（植物学专业论文）杜仲肉桂醇脱氢酶基因的克隆与序列分析.pdf

杜仲肉桂醇脱氢酶基因的克隆与序列分析 杜仲肉桂醇脱氢酶基因的克隆与序列分析 摘要 杜仲是我国特有的单科种植物，属国家二级保护植物。杜仲具有重要的经济价值，其皮可 入药，杜仲胶可制作绝缘产品，叶可制作保健饮品等。本质紊是植物体内仅次于木纤维的一类 大分子有机物，在植物体内具有支持、输导、防御等重要功能，但木质素含量过高，会使造纸 工业中污染增加、饲草消化吸收率降低，因此木质素含量基因调控已成为植物基因工程研究的 一个重要方向。本研究以杜仲4 、5 月份新长成的杜仲幼嫩叶片为材料，用c r a b 法提取总的r n a ， 根据本实验室已经克隆的杜仲肉桂醇脱氢酶基因片段设计引物，采用c d n a 末端快速扩增法 ( r a p i da m p l i f i c a t i o no fe d n ae n d s ，r a c e ) ，从杜仲中扩增出两段序列。测序后分析含并获 得一段长1 2 4 3 b p 的基因序列，该序列翻译起始点为5 5 碱基处，开放阅读框共编码3 2 2 个氨基酸。 在g e n b a a k 中比较和分析，发现该核苷酸序列与苹果树、桉树、红橡树中肉桂醇脱氢酶( c a d ) 基因序列的同源性分别为8 2 5 ，8 1 和8 3 4 ，其编码的氨基疑与苹果树、桉树、红橡树的同源 性分别为7 4 2 、7 1 4 和7 2 5 。故认为是杜仲肉桂醇脱氢酶基因。是首次从杜仲中获得c a d 基因全序列，为研究木质素的合成调控机理莫定理论基础。 关键词：杜仲，木质素，c d n a 末端快速扩增，肉桂醇脱氢酶 c l o n i n ga n da n a l y z i n go fc i n n a m y la l c o h o l d e h y d r o g e n a s eg e n ei ne u c o m m i au l m o i d e s 伽i r e s u m m a r y e u c o g i au l m o i d e s0 1 i f ei sac h i n e s es p e c i a ls p e c i e sw i t hh i g he c o n o m i cv a l u e i t s b a r k sc b 3 1b em a d ei n t om e d i c i n e ，g u t t ac a l lb em a d ei n t oi n s u l a t e dp r o d u c t i o n ，a n d1 e a r c a nb em a d ei n t oh e a l t hd r i n k a n ds oo n l i g n i ni sa nh u g em o l e c u l a ro r g a n i c s u b s t a n c e ，w h i c hp l a y si m p o r t a n tr o l ei ns u s t a i n ，t r a n s p o r t a t i o na n dr e s i s t a n c ei np l a n t l i f eh i g h l i g n i nc o n t e n ti np l a n ti sd i s a d v a n t a g e o u st op a p e rm a k i n ga n dp a s t u r a g e a s s i m il a t i o n s o 1 i g n i nh a sb e e nb e c o m ek i n do fa i mo fp l a n tg e n ee n g i n e e r i n g t h et h e s i s r e p o r t e de u c o 脚i au l m o i d e s0 1 i v 8c i n n a m y la l c o h o ld e h y d r o g e n a s eg e a ew h i c hi n v o l r e d i n t ot h eli g n i nb i o s y n t h e s i s t w oc d n af r a g m e n t sw e r ec l o n e da n ds e q u e n c e df r o mt o t a l r n ao fe u c o , , 咖m au l m o i d e s0 1 1 v el e a v e sb yr a p i da m p i