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药物敏感性试验 比例法 1 比例法原理 对照培养基 drug free 含药培养基 所有菌落均生长 仅耐药菌生长 2 3 目的 用于诊断耐药结核病结核病治疗方案的选择用于耐药监测 药敏试验的基本步骤 含药培养基的制备 购置成品菌液制备和稀释接种培养报告结果 4 自制含药培养基 药物采购 药液制备 保存基础培养基的制备含药培养基的制备 5 Proportion WHO推荐DST浓度 6 含药培养基的制备 药物储存液的制备 在无菌容器内称取少量药物粉末 按不同药物出厂标定的效价精确计算其有效含量 计算每种药物应加入的溶剂体积 使得药物浓度为 INH20 g ml SM400 g ml RRP4000 g ml EMB200 g ml INH SM和EMB用灭菌蒸馏水溶解 RFP用少量二甲基甲酰胺溶解后加灭菌蒸馏水至所需量 制成储存液 分装冻存 备用 7 含药培养基的制备 基础培养基 无淀粉改良罗氏培养基 天门冬素3 6g 或谷氨酸钠7 2g KH2PO42 4gMgSO4 7H2O0 24g枸橼酸镁0 6g丙三醇12ml蒸馏水600ml新鲜鸡卵液1000ml2 孔雀绿20ml 8 含药培养基的制备 基础培养基制备 盐溶液 精确称取各盐类成分 加蒸馏水600ml 沸水浴溶解 待冷后 加入丙三醇和2 孔雀绿 混匀 鸡卵液 将新鲜鸡卵洗净 用75 酒精纱布擦拭消毒后打碎 搅匀 经消毒纱布过滤 定量至1000ml 培养基基础液 将过滤后的鸡卵液加入盐溶液中 充分混匀 静置约1小时 9 含药培养基的制备 每次制备培养基前取出1管储存液 室温融化 按实际需要量每100ml基础培养基中加入1ml药液 充分混匀 分装至螺旋盖无菌培养管 每管7ml 斜置培养基蒸汽凝固灭菌器内 85 凝固50分钟 即制成含药培养基 凝固灭菌后的培养基自然冷却后 置35 37 孵育24小时 检查培养基污染情况后置4 保存 1个月内用毕 10 菌悬液制备 准备磨菌瓶磨菌瓶为带有可密封螺旋盖的玻璃小瓶 装入约10个直径3mm的玻璃珠 高压灭菌后待用 11 菌悬液制备 磨菌瓶法 在磨菌瓶中加入1 2滴5 吐温 80 用无菌吸管尖端或灭菌接种环刮取2 3周的新鲜菌落 置于磨菌瓶中 注意尽可能刮取多处的菌落 旋紧瓶盖 在涡旋振荡器上混旋约20 30秒 12 取菌 13 磨菌 14 接触所有菌落 程序 SteriledistilledWater或5 吐温80 玻璃珠 涡旋 静置15min 转移上清至比浊管 15 菌悬液制备 磨菌瓶法 加入灭菌的生理盐水 直至其浊度与标准麦氏比浊管 MacFarlandNo 1 一致 即得到1mg ml的菌液 0 1mlof1 BaCl2 9 9mlof1 H2SO4 16 菌液稀释 菌悬液静置片刻 使其中的颗粒或菌块沉淀 用22SWG标准接种环或微量吸管无菌操作逐步稀释至10 2mg ml和10 4mg ml 22SWG标准接种环 金属丝直径0 7mm 接种环内径3mm 1满环移液0 01ml 17 稀释菌 McFNo 1 DW2ml DW2ml 0 02ml 1mg ml 10 2 10 4 GC H R S E 0 01ml 10 4mg 10 6mg 0 02ml 18 悬浮分散菌 分散前 分散后 19 接种及培养 用22SWG标准接种环分别取1环 即0 01ml 10 2mg ml和10 4mg ml的菌液 用划线法均匀接种至对照及含药培养基表面 应注意使菌液尽可能均匀分散于培养基斜面 最终接种菌量为10 4mg和10 6mg 接种后的培养基置于37 培养 至四周后报告结果 20 取菌液 21 结果报告 按以下方式记录菌落生长情况 少于50个菌落 实际菌落数50 100个菌落 1 100 200个菌落 2 大部分融合 200 500个菌落 3 融合 大于500个菌落 4 22 结果报告 