘红胺，m o n a s c o r u b r a m i n e 梦那玉红胺) ，这些都为脂 溶性色素。另外还存在水溶性色素成分，结构待定 2 0 引1 。19 9 3 年郭东川等通过 有机溶剂萃取和两次硅胶柱层析，分离得到2 种色素，经高压液相色谱测定确 认为纯色素样品。通过元素组成分析、核磁共振谱、快离子轰击、质谱和高分 辨质谱分析确定，该2 种色素与己知的6 种红曲色素不同，确定为新的红曲色 素，它们的分子式为：c 2 5 h 3 1 0 5 n 和c 2 3 h 2 7 0 5 n ，分子量分别为4 2 5 和3 9 7 t 2 2 】。 与其他天然色素相比，红曲色素具有热稳定性好、蛋白着色力强、色调柔 和、p h 适用范围广等特点，尤其是它能耐高温特性使其在烹饪、高温灭菌、 焙烤时拥有其他色素无法比拟的优势。在日光下红曲色素较稳定，但在日光直 4 高产色素及m o n a c o l i nk 的红曲霉菌同态发酵工艺研究 射下色泽会减弱。同时它在食品中不受金属离子影响，在稀释1o o 倍的红曲溶 液中加入0 0 1 m o l l 的钙离子、镁离子、铜离子，经4 8 h 后其红色色素残留率 均超过9 7 2 3 】。 在安全性方面，红曲色素也具有优势。我国毛宁等对色素提取液进行分析， 以黄曲霉毒素b l 、b 2 、g i 、g 2 作标准液，对照红曲霉培养物的提取液进行薄 层层析，比较r f 值，结果证明，提取液中不含黄曲霉毒素1 2 i 。古泉快夫等利 用红曲色素进行毒理试验，试验表明，小白鼠口服最大剂量为18 9 k g ，没有引 起死亡；腹腔注射红曲色素l d 5 0 在4 0 0 0 m g k g 以上；将1o 红曲色素发酵液 稀释10 倍，每天喂食小白鼠4 0 m l 共7 个月，结果未见异常1 1 7 1 。我国也有学 者用小白鼠做急性毒理试验，即使最大剂量为2 0 9 k g 也无死亡例；小白鼠腹 腔注射l d 5 0 为2 0 0 0 m g k g ；亚急性毒性试验、慢性毒性试验和致变性试验等也 都证明红曲色素没有毒性和致变作用，安全性极高 2 5 1 。 ( 2 ) 红曲色素的应用 能量储存物质傅亮研究认为红曲色素在红曲霉菌代谢过程中有特 殊的生理功能。在营养良好的培养基中培养时，红曲霉合成的红曲色素可以作 为一种能量储存物质，当培养基营养缺乏时，红曲霉可同化色素，延缓细胞衰 老、自溶过程| 2 6 1 。 肉制品中的应用红曲色素在肉制品中广泛应用，在高达13 0 的生 产温度时其颜色不发生明显变化。此外，红曲色素是目前肉制品中亚硝酸盐的 最好替代品，除赋予良好的肉红色外，还能减少6 0 的亚硝酸盐用量，增加安 全性，提高香肠颜色对光和氧气的稳定性，国内外一直致力于此方面的研究。 王柏琴等将红曲色素用在发酵香肠中代替亚硝酸盐发色取得很好的效果，试验 证明，用l6 m g g 红曲色素制作的香肠颜色更接近于用0 15 m g g n a n 0 2 的香肠 颜色1 1 3 1 。 防腐抗菌红曲的防腐抗菌作用自古就有记载，天工开物中就记 载了用红曲保存肉，在夏季十日不腐。董明盛等对食品中1 4 种易污染的微生 物进行抑菌试验证明：红曲色素对蜡状芽胞杆菌、霉状杆菌、枯草杆菌、金黄 葡萄球菌和荧光假单胞杆菌有较强的抑制作用。中国食品发酵工业研究所王柏 琴等研究红曲色素对肉毒梭状芽胞杆菌的抑制作用，证明其提取物可使肉毒梭 状芽胞杆菌的营养体细胞产生裂痕【：，】。有报道说，红曲色素的抗菌活性是由 m o n a s c o r u b r a m i n e 和r u b r o p u n c t a m i n e 两种色素产生的。 其他有学者发现，红曲能促进人体对铁的吸收，对防治贫血有一定 效果。红曲色素中的玉红胺具有活泼的羟基，易与氨基作用，可治疗氨血症， 5 陕西科技大学硕士学位论文 并有防癌作用【z s 】。日本在培养淡色红曲霉、红色红曲霉等种时，抽提出一种具 有细胞活化作用的物质，具有防止皮肤粗糙、延缓衰老之功效，目前已在化妆 品中使用，每1o o g 化妆品中添加1o g 抽提物，即可达到很好的效果【2 9 】。 i 2 3 2m o n a c o l i n 类物质 1 9 7 9 年日本远藤章教授首次从红曲霉中分离出具有抑制胆固醇合成的活 性物质，并命名为m o n a e o l i nk ( 莫那克林k ) 。后又分离出一系列相似的活性成 分：m o n a c o l i nl ，m o n a c o l i nx ，m o n a c o l i nj ，这些m 类物质对h m g c o a 还原酶有高效特异抑制作用，其中以m k 活性最高。