i f i c a t i o no fc d n ae n d s t h es e q u n c e a n a l y s isr e s u l t ss h o w e di tc o n t a i n e d1 2 4 3b p t h et r a n s f a t i o ns t a r t sc o d o nl o c a t e di n 5 5 t hn u c l e o t i d ea n ds t o pc o d o n l o c a t e d i n l l 9 8n u c l e o t i d e o r f ( o p e nr e e d i n gf r a m e ) e d i t s ap r o t e i no f3 2 2a m i n oa c i d s t h ec d n as e q u e n c es h o w e d8 2 5 ，8 1 a n d8 3 4 a n da m i n o a c i ds e q u e n c es h o w e d7 0 蹦，6 83 ，6 9 4 h o m o l o g yt ot h a to fm a l u sd o m e s t i c ap u t a t i r e , e u c a l y p t u sg u n n i i ，o u e r c u ss u b e r t h er e s u l t si n d i c a t et h a ti tist h ee u c o m m i au l m o i d e s o i l v ec a dg e n e t h ec o n i n go fe u c o e m n i au l m o i d e s0 1 ，v ec a dg e n ec a nh e l pt or e s e a r c h t h er e g u l a t i n gm e c h a n i s 揶o fl i g n i ni np l a n t k e yw o r d s ：e n c o m i au l m o i d e s0 1 i r e , l i g n i n 。r a c e 。c a d 2 杜仲肉桂醇脱氢酶基因的克隆与序列分析 第一部分文献综述 前言 杜仲( e u c a 口g z i au l m o i d e s0 1 f 而又名思仲、思棉木等，为杜仲科杜仲属植物，是我国特有 的经济树种，其栽培历史达千年以上( 冯达等，1 9 7 7 ) ，广泛种植于我国贵州、湖南、湖北、四 川、陕西、河南、云南、甘肃、浙江、福建等省。杜仲的经济价值很高，树皮具有很高的药用 价值，杜仲叶可生产饮料添加剂，保健茶；杜仲树干的材质坚韧、纹理细致，是制作高档家具 及工艺品的优良材料。除木质部分外，杜仲各种组织和器官都含有硬橡胶( 杜仲胶) ，具有高度绝 缘性和很高的强度，是电器的良好绝缘材料，多用于高压、输电设备，特别是它有耐腐的特点，是 制造海底电缆最佳的绝缘材料。近年来，由于在杜仲胶研究上的取得了突破性进展，更使其身 价倍增。杜仲又是仅存于我国的第三纪孑遗植物，属国家二类保护植物( 张康健1 9 9 2 ) 。因此 对杜仲的研究既具有重要的经济意义，又具有很高的生物学理论意义。 木质素( 1 i g n i n ) 是包围在木纤维等管束细胞和厚壁细胞壁外的一类物质，由苯丙烷衍生 物以醚键或碳键( 少数) 连接而成，根据其来源单体的不同可将木质素分为3 种类型：由紫丁香基 丙烷单体聚合而成的紫丁香基术质素( s y r i n g y ll i g n i n 。s - 木质素) ；由愈创木基丙烷单体聚合 而成的愈创木基木质素( g u a i a c y ll i g n i n ，g - 木质素) 和由对羟一基苯基丙烷单体聚合而成的对 羟一基苯基木质素( h y d r o x y p h e n y l1 i g n i n ，h 一木质紊) 。其分子量从几百到几百万，广泛分布 在植物中。与纤维素、半纤维素被称为组成植物体的。三素”。木质素在植物体内具有重要的功 能，木质素以共价键方式与细胞壁中的半纤维素相接，可以增加了细胞壁的强度和致密性；参 于水分的运输代谢；保护内部的细胞免受物理、化学、微生物等方面的破坏以及防止细胞中多 糖的降低等。 木质素在植物体内具有重要的功能，但在工业上却成为造纸业发展的桎梏，木质素分子中的 化学键结合紧密，不易降解。目前国际上主要采用碱法造纸，为去除和回收木材中的术质素，需 耗用大量的碱和硫酸等化学物质，不但增加了生产成本，同时还由于所使用的大量的化学药品 而给环境造成严熏的污染。