（生物化学与分子生物学专业论文）拟南芥pp2ca2基因功能的初步分析.pdf

硕l j 学位论文 摘要 蛋白磷酸化是生物体中重要的信号传导方式之一。由于编码激酶磷酸酶的基 因之间存在功能重叠现象，大多数磷酸酶的功能以及蛋白磷酸化与信号传导途径 的联系目前还不清楚。p p 2 c 是蛋白磷酸酶的一个分支，其生化性质、蛋白质组成 与结构都和其它磷酸酶显著不同，但在生物信号传递中扮演了重要角色，特别是 在a b a 信号传导中。a b a 在对外界压力的响应中发挥了重大的作用。a b a 参与调 节植物生长发育的许多重要方面，包括种子中蛋白质和脂质的合成，促进种子的 耐旱性和休眠以及抑制从胚胎发芽和植物再生转换的阶段。我们参考了许多有关 p p 2 c 的文献，发现关于p p 2 c 基因功能的深入研究报道较少。 在本研究中，我们通过筛选得到拟南芥p p 2 c a 2 基因缺失突变体的纯合子，通 过“双引物法”和半定量p c r 对其进行了鉴定。根据a r a b i d o p s i s o r g 网站提供的基 因芯片结果，考察了野生型中p p 2 c a 2 基因受a b a 和n a c l 胁迫诱导的变化规律， 结果表明，p p 2 c a 2 基因转录水平受到a b a 和n a c l 的诱导。我们还考察了p p 2 c a 2 基因的缺失对a b a 及胁迫信号途径相关基因表达量的影响，初步确定p p 2 c a 2 基 因在a b a 信号传递途径中的大概位置。通过对突变体和野生型的种子萌发率，根 长，气孔开度等表型的观察，以上生理学试验研究表明，突变体相对于野生型表现 出对外源a b a 和n a c i 的低敏感。胁迫条件下给于不同浓度的a b a ( 0 ，0 1 ，o 3 ， 0 6u m ) 处理后，当a b a 浓度大于0 3 u m 时，突变体种子的萌发率仍维持在 6 0 8 0 之间的范围内，而野生型种子萌发率明显低于突变体。进一步证明 p p 2 c a 2 基因作用于拟南芥a b a 胁迫应答信号途径，激活胁迫相关转录因子。 为了更深的探讨p 尸2 c 4 2 基因的功能，得到正向和反向的实验证据，在已经 获得t - d n a 插入突变体的基础上，我们尝试构建了p p 2 c a 2 基因分段过表达株系， 并对分段过表达子株系的种子萌发率，根长和气孔开度进行了测定与分析。这些 研究数据为p p 2 c 基因家族成员的生理功能分析提供了有价值的参考资料。 关键词：拟南芥；p p 2 c a 2 基因；脱落酸( a b a ) 信号传导；生理功能 a b s t r a c t p r o t e i np h o s p h o r y l a t i o ni so n eo ft h em o s ti m p o r t a n ts i g n a lt r a n s d u c t i o np a t h w a y s i no r g a n i s m m o s tf u n c t i o no ft h ep h o s p h a t a s ea n dt h er a l a t i o n s h i pb e t w e e np r o t e m p h o s p h o r y l a t i o na n ds i g n a l t r a n s d u c t i o np a t h w a y s a r en o tc l e a rb e c a u s eo tt h e s u p e r p o s i t i o nb e t w e e ng e n e s p p 2 c sa r ea m e m b e ro fp r o t e i np h o s p h a t a s e sf a m i l y ，a l l d i ti sd i f f e r e n tf r o mo t h e rp r o t e i np h o s p h a t a s e si nb i o c h e m i s t r yq u a l i t ya n d t h es t r u c t u r e h o w e v e r ，i tp l a y sa ni m p o r t a n tp a r ti ns i n a it r a n s d u c t i o np a t h w a y s ，a n di na b a s i g n a l t r a n s d u c t i o np a t h w a y sw h i c hp l a y sak e yr o l ei np l a n tr e s p o n s e st oa b i o t i cs t r e s s a b a r e g u l a t e sm a n ya g r o n o m i c a l l yi m p o r t a n ta s p e c t so fp l a n td e v e l o p m e n t ，i n c l u d i n gt h e s v n t h