美国的a l b e r t 等人也于 19 8 0 年从a s p e r g i l l u st e r r e u s ( 土曲霉) 中发现类似的h m g c o a 抑制物质，起名 为m e v i n o l i n 。m e v i n o l i n 即l o v a s t a t i n ( 洛伐他汀) ，经证实是m o n a c o l i nk 的其 中一种形态。我国在这方面的研究也有报道，19 8 8 年何壁梅等首次从m h 2 6 8 8 的变异株中提取出m h 一2 6 8 8 ，此后证明这种物质即m o n a c o l i nk 。此后，美国 和日本的科学家用m o n a c o l i nk 对动物进行了大量试验。结果显示，m o n a c o l i n k 是安全的1 15 1 。至此以后，m o n a c o l i nk 以其高效、低毒、安全等特点使其成 为各国公认的降低胆固醇的理想药剂 3 0 l 。 ( 1 ) 理化性质 m o n a e o l i nk 在常态下是透明或白色针状晶体，熔点为l5 7 15 9 ，在 甲醇中m ：值为+ 3 0 7 6 ，在甲醇中紫外线光谱显示最大吸收波长为：2 2 9 n m 、 2 3 7 n m 、2 4 6 n m ，在k b r 中红外线光谱吸收波长为：3 5 5 0 、2 9 7 0 、1 6 9 6 、1 2 2 0 c m 一。 1 3 c 。n m r 光谱显示有2 个酯碳( 8 1 7 3 2 9 & 1 7 8 1 6 ) 、4 个甲基碳原子( 万1 2 1 8 ， 1 4 13 ，16 6 2 和2 3 3 9 ) 及甲基和次甲基碳存在。m o n a e o l i nk 的质谱除m e 为 4 0 4 ( m + ) 、3 2 0 ( m 10 2 ) 、2 8 4 ( m - 1 2 0 ) 、2 4 4 ( m - 18 0 ) 峰外，还有1 9 8 ( m 一2 0 6 ) 、 1 7 2 ( m 2 3 2 ) 、1 5 9 ( m 2 4 5 ) 、1 5 7 ( m 2 4 7 ) 峰。通过元素分析及高效质谱分析得知 其分子式为c 2 4 h 3 6 0 5 ，分子量为4 0 4 5 5 1 1 7 。它能溶于甲醇、乙醇、丙酮、氯仿 及苯等有机溶剂，但不溶于正己烷和石油醚。m o n a c o l i nk 的主要结构为氢化 奈母核、b 一羟6 内酯环和2 甲基丁酸。其主要性质见表1 1 。在酸性条件下， 根据母核上两处支链结构的不同，可以形成酸型m o n a e o l i nk 和内酯型 m o n a c o l i nk ( l o v a s t a t i n ) 两种形态( 图1 1 ) 。 表1 1m o n a e o l i nk 的主要性质 t a b 1 1t h em a i np r o p e r t i e so fm o n a c o l i nk 性质参数 m o n a c o l i nk 的主要性质 外观 溶解性 透明或白色针状结晶 溶于有机溶剂，不溶于中性及酸性水 6 高产色素及m o n a c o l i nk 的红曲霉菌固态发酵工艺研究 m p ( ) 【a d ( c l ，甲醇) 分子量( m s ) 分子式( h r e i m s ) u v ( 甲醇，n m ) i r ( c m 一，k b r ) 1 3 c n m r ( c d 3 0 d ) h n m r 1 5 7 1 5 9 + 3 0 7 6 0 。( 2 5 ) 4 0 4 c 2 4 h 3 6 0 5 2 2 9 ，2 3 7 ，2 4 6 3 5 5 0 ，2 9 7 0 ，1 6 9 6 ，1 2 2 0 2 个酯基羰基碳( 8 1 7 3 2 9 ，1 7 8 1 6 ) 4 个甲基碳( 6 1 2 1 8 ，1 4 1 3 ，1 6 6 2 ，2 3 2 9 ) 6 ：0 8 8 ( 3 h ) ，0 9 0 ( 3 h ) ，1 0 8 ( 3 h ) ，1 1 l ( 3 h ) ； 1 2 9 ，1 3 8 ，1 4 2 ，1 4 8 ，1 6 3 ，1 6 5 ，1 7 2 ， 1 8 9 ，1 9 5 ( 2 h ) ：1 9 0 ，2 2 7 ，2 3 6 ，2 3 8 ，2 4 5 ， 2 6 3 ，2 7 2 ，4 3 6 ，4 6 3 ，5 3 8 ，5 5 3 ，5 7 9 ， 5 9 9 c h h c h 酸型m o n a c o l i nk内酯型m o n a c o l i nk 图1 1m o n a c o l i nk 的酸型及内酯型化学结构 f i g 1 1t h em o l e c u l a rs t r u c t u r eo fa c i df o r ma n dl a c t o n ef o r mo fm o n a c o l i nk ( 2 ) 药用机理 致病原因医学研究表明：高胆固醇血症可能是冠心病和动脉硬化的 重要原因之一。