在畜牲中饲草的木质素还影响牲畜的消化与营养吸收，木质紊含量 的高低是饲草优劣的指标之一。降低木质紊含量或改变其组分，将有利于更好地利用资源植物。 环境保护是2 1 世纪令人瞩目的研究课题，其中源头污染治理、实现清洁生产在国际上已成 为研究主题。造纸原料植物的木质素是制浆造纸产生废水污染的根本原因。通过转基因技术调 控植物木质紊含量与组分研究在国际己成为热点。目前，人们已经弄清了木质素的合成途径， 分离、纯化了许多关键酶并将其克隆。还在多基因共整合载体导入植物、转录水平调控、r n a 干 涉( 1 w q a i ) 技术等方面取得了重大突破。 本研究以分离的杜仲树叶总r n a 为模板，根据本实验室已经克隆的杜仲肉桂醇脱氢酶 ( c a d ) 基因片段设计特异性引物，通过r a c e 方法获得c a d 基因的全序列，为研究木质素的 合成调控机理奠定了理论基础。 杜仲内桂醇脱氢酶基因的克隆与序列分析 杜仲的综合利用与开发前景 1 1 杜仲的药用价值 杜仲具有很高药用价值，早在公元前1 0 0 多年，我国第一部药书神农本草经就记载了杜 仲皮主治“腰膝痛、补中、益精气、坚筋骨、强志、久服轻身耐老”并列为中药上品。化学分 析杜仲主要成分为：山奈醇、咖啡酸、还原糖、杜仲胶、桃叶珊瑚甙、脂肪油，还含有氨基酸、 叶黄素、维生素a 、维生素e 等物质。现代医学的药理研究认为杜仲的医疗药理作用主要表现 为降压作用：杜仲有持久的降压作用，杜仲叶中所含的松柏苷( s y r i n g i n ) 为血管紧张和c a 肝 的抑制剂，并能增加冠状动脉血流量，其中水溶性硅和钙的含量都很高，可参与心血管能量的调 节。利尿作用：杜仲对动物有较强的利尿作用，而且无“快速耐受”。抑制作用：杜仲能 改善高血压病人头晕、失眠症状，较大剂量对动物中枢神经系统有明显抑制作用，使之安静、 嗜睡，自发活动减少现象。杜仲煎剂对结核杆菌、福氏痢疾杆菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、金黄 色葡萄球菌、肺炎球菌、炭疽杆菌等也有较强的抑制作用抗肿瘤作用：杜仲叶中许多木脂 素成分在抗肿瘤方面具有较高的活性，有报道丁香脂素双糖苷在淋巴细胞白血病p 3 8 8 ( p s ) 系统 中有较好的活性，浓度1 2 5 m g k g 一，可控制t c 值1 2 6l 杜仲叶中的有效成分京尼平苷、京 尼平苷酸也有抗肿瘤活性。抗衰老作用：杜仲、细辛合剂可提高c a t 和n o s 清除自由基的活性， 阻断自由基链锁反应增加n 0 含量使其生物学效应能持久的发挥，起到抗衰老作用。新的研究结 果还表明：杜仲促进机体功能，抗衰老、抗癌的效果十分明显，尤其是对血压的“双向调节”作用 是任何化学药物无法比拟的，是上等的老年保健药物。此外，杜仲的新芽嫩叶可作蔬菜食用，爆 炒、凉拌、寐汤都味美可口。本草纲目记述，杜仲嫩芽作蔬菜，可祛风毒脚气，久积风冷， 肠痔下血等功用。 1 2 杜仲的胶用 杜仲胶在国际上习惯被称为古塔波胶或巴拉塔胶。其化学结构为反式一聚异戊二烯( c 5 h s ) 。 为普通天然橡胶( 顺式一聚异戊二烯) 的同分异构体，是一种特殊天然商分子材料。其开发史可追 溯到1 9 世纪4 0 年代( 严瑞芳，1 9 9 4 ) 。因其具有在室温下质硬、熔点低、易于加工、电绝缘性 好等特点，长期以来被用作塑料代用品( 严瑞芳，1 9 9 4 ；李芳东，2 0 0 1 ) 。然而，由于杜仲胶与普 通天然橡胶( 三叶橡胶) 的微观结构不同( 后者是优良的高弹性体，在轮胎等橡胶工业中发挥着极 其重要的作用) 因此用途有限。由于在机理和加工技术上没有找到突破口国内外对杜仲胶的研 究长期停滞不前改性研究的应用也只局限于海底电缆、高尔夫球、假发基等方面( 严瑞芳 1 9 9 4 ) 。2 0 世纪8 0 年代，随着对杜仲胶硫化过程规律认识的深入( 严瑞芳，1 9 9 1 ) ，发现了杜 仲胶硫化过程临界转变及受交联度控制的三阶段，从而开发出3 大类不同用途的材料：热塑性材 料、热弹性材料和橡胶弹性材料( 严瑞芳，1 9 9 4 ) 。作为热塑性材料，杜仲胶具有低温可塑加工 性，可开发具有医疗、保健、康复等多用途的人体医用功能材料( 郑延龙，1 9 8 8 ；杜靖远1 9 9 6 ： 杜红岩，2 0 0 1 ) ；作为热弹性材料其具有形状记忆功能，并具有储能、吸能、换能特性等，可开 发许多新功能材料( 张乔，1 9 9 6 ；马柏林，1 9 9 6 ；严瑞芳，1 9 9 4 ) ；作为橡胶弹性材料其具有寿 命长、防湿滑、滚动阻力小等优点，是开发高性能绿色轮胎的极好材料( 严瑞芳，1 9 9 4 ，李学锋， 1 9 9 9 ) ，本实验室在杜仲橡胶合成机理上也作了许多研究( 赵德刚，1 9 9 4 ) 。