e s i so fs e e ds t o r a g ep r o t e i n s a n dl i p i d s ，t h ep r o m o t i o no fs e e dd e s i c c a t l o n t o l e r a n c ea n dd o r m a n c y ，a n dt h ei n h i b i t i o no ft h ep h a s et r a n s i t i o n sf r o me m b r y o n l c t o g e r m i na t i v eg r o w t ha n df r o mv e g e t a t i v et or e p r o d u c t i v eg r o w t h w eh a v er e a dm a n y l i t e r a t u r e sa b o u tp p 2 cg e n ef a m i l y ，a n df o u n dt h a tt h e r ew e r en o tm o r es t u d i e sa b o u t p p 2 cg e n ef a m i l y w ea c q u i r e dp p 2 c a 2t - d n ah o m o z y g o u s m u t a n tb ys c r e e n e da n d i d e n t i 行e dt h e mt h r o u g ht h e ”d o u b l e p r i m e rm e t h o d ”a n dt h er t - p c r a c c o r d i n g t ot h e r e s u i t so fg e n ec h i po na r a b i d o p s i s o r gw e b s i t e ，w es t u d i e dc h a n g e so f p p 2 c a 2g e n e i nw i l d t y p ea f t e ra b a a n dn a c ls t r e s st r e a t m e n t t h er e s u l ts h o w st h a t ，t h eg e n et r a n s c r i p t i o nl e v e lo fp p 2 c a 2b yt h ei n d u c t i o no f a b aa n dn a c l w ea l s os t u d i e dt h ee f f e c to no t h e rs t r e s s r e l a t e dg e n ee x p r e s s l o n i n a b a s i g n a lp a t h w a yc a u s e db y t h ed e l e t i o no fp p 2 c a 2g e n e s ow ei n i t i a l l yi d e n t i f i e d t h ep r o b a b l yt h el o c a t i o no fp p 2 c a 2g e n ei nt h ea b as i g n a l i n gp a t h w a y w eo b s e r v e t h ec h a n g e si np h e n o t y p es u c ha ss e e dg e r m i n a t i o nr a t e ，r o o tl e n g t h ，s t o m a t a la p e n u r e b e t w e e nt h em u t a n ta n dw i l d t y p e f o l l o w - u pt e s t o ft h ep h y s i o l o g i c a ls t u d i e sh a v e s h o w nt h a tm u t a n t sa r el e s ss e n s i t i v et oe x o g e n o u sa b a a n dn a c li ns e e dg e r m i n a t l o n a n dr o o te l o n g a t i o nc o m p a r e dw i t hw i l d t y p e a f t e rd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so f a b a ( 0 ， o 1 。