在人体内，只有1 3 的总胆固醇来源于食物，其余2 3 由肝脏 和小肠合成。在胆固醇的合成过程中，约有2 5 种酶参加反应，最为关键的一 步是羟甲基戊二酰辅酶a ( h m g c o a ) 在其还原酶作用下生成甲羟戊酸 ( m v a ) ，然后经一系列步骤合成胆固醇。而后，又在肝脏里被转化成胆酸。 如果能够抑制肝脏内源性胆固醇的生物合成，就一定会降低血液内胆固醇的浓 度，从而达到治疗高胆固醇血症，防止或缓解动脉硬化和冠心病的发生 3 1 1 。 作用机理胆固醇合成的限速酶是3 羟基3 一甲基戊二酰c o a 还原 酶，该酶所催化的由3 一羟基3 甲基戊二酰c o a 形成甲羟戊酸的反应是合成胆 7 陕西科技大学硕士学位论文 乙酸盐一乙酰c o a 忆酰乙酰c o a 一3 羟3 甲基戊二酰c o a ( h m g c o a ) m 0 以还原鳓l 鲨烯卜5 磷酸甲羟戊酸内酯卜甲羟戊酸内酯 l 羊毛甾醇一2 ，4 脱氢胆固醇一胆固醇 图1 2 胆固醇的合成途径 f i g 1 - 2t h es y n t h e t i cp a t h w a yo fc h o l e s t e r o l 固醇的一个重要反应，合成途径如图1 2 。m o n a c o l i nk 的结构与h m g c o a 相 似，因此可以通过特异性对抗，阻碍胆固醇合成系统中的限速酶h m g c o a ( 3 一 羟基一3 甲基戊二酸单酰c o a ) 的还原酶活性。m o n a c o l i nk 这种对h m g c o a 还 原酶的特异性阻碍作用表现为竞争性抑制。此外，最新的研究还表明m o n a c o l i n k 具有加快胆固醇分解代谢的作用。人体内有8 0 的l d l ( 1 0 wd e n s i t y l i p o p r o t e i n ，低密度脂蛋白) 是通过细胞表面的l d l 受体清除的。该受体的合 成速度与细胞内胆固醇的含量成反比关系。因为m o n a c o l i nk 能有效抑制胆固 醇的合成，大大降低了肝细胞中胆固醇的浓度，从而刺激增加了肝细胞中的 l d l 受体，降低血浆中的l d l 水平 3 1 1 。再者，m o n a c o l i nk 能升高某些病人的 h d l c h ( 高密度脂蛋白胆固醇) 浓度，该物质能增加l d l 受体活性，进一步 加快了l d l 的分解代谢【，：l 。m o n a c o l i nk 还具有抑制l d l 和l d l 中脱辅基蛋 白a p o b 1o o 的合成作用，降低甘油三酯、脂蛋白等物质的合成和分泌 3 t i 。因 此，m o n a c o l i nk 不仅具有抑制h m g c o a 还原酶的作用，还可增加肝细胞表 面l d l 受体的表达，并具有升高h d l 浓度的作用，因此有很强的降低血清胆 固醇的作用，能治疗高脂血症。与此同时，m o n a c o l i n 类物质的高效性非常显 著，仅o 0 0 1 0 0 0 5 i t g m l 的浓度即可使胆固醇的合成受阻 2 3 1 ；而且对严重的 高胆固醇血症患者也极为有效，尤其具有优先降低对动脉粥样硬化作用明显的 l d l 胆固醇的作用 3 3 1 ；同时也可用来治疗糖尿病性高血脂症而不影响耐糖量。 韩梅( 19 9 4 年) 等用含m o n a c o l i nk 5 6 m g l 的红曲米饭提取液喂食高血脂病的大 白鼠( 18 0 - - 2 2 0 9 只) ，10 周后与对照相比，血清总胆固醇开始下降( p b c d ，即起始含水量的 影响最大，而对于m o n a c o l i nk 来说，影响因子a c b d ，也是起始含水量的 3 3 陕西科技大学硕十学位论文 影响最大。这更加说明了固体发酵中起始含水量是最关键的影响因素。根据以 上分析可以确定出，最适于产m o n a c o l i nk 的培养基组合是a l b 3 c 4 d 3 ，而最适 于产红曲色素的培养基组合是a l b 4 c 4 d 4 。由于正交试验中没有a l b 3 c 4 d 3 组，因 此追加该组试验得：色价值为1 4 0 7u g ，m o n a c o l i nk 为3 18 4m g g 。由于我 们试验的主要目的是多产m o n a c o l i nk ，因此我们选择水分5 5 、碳源3 号组 合、氮源4 号组合和无机盐3 号组合为最优培养基。 3 1 7 添加诱导剂对色素及m o n a e o