这些研究发现使 杜仲具有更加广阔的开发前景。 1 3 杜仲的其它应用 1 3 1 食用价值 杜仲长期以来一直是以树皮入药，在利用上也是以树皮为主但随着近代科学研究的深入 4 杜仲内桂醇脱氢酶基因的克隆与序列分析 发现并证实了杜仲叶与皮有着同等的功效。杜仲叶的营养成分十分丰富，多种营养成分的含量是 皮中的几倍；而且杜仲叶的活性成分与皮中的一致，几种主要的活性物质如绿原酸、桃叶珊瑚甙 等的含量也是皮中的数倍。近代临床医学研究证明，杜仲叶与皮均具有降血压、减肥、抗衰老、 补肝肾等功效，而且在一些方面如降血压还优于皮的功效。杜仲叶产量大，生长周期短，因此可以 “以叶代皮”作药和保健品。国内外多家科研机构和公司对杜仲叶进行开发研究，生产出一系 列的产品。如杜仲乌龙保健茶，既有杜仲的药理，又有茶叶的营养，对降低血压、降脂减肥及抗衰 老有特殊效果。杜仲晶、美体茶等，具降压、降脂和增强肾上腺皮质的功能日本还开发了杜仲 酱、杜仲液体饮料、杜仲挂面、以及多种保健菜肴，还生产出玉露杜仲沐浴液、杜仲点心、杜仲 果冻、杜仲汤婷食品。随着杜仲茶深加工的发展，各种杜仲茶饮料、杜仲茶食品、杜仲茶添加 剂等将进一步发展壮大，杜仲茶的增值增效能力也将进一步增强。 1 3 2 生态价值 杜仲树干直、枝叶密集，树形优美，是良好的园林绿化树种。可在庭院、房前屋后、渠旁、 路旁、公园、街道等处广泛种植，发挥绿化、美化、净化环境的作用。杜仲有很强的适应力， 对土壤要求不严格，根系发达，固土力强，是荒芜山坡、丘陵的地带造林和营建平原防护林的 良好树种。因此，积极推广杜仲，大面积植树造林对绿化大地，保持涵养水源，调节气候， 保障农田丰收有重要意义。 2 、术质素的研究进展 木质素是植物体中仅次于纤维素的一种重要大分子有机物质，在植物体内含量丰富，具重 要的生物学功能本质素填充于纤维素构架中增强植物体的机械强度，利于疏导组织的水分运 输和抵抗不良外界环境的侵袭。但木质素在畜牧业、工业方面也存在许多不利的因素，制浆造 纸的中心环节是用大量化学品将原料中的木质素与纤维素分离，纤维素用于造纸，分离的木质 素等成为造纸工业的主要废弃物，对江河湖海会造成极大的污染。脱木质紊的化学品投入及废 液的碱回收处理需大量耗能并增加造纸成本。饲草中的木质素影响牲畜的消化与营养吸收，木 质素含量的高低是饲草优劣的指标之一。降低木质素含量或改变其组分，将有利于更好地利用 资源植物。当前对木质素的研究主要是弄清其生物合成途径及其调控机制，用基因工程等生物 高技术手段，调节植物次生代谢过程，降低造纸原料植物的木质素含量或改变其组分，达到减 轻造纸废水污染和降低造纸成本的目的。 2 1 木质素的特征 2 1 1 木质素的含量 木质素是包围在木纤维等维管束细胞和厚壁细胞壁外的一类物质，由苯丙烷衍生物以醚键 或碳键( 少数) 连接而成。其分子量从几百到几百万。它与纤维素、半纤维素并称为组成植物体 的“三素”。光合作用所固定的c o ：有很大一部分被转化成为木质素。通过光合作用储存在植物 中的太阳能中，木质紊大约占去了4 0 。在木本植物中，它的含量约占2 7 一3 2 ( 绝对干原料重) ： 草本植物中约占1 4 一2 5 ( 陈慧泉，1 9 9 6 ) 。 2 1 i2 木质素的分布 植物木质素的存在与支持及输导组织( 如木质部) 存在联系，是这些组织胞壁的重要成分。 因此在维管植物、裸子植物和被子植物中广泛存在。但也有一些证据表明，苔鲜植物节状体含 有木质素或一种结构相近的聚合物。而且苔鲜体内存在苯丙氨酸的新陈代谢。 棵子植物主要含有愈创木基木质素( g ) ；双子叶植物木质紊是愈创木基木质素和紫丁香基木 塾塑宣堡壁壁塾鳖苎里垫塞壁量壁型坌堑 质紊的混台体( g s ) ；单子叶植物含有愈创木基、紫丁香基和对一羟基苯基木质素三种本质素的 混合体( g s - h ) ，但以“h ”含量最高。石松植物中没有“s ”木质素，而蕨类植物主要含有“g ” 木素和“s ”木质素。硬术中的“g ”木质素往往存在于导管分子内，而“s ”术质素在纤维中储 量最丰富。针叶树中，“h ”木质素主要与压缩木形成有关，而“g ”木质素则与正常木形成有 关。这些细胞类型的木质素的分布可以通过调节赤霉酸与生长素的不同比例进行控制( 樊汝 坟，i 9 9 9 ) 。 