o 3 ，o 6u m ) t r e a t e d ，w ed i s c o v e r e dt h a tw h e nt h ea b a c o n c e n t r a t i o nl sb i g h e r t h a n0 3 u m ，t h em u t a n ts e e dg e r m i n a t i o nr a t e w a ss t i l lm a i n t a i n e da tt h es c o p eo t 6 0 8 0 f u r t h e re v i d e n c es h o w e dt h a tt h er o l eo fp p 2 c a 2g e n er e s p o n s et os a l ta n d a b as i g n a l i n gp a t h w a y si na r a b i d o p s i s ，w h i c hp r o v e dt h a t i t sa c t i v a t i o nr o l ea sa s t r e s s r e l a t e dt r a n s c r i p t i o nf a c t o r i no r d e rt of u r t h e re x p l o r et h ef u n c t i o n s u b p p 2 c a 2g e n eo v e r e x p r e s s i o nt r a n s g e n i c i i i o fp p 2 c a2g e n e ，w et r yt oc o n s t r u c ta p l a n t ，a n a l y s i sw a sp r o c e e do nt h es e e d 颀l ：学位论文 g e r m i n a t i o nr a t e ，r o o tl e n g t ha n ds t o m a t a la p e r t u r ew i t ht h e o v e r e x p r e s s i o n m u t a n t s t h i sw o r kp r o v i d e ds o m ei n v a l u a b l er e f e r e n c e sf o rt h ef u t u r er e s e a r c hw o r k k e yw o r d ：a r a b i d o p s i s ；p p 2 c a 2g e n e ；a b as i g n a lt r a n s d u c t i o n ；p h y s i o l o g i c a l f u n c t i o n 、 i v 硕l j 学位论文 插图索引 图1 1a b a 信号转导途径7 图1 2蛋白磷酸酶的分类9 图2 1t - d n a 插入突变体的鉴定一2 l 图2 2 野生型中p p 2 c a 2 基因受a b a 胁迫诱导电泳图2 l 图2 3p p 2 c a 2t - d n a 插入突变体种子萌发对a b a 低敏感2 2 图2 4 不同胁迫下p p 2 c a 2t - d n a 插入突变体的种子萌发率2 2 图2 5 野生型和p p 2 c a 2 突变体在a b a 胁迫下的根长照片2 3 图2 6 野生型和p p 2 c a 2 突变体在a b a 胁迫下的根长比较2 3 图2 7p p 2 c a 2 突变体气孑l 开闭表现出对a b a 的低敏感2 4 图2 8 气孔开度测量2 4 图2 9胁迫下p p 2 酬2 基因的缺失对a b a 相关基因的影响2 5 图3 1b p 与l r 反应原理图3 0 图3 2入门克隆与目的载体l r 反应后构建成表达载体3 0 图3 3 过表达载p l e e l a 3 1 图3 4 分段过表达引物设计图3 4 图3 5即2 酬2 的基因分段克隆3 5 图3 6p p 2 c 彳2 的基因分段克隆半定量检测结果3 5 图3 7不同胁迫下分段过表达突变体种子萌发率3 6 图3 8 分段过表达植株p p 2 c a 2 0 x b 2 与野生型根长度的比较3 6 图3 9分段过表达突变体与野生型叶片下表皮气孔观察图3 8 图3 1 0 分段过表达突变体p p 2 c a 2 0 x b 2 和野生型气孔开度变化3 8 拟南芥p p 2 c a 2 转1 1 功能的初步分析 附表索引 表1 1 半定量检测引物2 0 表3 1 分段克隆引物35 硕 j 学位论文 c o l p p 2 c a m p k a b r e s o s a b i k i n a b a g a d n a s ei n a d h 野生哥伦比亚型 蛋白磷酸酶2 c 缩略词 c o l u m b i a p r o t e i np h o s p h a t a s e2 c a m p 激活的蛋白激酶a m p - a c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s e a b a 应答因子 盐超敏感 a b a 不敏感 激酶 脱落酸 赤霉素 脱氧核糖核酸酶i a b a r e s p o n s i v ee l e m e n t s a l to v e r l ys e n s i t i v e a b a i n s e n s i t i v e k i n a s e a b s c i s i ca c i d g i b b e r