计算耐药百分比 含药培养基上生长的菌落数耐药百分比 100 对照培养基上生长的菌落数若耐药百分比大于或等于1 则认为受试菌对该抗结核药耐药 23 结果判读 对照IsoniazidEthambutolInoculum10 2 310 42690 resistant34 60 1InterpretationResistantSusceptible 24 质量控制 若高稀释度菌液 10 4mg ml 低接种菌量 在对照培养基上生长的菌落数少于20个菌落 则应从对照管传代培养 重复试验 每批实验均需增加H37Rv标准菌株 若标准菌株生长异常 则本批实验结果全部无效 25 注意事项 选择新鲜 生长旺盛的菌落进行药敏试验 生长不良或陈旧菌株应传代后再进行试验比浊 菌液稀释应力求精确 以保证接种菌量的准确 下列操作应严格按技术规范进行 防止产生气溶胶 挑取菌落 磨菌 菌液稀释和接种 烧灼接种环 26 实验室安全 实验室合理布局涡旋振荡 接种时容易产生气溶胶 应注意正确操作振荡后不能立即打开瓶盖 需静置片刻接种时禁止反复吹吸操作中一旦标本溅落 立即以5 石炭酸覆盖 至少30分钟 27 比例法药敏试验流程 基础液改良L J 对照培养基 含药培养基 药物储存液 混合 摇匀 100ml 1ml 磨菌 分装凝固 分装凝固 1mg ml菌悬液 10 4mg ml 10 2mg ml 100倍稀释 100倍稀释 接种0 01ml 接种0 01ml 2 3周新鲜菌落 28 练习 结果的解释 29 初步菌种鉴定 30 基于培养的检测 生长速度是否产生色素生长温度典型形态选择性抑制 PNB培养基 31 生长速度 快速生长 1周内不是TB生长缓慢 通常3周 有时达到6周可能为TB 32 生长温度 孵育 36 1 CM tuberculosis在过低或过高的环境下均不生长42 C蟾分枝杆菌 33 色素产生情况 不产生色素TB产生色素 非TB 34 菌落形态 M tuberculosis 35 菌落形态 M chelonae 龟型分枝杆菌 M Phlei 草分枝杆菌 36 PNB选择性培养基 对照培养基含PNB培养基 37 C孵育 28天后报告结果 药敏试验时选择10 2稀释浓度菌液用滴管或移液器接种0 1ml 2 3滴 37 PNB选择性培养基 结果报告对照培养基和PNB培养基上均生长非结核分枝杆菌复合群NTM对照培养基上生长很好 但PNB培养基上未生长或几个菌落结核分枝杆菌复核群对照和PNB培养基上均未生长不能判读结果需重做 38 非结核分枝杆菌复合群 NTM 非结核性分枝杆菌 NTM 系指分枝杆菌属中 除结核分枝杆菌复合群 人型 牛型 非洲型和田鼠型结核分枝杆菌 和麻风分枝杆菌以外的分枝杆菌 由NTM引起的疾病称为非结核性分枝杆菌病 近年来由于检出率逐渐增多 相应的对其引起的各种疾病的认识也在逐渐提高 非结核性分枝杆菌中大多数为腐物寄生菌 毒力低 属于条件致病菌 非结核性分枝杆菌病的症状可有肺内 肺外之分 肺外感染可涉及皮肤 骨骼和淋巴结等 39 NTM广泛分布于自然界的土壤 尘埃 流水和生牛奶中 显微镜下NTM形态与结核杆菌相似 抗酸染色呈红色 但在培养 生化特性与结核杆菌不同 非结核分枝杆菌特点 40 非结核分枝杆菌特点 非结核分枝杆菌是否有致病性可用抗煮沸试验加以区别 非致病株煮沸1min即失去抗酸性 而致病株能耐10min 甚至高压灭菌亦不失去抗酸性 结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的鉴别 除热触酶试检外 可将菌苔置含盐水小滴的玻片上研磨 前者不易乳化而后者容易乳化 41 由于许多非结核分枝杆菌菌株对常用的异烟肼 链霉素等耐药 但对利福平有一定敏感性 现多主张用利福平 乙胺丁醇和异烟肼联合使用 溃疡分枝杆菌则仅对卡那霉素等氨基糖苷类抗结核菌药物敏感 但鸟 胞内分枝杆菌耐药性强 有报道分出的23株全部对上述药物耐药 而通过结构改造的新