此外，木质素的结构方式和含量依不同的种类、个体、组织、细胞类型、细胞层以及环境 条件而变化的，在垂直分布上木质素含量随高度的增加而逐渐降低：在径向分布上对针叶树是 心材比边材少、秋材比春材少，而在阔叶树中则没有显著差异( 胡新生，1 9 9 9 ) 2 1 3 木质素的组成 木质素主要来源于香豆醇( c o u m a r l ya l c o h 0 1 ) 、松柏醇( c o n if e r l ya l c o h 0 1 ) 和芥子醇 ( s i n a p y aa l c o h 0 1 ) 三种不同的单体。木质素的合成以苯丙氨酸起始，经过一系列羟基化、甲基 化、连接、还原反应最终生成上述三种甲基化程度不同的木质素单体。这些单体经氧化聚合生 成相应的木质素。根据单体的不同，可将木质素分为3 种类型( 图1 ) ：由紫丁香基丙烷结构单体聚 合而成的紫丁香基木质素( s y r i n g y ll i g n i n ，s t k 质素) ：由愈创木基丙烷结构单体聚合而成的愈 创木基木质素( g u a i a c y ll i g n i n ，g 木质素) 和由对一羟基苯基丙烷结构单体聚台而成的对一羟基 苯基木质素( h y d r o x y - p h e n y ll i g n i n ，h - 木质素) 。h 型主要存在于禾本科植物中，s 型主要存在 于被子植物中，6 型则广布于裸子植物和被子植物中。 随着对木质素合成途径认识的深入研究，人们发现自然界木质素的单体除了上述3 种形式以 外，还有其它形式的单体也参与木质素的聚合过程，如许多植物中存在一些乙酰化的木质素单 体，在木质素组成中占有相当比例( l u 和r a l p h 2 0 0 2 ) 。r a i p h 等( 2 0 0 i ) 研究发现，当植物的术质索 合成途径受阻时，植物会台成一些其它成分参与木质素的构建过程，以保持植物结构的完整性。 如在肉桂酵脱氢酶( c a d ) 活性缺失的转基因植物中，可检测到大量的羟基肉桂醛存在，这些醛类 物质以8 0 - 4 方式与木质素单体偶联在一起，参与木质素聚合过程。当c o m t ( 咖啡酸- 0 一甲基转移 酶) 括性受到抑制时，芥子醇合成量减少在本质素聚合体中可检测到一些未经甲基化的前体产 物5 羟基松柏醇。可见木质素生物合成途径具有较大的可塑性，当一种代谢途径受阻，可以通 过其它的途径来弥补，来保持植物体内的生理功能不受影响，木质素的进化是一个异常复杂的 过程，受时空，外界条件等多种因素的影响制约。 s y r n b , , , , m ，l i g m o l g t m l a e y l - m t o i l g n o l l i 朋i n 刚印d r o x 删y p b e 心一c c 一2 l 盘- l i b n i n 图1 不同木质素单体的结构与木质紊类型。 f i g u r e l d i f f e r e n ts t r u c t u r e so fm o n o l i g n o l sa n dd i f f e r e n tt y p e so fl i g n i n 6 杜仲肉桂醇脱氢酶基因的克隆与序列分析 2 2 木质素的生物合成 木质索的生物合成可分为三个步骤：( 1 ) 莽草酸途径：是植物光合作用后的同化产物到芳香 氨基苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸等的合成过程。( 2 ) 苯丙氨酸途径：是从苯丙氨酸到羟基肉桂 酸( h c a ) 及其辅酶a 酯类。( 3 ) 术质素合成的特异途径：是从羟基内桂酸辅酶a 酯类到合成木质素 单体及其聚合物的过程。目前研究木质素的重点主要放在苯丙氨酸途径和合成特异途径这两个 阶段( b a u c h e r ，1 9 9 8 ) 。 木质素的合成过程较为复杂，中问有很多的酶参与作用，参与第二阶段的苯丙氨酸途径中 的酶有：苯丙氨酸基裂解酶( p a l ) 、肉桂酸4 一羟基裂解酶( c 4 h ) 、香豆酸3 一羟化酶( c 3 h ) 、香豆 醇辅酶a 一3 一羟化酶( c c o a 3 h ) 、咖啡酸5 一羟化基阿魏酸o - 甲基转移酶( c o h g r ) 、咖啡醇辅酶a 廿甲 基转移酶( c c o a 伽t ) 、阿魏酸5 一羟化酶( f 5 哪和4 一香豆基辅酶a 热懈酶等等。参与第三阶段的木质 素单体合成特异途径的酶主要有：肉桂酰c 0 a 还原酶( c c r ) 和肉桂醇脱氢酶( c a d ) 两种，但在多途 径中还发现了松柏醛5 一羟基降解酶( c a l d s h ) 和松柏醛甲基转移酶( a i d o m t ) 等( l i ，2 0 0 0 ) 。最 后，在过氧化物酶( p e r o x i d a s e ) 和漆酶( l a c c a s e ) 等的催化下，各种术质单体聚台成为木质素 ( 图2 ) 。