e l l i n d e o x y r i b o n u c l e i ca c i de n z y m ei 还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸n i c o t i n a m i d ea d e n i n e r n a s ef r e e 无核糖核酸酶 m m l v m r n a l m p c r d d h 2 0 3 5 s m p m m m s h h r m l n m l “l 莫洛尼鼠白血病病毒 信使r n a 逆转录聚合酶链式反应 双重蒸馏水 花椰菜花叶病毒3 5 s 启动子 摩尔 微摩尔 毫摩尔 秒 小时 小时 分钟 毫升 微升 x r i b o n u c l e i ca c i de n z y m e f r e e m o l o n e ym u r i n el e u k e m i av i r u s m e s s e n g e rr n a r e v e r s e - t r a n s c d p t i o np o l y m e r a s ec h a i nr e a b t i o n d o u b l ed i s t i l l e dw a t e r c a m v3 5 sp r o m o t e r m o l m i c r o m o l e m i l l i m o l e s e c o n d h o u r h o u r m i n u t e m i l l i l i t r e m i c r o l i t r e 硕十学位论文 第1 章绪论 环境胁迫是限制植物生长和作物产量的重要因素，而水分亏缺又是对植物生 长最不利的因素之一。植物在长期的进化过程中形成了一系列的信号转导机制来 避免引起水分亏缺。已有大量的研究结果表明，植物激素a b a 参与了包括种子萌 发、休眠、营养器官发育以及胁迫耐受性等多种生理功能。其中，蛋白质的磷酸 化和去磷酸化在a b a 参与的信号转导途径中发挥重要的功能。目前在植物中已确 定了多种蛋白激酶和蛋白磷酸酶i l l 。有关蛋白激酶方面的研究较多，而蛋白磷酸酶 方面的研究较少，现有的研究己发现蛋白磷酸酶和蛋白激酶一样被受到严密的调 控，同样对生物体内的有关代谢起重要的调节作用。 1 1 脱落酸的生理功能与信号转导 1 1 1 脱落酸的发现 脱落酸( a b a ) 最早是在成熟的干棉壳中分离纯化得到的，w c l i u 等研究发现 它能使棉花幼龄脱落，认为它是一种“脱落素”。c f e a g l e s t 2 j 等从桦树中提取出了一 种抑制生长诱导休眠的物质，命名为“休眠素”。后经鉴定，二者为同一化学物质，最 终被定名为脱落酸【3 1 。 1 1 2 脱落酸在植物体内的分布及生理功能 a b a 在植物体内广泛存在，在植物体的不同部位分配存在着差异，正常植株中， 根系比叶片往往含有更多的a b a 。在细胞水平上，水分充足时细胞内a b a 呈均匀 分布【3 4 】。放射免疫分析表明细胞溶质、核叶绿体和细胞壁中都存在标记a b a ，并 且标记量没有差异【5 】。干旱导致a b a 重新分布：法国薰衣草受胁迫后( 2 6 m p a 水 势) ，叶片总a b a 的鲜重从9 0 0 p m o l g 增加至1 1 3 6 0 0 p m o l g 鲜重，其中细胞壁a b a 水平 增i j h t 4 倍，增值最多。还有科研人员发现干旱使质外体a b a 水平增加【6 】。最初有人 认为是由于叶绿体膜破裂导致a b a c i - 泄，但后来研究发现叶绿体和核a b a 都有增 加( 分别为2 倍和3 倍) 。 r e n s b u r g l 4 】则报告胁迫下植物叶绿体a b a 含量没有改变，因此质外体a b a 浓 度增加可能使根的释放量或合成增 j 口1 3 , 7 】。a b a 在植物体内的作用大致可分为两 类： 1 作为植物发育的重要调节物质参与调控植物发育的诸多重要过程 ( 1 ) 促进休眠。外用a b a 时，可使生长旺盛的枝条停止生长而进入休眠。 ( 2 ) 促进气孔关闭。a b a 可引起气孔关闭，降低蒸腾，这是a b a 最重要的生理 拟南芥p p 2 c a 2 肇冈功能的初步分析 效应之一，k c o r n i s h 8 】发现水分胁迫下叶片保卫细胞中的a b a 含量是正常水分条 件下含量的18 倍。a b a 促使气孔关闭的原因是它使保卫细胞中的钾离子外渗，造成 保卫细胞的水势高于周围细胞的水势而使保卫细胞失水所引起的。a b a 还能促进 根系的吸水与溢泌速率，增加其向地上部分的供水量。 ( 3 ) 抑制生长。a b a 对种子萌发和植株生长都有抑制作用【9 1 。其抑制效应比植 物体内的天然抑制剂一酚强。二者抑制响应不同之处在于，酚类通过毒害作用进而 抑制植物生长，该过程不可逆；a b a 的抑制效应是可逆的，一旦外源a b a 除去，抑 制效应不存在。 ( 4 ) 促进离层的形成，进而引起器官脱落。 