上述合成过程在细胞质中完成，然后单体转移到细胞壁中进行脱氢聚台形成木质素 ( c a m p b e l l ，1 9 9 6 ) 。下面对木质素合成途径的主要酶类作简要介绍。 2 2 1 苯丙氨酸氨基裂解酶( p 札) 苯丙氨酸氨基裂解酶( p a l ) 催化的苯丙氨酸的脱氨基作用，苯丙氨酸经p a l 作用，其宜接产 物为对羟基苯丙烯酸。p a l 基因在不同植物中表达不同。在杨树正在发育的木质部、嫩茎和嫩叶 中p a l 活性最高( s u b r a m a n i a me ta l ，1 9 9 3 ) 在刺槐( r o b i n i ap s e u d o a c a c i a ) 树干中，显著的p a l 活性表现在边材的较嫩部分( 与木质化有关) 和边材一心材的分界处( 与类黄酮生物台成有 关) ( m a g e le ta 1 t 9 9 7 ) 已通过免疫化学方法将p & l 定位在胞质里、与商尔基体衍生的小泡、 原生质膜和分化的导管次生壁加厚部分( n a k a s h m ae ta 1 1 9 9 7 ) 。p a l 活性的改变可影响s g 的 比率，多基因复合物可能参与了g 一亚基或s 一亚基特异途径的代谢过程。 2 2 2 内桂酸- 3 一羟基化酵( c 3 m c 3 h 是一种酚酶催化香豆酸生成咖啡酸，人们对其研究甚早，最初认为c 3 h 与p a l 、c 4 h 作 为一种多酶复合体可能结合于原生质膜上或编码于细胞器中( e a e t t e ne ta l ，1 9 9 5 ) 。但直到近 年来才将其分离纯化，取得突破性进展。s c h o c h 等( 2 0 0 i ) 从拟南芥中分离一种c y p 9 8 a 3 基因， 发现该酶对香豆酰奎宁酸和香豆酰莽草酸表现出很高的催化活性，在术质部表达很高，推断它 可能编码c 3 h 酶蛋白。f r a n k e 等( 2 0 0 2 ) 用图位克隆方法从拟南芥中分离得到兄邑船基因，并证实 该基因编码c 3 h ，属于c y p 9 8 a 3 基因家族中的成员。c 3 h 实质上是一种细胞色素p 4 5 0 单氧化 物酶。对该酶进行底物特异性分析表明，c 3 h 的最适催化底物是甲酰肉桂酯类化合物。 2 2 3 苯乙烯酸4 _ 脱氢酶( c 4 i ) 苯己烯酸4 一脱氢酶催化肉桂酸脱氢生成香豆酸，c 4 h 是一种属于c y p 7 3 * f f _ 家族、与细胞色素 p 一”有关的单氧化酶。在杨树中，c 4 h 活性与木质囊和厚壁组织密切相联，可被真菌处理、真菌 感染、受伤及化学诱导剂所诱导。拟南芥( a r a b f d o p s f st h a l i a n a ) 的c 4 h 启动子保留在p a l 和4 c l 基因中的顺式作用组分，控制着对光、紫外照射等处理反应的表达( s c h u l e r ，1 9 9 6 ) 。还有研 究发现，在转基因植物中，抑制c 4 h 活性会使木质索的合成减少同时檀株也伴随非正常的生长， 可见c 4 h 并非特异的参于术质素单体的合成，也可能是酚类或其它物质合成的中间环节。 2 2 4 咖啡酸一0 - 甲基转移酶( c o 晡r ) 咖啡酸一。一甲基转移酶( c o u r t ) 以s 一腺苷一l 一蛋氨酸作为甲基基团的供体催化咖啡酸甲基 杜仲内桂酵脱氢酵基因的克隆与序列分析 化为阿魏酸。不同种的c o m t 具有不同的底物特异性。杨树中c o m t 在木质部中高度表达，而在叶 中却检测不到( b u g o se ta l ，1 9 9 l ；1 9 9 2 ) 。在百日草( 肋口妇e i e g n n 曲中，c o m t 的表达是与 韧皮部和木质部纤维相一致，但与体外导管分子不一致( y ee ta l ，1 9 9 4 ：1 9 9 5 ) 。o s a k a b c 等 ( 1 9 9 9 ) 从香枫中分离出一种甲基转移酶厶c ( 肌盯基因( c o m t ) ，发现l s c o m t 能以f 5 h 催化松柏醛产 生的5 羟基松柏醛为底物，经一系列反应，最终生成芥子醛，c o m t 所介导的木质紊转化台成过 程还可以在醛的水平上进行。 2 2 5 阿魏酸一5 羟基化酶( f 5 h ) f 5 h 催化阿魏酸( f a ) 在c ，位羟基化为5 一羟基阿魏酸，f s h 最先是在杨树茎的微粒体中发现， 其在木质部特别是主要包括s 亚基的厚壁组织中活性最高( g r a n d ，1 9 8 4 ) 。