2 a b a 作为触发植物对逆境胁迫应答反应的传递体 参与调控植物对逆境胁迫，如干旱、高盐、低温等产生的应答。 1 1 3a b a 相关基因及蛋白功能 a b a 受体虽然还没有找到，但是a b a 相关信号转导途径已经取得一定的研究 成果。通过筛选a b a 敏感或是不敏感突变体的方法，得到了一些相关基因，也了 解了其编码的蛋白的一些信息。 a b a 诱导基因编码的蛋白大致分为两类： 1 功能蛋白 即在胁迫忍耐中起作用的蛋白。如胚胎晚期富集( l e a ) 蛋白、热休克蛋白、 k i n 蛋白、渗透蛋白、渗透保护物质生物合成相关蛋白、糖代谢相关蛋白、糖转 运蛋白、解毒酶、蛋白酶、衰老关联蛋白、蛋白酶抑制因子、脂类转移蛋白。l e a 蛋白和热休克蛋白参与保护大分子物质以及生物膜，脯氨酸和糖类起着渗透剂的 作用，以免细胞脱水。k i n 蛋白可能有抑制冰晶的形成的独特能力。糖转运蛋白的 功能是促进糖在质膜和液胞膜上的运输，调整胁迫条件下的渗透压。解毒酶，如谷 胱甘肽s 转运酶，参与保护细胞免受活性氧的侵害。蛋白酶包括半胱氨酸蛋白酶， 是蛋白代谢和氨基酸再循环中所必需的酶。干旱胁迫能加速叶片衰老，其特征为 许多亚细胞结构变化，包括蛋白酶活性增加。蛋白酶抑制蛋白可能对蛋白酶具有防 卫功能。脂质转移蛋白和脂肪酸代谢相关蛋白可能在修复胁迫损害的膜上或者膜 脂质构成的改变上起作用，也许具有调整有毒离子的渗透性和流动性的功能。 2 调节蛋白 即参与调控信号转导和在胁迫反应中起作用的基因表达的蛋白因子。主要是 多种转录因子、蛋白激酶、蛋白磷酸酶和其它信号分子，如钙调素相关蛋白或钙 联蛋白。s e k i 等【1 0 】在拟南芥中已发现了2 2 种转录因子家族，它们调节了一些胁迫 诱导基因的反应。 硕l 学位论文 1 1 - 4a b a 与蛋白质的可逆磷酸化 在a b a 信号转导中去磷酸化与磷酸化同样重要，l e u n g 等【1 1 1 采用a b a 不敏感 型的拟南芥研究a b a 应答基因a b i l ，并对其进行克隆，结果它能编码一种信号蛋白， 此种蛋白的羧基端控制区是s e t t h r 磷酸酯酶2 c ，氨基端延伸出e f 手形的c a 2 + 结合 位点，从而表明a b l l 蛋白是一种钙离子调节的磷酸酯酶，它通过磷酸化反应连接 a b a 多j c a 2 + 之间的信号传递。m e y e r 1 2 1 与l e u n g 等1 1 1 同时见至j j a b l l 基因编码产物与 经典的s e r t h r 蛋白磷酸酯酶有同源序列，并有a t p ( 或g t p ) 结合位点和氨基端延 伸出的c a 2 + 结合位点。l e u n g 等【l3 】以另一种a b a 不敏感型突变体为材料进一步证实 a b l 2 基因与彳b ，卜一样能编码涉及信号转导的p p 2 c 。h e i m o v a a r a d i j k s t r a 1 4 l 等的实 验结果表明，有三种磷酸酯酶抑制剂能明显抑隹j w j a b a 诱导的基因表达，同时使膜 上两种分子量接近4 0 0 0 0 的蛋白质超磷酸化，他们以抗磷酸酪氨酸的抗体证实，这 两种蛋白质的等电点变化与两种酪氨酸蛋白等电点变化一致，因此认为a b a 信号 转导除有含s e r t h r 的蛋白外，还有含酪氨酸的蛋白质的磷酸化去磷酸化参与。 1 1 5a b a 信号转导途径 1 1 5 1a b a 依赖型非依赖型转导途径 a b a 不仅与非生物胁迫相关，例如光信号，与生物胁迫也有一定关联，例如植 物抗病。所以可推测a b a 信号转导途径是一个复杂的信号转导网络。 就目前研究的结果来看，a b a 为基因表达的调控基因的转录调控是依赖于 d n a 序y u ( ；t l 页式作用因子) 和蛋白质( 反式作用因子) 的相互作用实现的，a b a 通过影 响这种相互作用来调节基因的表达水平。根据不同路径对a b a 的依赖性，可以大 致分为两类： 1 a b a 依赖型信号转导途径 其表达依赖于内源a b a 的积累或外源a b a 的处理。如许多种子贮藏蛋白基因， 其表达依赖于种子发育过程中内源a b a 的积累，随着内源a b a 的增加而加强，随着 内源a b a 的降低而减弱，外源a b a 处理也可促进其表达，在离体条件下则完全随 外源a b a 量的变化而变化【15 1 ，拟南芥中发现的逆境胁迫诱导基 r a b l 8 t 1 6 1 和r d 2 2 ， r d 2 9 1 7 1 等。 2 a b a 非依赖型转导途径 其表达除受a b a 的影响外，还受其它因子( 干旱、低温等) 的影响，在无a b a 存在时对其它因子照常起反应，即a b a 的存在对其表达并不是必须的，这一类包 括大部分胚胎发生晚期丰富表达的l e a 基因以及逆境胁迫诱导基因。 a b a 诱导基因的表达与逆境胁迫存在着重要的交互作用。当植物受到干旱、 低温、高盐等逆境胁迫时，细胞内a b a 含量迅速增加，促使大量a b a 诱导基因表达。 目前已发现l5 0 多种基因的表达可为外源a b a 所诱导，其中大多数基因在种子后 拟南芥p p e c a 2 幕冈功能的初步分析 熟期或植物器官对逆境胁迫应答中表达【1 8 】。逆境胁迫也会产生其它逆境信号，不 通过a b a 的作用促使大量a b a 非依赖型诱导基因的。 在脱落酸信号传导途径中，正调控因子及负调控因子的协同作用对脱落酸的 应答有重要影响。因此，鉴定和描述脱落酸调控的基因以及与它们有关的目标蛋 白质和调控因子将有助于发现脱落酸信号传导通路中新的信号分子，揭示脱落酸 信号传导的分子机制。通过鉴定响应胁迫信号的特定组分或基因，己初步构画出从 逆境胁迫信号的猝发到逆境基因表达整个信号转导途径的框架。在a b a 调控胁迫 相关基因表达的信号转导途径中，a b a 对其下游响应基因的调控主要是转录水平 的调控，与之相关的信号转导组分成员主要包括a b i 家族的多个成员，脱落酸不敏感 型蛋白质1 和2 ( a b l l 、a b l 2 ) 是脱落酸信号传导过程中最关键的调控因子i l 圳对脱 落酸应答的影响包括基因表达调控、离子通道活性以及代谢途径1 2 ，是揭示脱落 酸信号传导网络系统的良好例证。近年来，在拟南芥脱落酸不敏感型突变体中发 现了1 0 0 0 多个被脱落酸调控的基因【2 1 1 ，反映出脱落酸不敏感型蛋白质a b l l 、a b l 2 在脱落酸信号传导过程中的中心地位。因此，筛选和鉴定a b l l 、a b l 2 的相互作用 蛋白质，对脱落酸信号传导过程中新的信号分子以及调控因子的发现、基因表达 与调控、蛋白质相互作用及其作用的分子机制有重大意义。 研究表明，所有a b a 应答基因均具有真核生物的特征，即启动子区域有 t a t a b o x ，c a a t b o x 和p o l y a 端，含有1 个或多个内含子等，而且在基因上游存 在激素调控表达所需要的敏感区，即顺式作用因子，反式作用因子可与其结合从 而调节基因的转录。a b a 应答基因的顺式作用因子均含有相同的a c t g 核心序列， 它是反式作用因子的结合位点，这一序列在多种a b a 诱导的启动子中是保密的， 而且在受到起来信号( g a 、生长素、乙烯) 诱导的启动子中也是保密的。在许多植 物基因中，顺式作用因子和反式作用因子的微小变化可能导致它们之间作用方式 在时间和空间上发生变化，因此多种顺式作用元件和反式作用因子的结合构成了 复杂的调节系统和基因调控的模式【2 2 1 。 反式作用因子是a b a 信号转导途径中最重要也是最难鉴定的组分，实验表明 结合a c g t 核心元件的蛋白质大多数含有类似于亮氨酸拉链的区( b z i p p r o t e i n ) 。 目前已分离了多种因子，如e m b p 1 、t a f - 1 、a b l 3 、v p i 等1 2 引，进一步研究发现 它们具有相似的结构。e m b p 1 能够特异性地与a b a 反应元件( a b r e ) 的8 个碱基 相互作用，功能分析表明该蛋白是e m b p l 基因上受a b a 调节的一种转录激活因 子f 2 4 , 2 5 , 2 6 】。在许多植物基因中，顺式作用元件和反式作用因子的微小变化可能导 致它们之间作用方式在时间和空间上发生变化。实验表明，只要替换反式作用因子 的2 个氨基酸，即可导致它结合在不同d n a 序列上f 2 4 】。多种结合域( 顺式作用元 件) 和反式作用因子的结合构成了复杂的调节系统和基因调控模式。 硕十学位论文 1 1 5 2 保卫细胞的a b a 信号转导途径 植物叶片表面由一对保卫细胞构成的气孔调节植物与环境间的水分与气体交 换。气孔的开闭运动过程对环境条件的变化均有灵敏和准确的反应。在过去几十 年中，气孔保卫细胞一直是植物生物学家研究高等植物细胞信号转导的模式材料。 作为模式材料，保卫细胞有其独特的结构和生理意义：首先，它与高等植物 的其它大多数细胞不同，成熟的保卫细胞缺乏具有生理功能的胞间连丝，因而与 其周围的细胞是分离的，这种分离便于对单个细胞直接进行测定【2 7 】；第二，保卫 细胞能对多种刺激如光( 红光和蓝光) 、空气湿度、脱落酸、生长素等迅速作出反应， 这些刺激可迅速改变离子的运输，引起无机渗透势的变化，并且同时发生保卫细 胞体积的改变1 2 8 , 2 9 】。 已有实验表明，a b a 可以刺激细胞质中c a 2 + 浓度升高。g r a b o v 等【3 0 】利用钙的 荧光指示云t j f a r a 2 发现a b a 能诱导鸭跖草下表皮细胞的胞质中游离c a 2 + 浓度迅速 升高。这种升高现象比气孔关闭现象更早。但是在缺钙的条件下，a b a 几乎不抑 制气孔的开放，这表明在保卫细胞内存在依赖c a 2 + 信号的转导途径。但也有报道 认为a b a 引起气孔关闭并没有【c a 2 + 】。v 。增加的现象，说明存在着不依赖c a 2 + 的a b a 信号通路1 2 。 a b a 处理可以导致保卫细胞原生质体中4 ，5 二磷酸磷脂酰肌醇( p i p 2 ) 水平迅 速降低和l ，4 ，5 一三磷酸肌醇( i p 3 ) 的升高。在甜菜中，既使c a 2 + 由液泡释放出去，增 加胞质中c a 2 + 的浓度，又使质膜内向k + 通道关闭，减少胞质中k + 的浓度，从而诱 导气孔关闭【2 。