m e y e 等( 1 9 9 8 ) 证明f s h 是决定木质素单体组成的一个潜在的调节步骤，f 5 嘲达上的改变可以改变木质素单体的组成。 o s a k a b e 等( 1 9 9 9 ) 从香枫中分离出一种细胞色素p 4 5 0 单氧化物酶外4 8 8 基因( f 5 h ) ，l a m b 8 能催化 松柏醛进行5 一羟基化反应。h u m p h r e y s 等( 1 9 9 9 ) 将拟南芥f s h 置于酵母中表达，它的催化底物除 了阿魏酸外，还有松柏醛和松柏醇，而且此酶对松柏醛和松柏醇的亲和力是阿魏酸的上千倍， 这些结果表明f 5 h 优先催化的底物是松柏醛和松柏醇。由此推测植物体内f 5 h 催化的木质素合成 途径反应和c o m t 一样不仅发生在肉桂酸水平上，还可以在醛和醇的水平上进行。 2 2 6 咖啡酰c o o - 甲基转移酶( c c o a 0 岍) c c o a o m t 催化5 一羟基阿魏酰辅酶a 甲基化生成芥子酰辅酶a ，人们开始认为是双子叶植物对 病虫害反应的一种酶随后在百日草中发现它可诱导分化的导管分子的木质化( y ee t a l ，1 9 9 4 ) 。组织印迹杂交表明c c o a o m t 主要存在于发育着的木质部中，在较老茎节的韧皮部纤 维和分化的木质部中也能检测得到( y ee ta l ，1 9 9 5 ) 。y e 等( 1 9 9 4 ) 认为c c o a o m t 催化途径在木 质素合成中占主导地位因为c o m t 活性的降低会导致s 亚基含量降低，而g 亚基则不变，g 亚基的 合成很可能不是由c o m t 控制，而是由c o o 脚控制。此外，有报道称咖啡酰c o a 和5 一羟阿魏酰c o a 在体外能被甲基化，也有可能是由c c o a o m t 来倘化 2 2 74 - 肉桂酰c o k 连接酶( 4 e l ) 4 c l 基因是控制木质素生物合成的关键限速酶基因，主要催化羟基苯乙酸到相应的硫酯的反 应，利用香豆酸、咖啡酸、阿魏酸和肉桂酸等不同的底物来调节木质素合成。4 c l 基因主要在木 质部中表达，在拟南芥幼苗发育早期就有报道，其表达与维管系统分化中的木质紊沉积相一致 ( l e ee za t ，1 9 9 6 ) 。h u 等( 1 9 9 8 ) 在颤杨( p o p u l u st r e m u l o l d e s ) 中发现2 种功能和结构上不同 的4 c l 基因p t 4 c l i 和p t 4 c l zp t 4 c l i 和g s 术质素的生物合成相关，在木质化的木质部组织中表 达，而凡4 以痢其它的苯丙酮酸的形成有关，在茎的表皮层和叶片中特异表达。凡靓研u 凡4 丑? 基因表达被区域化以调节不同的苯丙烷类物质的形成。转基因植物研究表明，不同植物的4 c l 功能不尽相同，但抑$ 4 4 c l 的转基因植物的术质素含量均明显下降( f a j f t a ，e ta l ，1 9 9 6 h u ，e t a l ，1 9 9 9 ) 。且来发生转4 c l 基因植株的异常生长，因此，抑制4 c l 基因表达可以作为改善纸质资 源的一种途径。 2 2 8 肉桂酰c o a 还原酶( c c r ) 该酶能把4 c l 催化生成的产物还原为其相应的醛，目前已从蚕豆、云杉、杨树、按树等多种 植物中纯化出c c r ( b a u c h e re ta l ，1 9 9 8 ) 。研究发现其在木质部、形成层、细胞培养物中都可 表达，但在各种植物中c c r 利用的特异性底物不同，在云杉中c c r 特异利用阿魏酰c o a ，而蚕豆、 杨树和桉树c c r 利用0 一肉桂酰、阿魏酰、芥子弹t c o a 为底物。c c r 活性一般在植物中较低，但与 木质素的合成密切相关，在植物体内木质素的含量往往和c c r 活性星正比关系，表明c c r 是木质 素生物合成的限速步骤( d o u g l a s ，e ta l 。1 9 9 7 ) 。 杜仲肉桂醇脱氢酶基因的克隆与序列分析 2 2 9 肉桂醇脱氢酶( c a d ) 肉桂醇脱氢酶( c a d ) 是催化木质素前体合成的最后一步的酶，催化对香豆醛转变为对香豆 酵的反应( w h e t t e n ，1 9 9 5 ；w h e t t e n ，1 9 9 8 ) 。该酶活性的高低与木质索的合成有密切关系 ( h a l p i n ，1 9 9 4 ；v a i l h e ，1 9 9 8 ) 。c a d 已在大豆、小麦、烟草、云杉、蚕豆等多种植物中纯化 ( b a u c h e re ta l ，1 9 9 8 ) 。