另外有实验证实蚕豆保卫细胞质膜上存在g 蛋白，利用g 蛋白激活 剂可促进i p 3 水平升高，表明g 蛋白活化磷脂酶c ，提高了i p 3 的水平【3 ，因此g 蛋白 可能处于a b a 诱导气孔关闭的信号转导途径的上游。 保卫细胞中还存在不依赖c a 2 + 而依赖h + 的a b a 作用途径，p h 梯度可调节叶片 中a b a 的分配和浓度，从而调节气孔的开度，因此h + 也可能是保卫细胞中的一个 信使物质【32 1 。此外还有报道认为磷脂酶a 2 可以激活保卫细胞质膜k + 通道，并据此 推测与磷脂酶a 2 相关的耦联系统也参与保卫细胞a b a 信号转导【33 1 。另外利用膜片 钳技术发现蛋白磷酸化与脱磷酸化也参与气孔的信号转导【2 引。 另外，模式植物拟南芥似r a b i d o p s t h a l i a n a ) 的应用也为人们深人研究这一信号 转导过程提供了方便。到目前为止，有关a b a 对气孑l 运动调节的轮廓已初步勾画 出，即a b a 与膜受体结合，产生肌醇三磷酸( i p 3 ) 和环腺苷酸二磷酸核糖( c a d p r ) ， 以激活胞内钙库中c a 2 + 的释放，同时胞# l - c a 2 + 也可经过质膜上的c a 2 + 通道内流，从 而使胞内c a 2 + 浓度( c a 2 + 】i ) 升高；另夕i a b a 还可诱导胞质碱化( p h 升高) 。胞内 c a 2 + 】i 和p h 升高可通过调节胞内蛋白激酶蛋白磷酸酶的活性而调节质膜上相关的离子 通道，如激活质膜上阴离子通道( a n i o nc h a n n e l s ) 和k + 外流通道( k + c h a n n e l s ) 、钝化 拟南芥p p 2 c a 2 基冈功能的初步分析 k + 内流通道( k + c h a n n e l s ) ，从而诱导气孔关闭或抑制气孔开放。但这些因子在a b a 信号转导中的时序在不同植物中可能还有一定的差异。 综上所述，保卫细胞中a b a 的信号途径大致是：a b a 与质膜上受体结台，激 活g 蛋白，g 蛋白再括化磷脂酶c 而导致的释放。一方面促使c a 2 + 从胞内钙库液泡 释放进人胞质，另一方面促进胞外c a 2 + 通过阳离子通道进人胞质，引起胞质d p c a 2 + 浓度升高。c a 2 + ( 或h + ) 激活外向k 十通道和阴离子通道，关闭内向k + 通道，调节阴 阳离子流动，降低细胞膨压i 最终诱导气孔关闭或抑制气孔开放【34 1 。 1 1 6a b a 信号转导途径模式 a b a 在不同植物体内可以通过不同的途径调控多种酶的活性、离子通道和基 因的表达。而这些多样的信号途径之间又以不同方式的相互交叉联系，形成复杂 的信号网络系统。不同植物的代谢途径可能不同，同种植物的不同发育阶段也可 能不同。近年来，对a b a 信号转导机制的研究进展很快，但对于控制累积的外部 信号感知、上游信号转导、r o s 产生以及糖感知等的了解还相对较少。一种胞外 刺激所引起的主要信号传递途径通常会影响其它途径，而产生多种效应，从面调 节基因表达，发生生理反应。不同的a b a 信号转导途径可以归纳为以下途径。( 如 图1 1 ) p h 一a b l l 。a b l 2 _ a 8 a a 8 a 嘲o f 。7 g 嗣叫阮州 瑚滋沁霞夏竺= 孙l 表迓 、 2 ；凝钐5 j c a d p r c a2 串一_ 图1 ia b a 信号转导途径【2 5 】 1 2 蛋白质的磷酸化与去磷酸化 1 2 1 植物中的蛋白磷酸酶 蛋白质的磷酸化和去磷酸化在生物体内的各种信号传导中有着重要的地位， 对生物的生长、发育、分化等方面发挥了重要的调节作用。蛋白质的可逆磷酸化 在控制细胞对胞外刺激的反应过程中的重要性已经得到广泛的认知，而且细胞的 生长、发育、分化及许多其他的受到信号转导调控的生理学反应大多都建立在磷 酸化和脱磷酸化的基础之上。多数蛋白磷酸酶和蛋白激酶受到了精确的调节，许 多蛋白磷酸酶位于信号转导途径的下游或是末端，为信号调节的对象，这也进一 硕士学佗论文 步说明了蛋白磷酸酶的重要性【3 5 。 蛋白质的可逆磷酸化反应对于信号的快速、精确传递起着无可替代的作用。 目前，越来越多的人研究蛋白磷酸酶，同时发现蛋白磷酸酶和蛋白激酶一样在信 号传导特别是在由外界环境所胁迫的信号途径中同样起到了重要的调控作用，并 且两者之间相互协调，相互依存，两者不可或缺1 3 6 1 。 1 2 2 蛋白磷酸酶的分类以及结构特性 蛋白磷酸酶根据底物专一性可以分为两大类，即丝氨酸苏氨酸蛋白磷酸酶 类( p s p s ) 和酪氨酸蛋白磷酸酶类( p t p s ) t 3 7 】。p s p s 根据催化亚基的不同以及对特 定抑制剂的不同敏感度又可以分为p p l 和p p 2 两类。p p l 对哺乳动物磷酸化酶激酶d 亚基的去磷酸化活力较高，受内源蛋白抑制物i 1 和i 2 的抑制，该酶的催化亚基可 单独存在，无需与特定调节亚基的结合。p p 2 类根据亚基的结构、活力及对二价阳 离子的依赖性又可以进一步分为p p 2 c 、p p 2 a 和p p 2 b 。p p 2 a 的活性不依赖于二价 阳离子；p p 2 b 是迄今发现的惟一依赖于c a 2 + 的蛋白磷酸酶，由一个催化亚基和一 个调节亚基构成；p p 2 c 是一种单体蛋白磷酸酶，其活力依赖于m 9 2 + 或者m n 2 + 【3 8 1 。 根据氨基酸序列以及高级结构的不同，p s p s 又可分为2 个家族：蛋白磷酸酶p 家族和蛋白磷酸酶m 家族。p p l 、p p 2 a 和p p 2 b 催化亚基的氨基酸序列具有同源性， 均属于p p p 家族。p p 2 c 与p p p 家族的其他成员在序列上没有相关性，它与位于线粒 体上的丙酮酸脱氢酶磷酸酶和另外一些丝氨酸，苏氨酸蛋白磷酸酶组成p p m 家族。 而蛋白酪氨酸磷酸酯酶又分为只有一个催化结构域的小的可溶性蛋白( 胞质型或 非受体型) 和有2 个串联的胞浆催化结构域的大的跨膜蛋白( 受体型) 两类。( 见 图1 2 ) 在真核生物细胞内，所有p p 2 c 的一个共同特点是在蛋白质的n 端或c 端含有一 个包括11 个保守基序的活性催化区域。此外，一些p p 2 c 蛋白还具有一些与细胞内 的信号转导有关的基因序列，其中包括一些跨膜区域以及能够与蛋白激酶互作的 区域，例如在有丝分裂原激活对蛋白激酶( m a p k ) 中发现的激酶互作基序k i 。在 拟南芥中，由a b l l 基因编码的p p 2 c 包含1 个从蛋白的n 末端到催化区域的1 个与2 价 钙离子结合的e f 手臂基序。而其他的p p 2 c 同源物如拟南芥k a p p ( k i n a s e 2a s s o c i a t e d p r o t e i np h o s p h a t a s e s ) ，则包括3 个基序：1 个n 末端膜定位信号序歹l j ( m e m b r a n ea n c h o r ) ， 1 个类似受体激酶互作结构域( r l k ) 和1 个c 末端催化结构域。 到目前为止，在人类基因组中大约发现了1 5 个p p 2 c 类蛋白，在线虫中大约有8 个，在果蝇中有1 0 个，酵母菌中仅有7 个，而在拟南芥植物中有近7 6 个，表明植物 的p p 2 c 较其他的真核生物具有更大的多样性。而拟南芥由于其富含p p 2 c 类基因 而因此被广泛用作实验材料1 3 5 1 。 拟南芥p p 2 c a 2 皋【大l 功能的初步分析 1 2 3 1 植物中的蛋白磷酸酶2 c 家族 植物中的蛋白磷酸酶非常丰富，并且在植物的各种信号途径中发挥了重要的 作用。而2 c 类蛋白磷酸酶是蛋白磷酸酶中非常重要的成员，其参与许多关于脱落 酸信号传导作用途径。像种子的萌发，根、茎的延长，花朵的开放，果实成熟以 及耐干旱等等都有p p 2 c 的参与，因而研究p p 2 c 有着重大的意义 3 9 , 4 0 】。 1 2 3 2p p 2 c 蛋白磷酸酶的功能 p p 2 c 蛋白磷酸酶参与各种信号的调节作用，特别是在有关a b a 信号途径的调 节。而a b a 众所周知，调节生物生长发育的很多方面。高等植物中p p 2 c 广泛参与 a b a 调控的各种信号途径，包括a b a 诱导的种子萌发休眠、幼苗根系的伸长、 保卫细胞及离子通道调控和气孔关闭、逆境胁迫等。p p 2 c 还参与植物创伤反应、 生长发育以及抗病原菌侵害等多种途径。新近的研究表明，植物中p p 2 c 可能在许 多信号转导途径中作为负调控因子，在调节由环境胁迫如冷害、干旱、损伤等激 活的信号通路中起作用【4 。 蛋自磷酸酶 蛋白酪氨骏磷骏酶( p t p s ) 双专化磷款骜( d s p s ) 厂货臼矮酸酶i ( p p l ) 、 | i 2 a ( p p 2 a ) 蛋f 磷酸酶p ( p 9 即 蛋f 1 丝氨酸，协氨羧磷骏酶( p s p a ) | 蛋白磷羧酶2 b ( p p 2 b ) j | 蛋f l 磷酸酶2 e ( 1 9 2 e )1 o 丝氨酸苏氨酸磷酸酶( s t s ) ”蛋自磷酸酶( f 雕) 图1 2 蛋白磷酸酶的分类【3 】 1 p p 2 c 参与a b a 调控的种子休眠萌发信号途径 在拟南芥和玉米的a b a 缺陷或不敏感突变体中，种子出现早期萌芽现象。并 且发现a b a 合成抑制剂能够降低一些物种中发育种子的休眠水平。这些都说明 a b a 抑制种子的萌发。但同时我们也可以根据这点对种子进行定向诱导突变获得 对a b a 不敏感突变体系列。现已经获得并克隆了不敏感突变体( a b i l a b i 5 ) ，同 时发现a b l 3 、a b l 4 、a b l 5 编码转录因子，而a b i l 和a b l 2 都编码p p 2 c 1 2 , 1 3 j 。 a b l l 调控因子回复突变体是由于p p 2 c 催化结构域内的错义突变而造成的，突变 硕一l - 学位论文 后其蛋白丧失酶活性。由于回复突变株是隐性的，且在种子休眠与干旱适应性上 对a b a 更为敏感，丧失功能的a b l l 基因导致植物对a b a 适应性增强，这更进 一步说明p p 2 c 参与了种