h a l p i n 等( 1 9 9 4 ) 报道在抑制c a d 表达的转基因烟草中，醛醇比的变 化大于s g 比值，表明c a d 活性降低，抑制松柏醛还原相对强烈一些，因此推测c a d 可能具有底物 选择亲和性或者存在不同的c a d 周工酶。随后b o u d e t 等( 1 9 9 5 ) 在桉树木质部中发现2 种周工酶 c a d l 和c a d 2 ，它们具有不同的底物特异性，c a d i 活性很低且不以芥子醛作为底物，可能在合 成木质素单体中起辅助作用；c a d 2 主要存在于木质部中，在被子植物中以三种醛作为底物，在 百日草中c a d 2 最好的底物是芥子醛。也有研究认为c a d 、4 c l 、c c r 是以一个多酶复合体的形式发 挥作用( r o t he ta 1 1 9 9 7 ) 。 莽草酸途径一一4 一磷酸赤辞糖一光合作用一 二氧化碳 i第一阶段 ， p a lc 4 hc 3 h c 删tf 5 h 苯丙氨酸卜褂硅酸香豆酸咖啡酸阿魏酸 第二阶段 第三阶段 4 乱 4 。鲫+ 乱 香豆酰辅酶a 咖啡酰辅酶 _ 阿魏酰辅酶a 士c c 8+ 6 c r 香豆醛 0 松柏醛 i r c a d u m l 5 _ 羟基阿魏酸 0 4 c l 5 - 羟基阿魏酰辅酶a 0 c c r 5 一羟基阿魏醛 香豆醇 幺柏醇 ( h 禾本科植物)( g 裸子、s 被子植物) 过氧化物酶7 罐酶 过氧化物酶漆酶 芥子酸 4 c 。 芥子酰辅酶a + c c r 芥子醛 c a d 芥子醇 ( s 被子植物) ， h 术质素 g 、s 术质紊s 术质素 圈2 术质紊的生物合成途径 f i g u r e 2 t h eb i o s y n t h e s i sp a t h w a yo fl i g n i n c a d ：c i n n a m y a l c o h o ld e 时d r o g e n a s e ；4 c l ：4 - c o u m a r a t e - c o ai l g a s e ；c 3 h ：p - e o u m a r a t e3 - h y d r o x y l a s e ；c 4 h c i n n a m a t e4 - h y d r o x y l a s e ；c c o a o m t ：c a f f e o y i - c o ao - m e t h y l t r a n s f e r a s e ；c c r ：c l n n a m o y l c o ar e d u c t a 5 e ： c o m t ：c a f f c i ca c i do m e t h y l t r a n $ f e r a s e ；p a l ：p h e n y l a l a n i a ea m m o n i a d y a s e ； 2 3 木质素生物合成的基因调控 2 3 i 木质素生物合成基因调控策略 木质素生物合成途径弄清以后，可通过对不同酶的活性的改变实现对木质素生物合成的调 控：其一是通过降低木质素生物合成途径中的一些酶如c c r 、c a d 宅酶的话性，调控木质素单体的 合成过程，以达到降低木质素含量的目的。a t a n a s s o v a 等( 1 9 9 5 ) 认为c o 舯活性被抑制达8 0 一9 0 ， 才能对木质素的组分产生影响。k a j i t i v ( 1 9 9 6 ) 研究得, 小4 c l 被抑制的转基因烟草木质素合成 下降1 9 - 3 5 aj o u a n i n 等( 2 0 0 0 ) 在c o m t 活性几乎被全部抑制( 活性残留不足3 ) 的转基因杨树 中发现木质素含量降低。由此可见，转基因植物中c o g r 活性被抑制的程度影响术质素的含量与 9 杜仲肉桂醇脱氢酶基因的克隆与序列分析 组分。其二是由通过调节特定酶的活性来影响木质素的组成及化学结构。有研究认为愈创木基 单体( 松柏醇聚合物) 与紫丁香基单体( 芥子醇聚合物) 聚合成的g s 型木质素比纯粹由愈创木基 单体聚合成的g 型木质素易于降解，所以激活c a l d 5 h 和a l d 叫t 酶的活性，与c a d 竞争底物松柏醛， 通过芥子醛合成更多的紫丁香基s 型木质素单体从而相对降低愈刨木基的g 型单体的合成的 2 3 2 木质紊生物合成基因调控研究现状 在木质素生物合成基因调控中，首先要找到与木质素台成相关的生物酶并进行分离，然后 分析其酶蛋白氨基酸序列，由此得到其m r n a 的序列，也即功能基因外显子的编码序列。基因 导入的方法则主要有农杆菌介导间接转化和基因枪直接转移两种。在调控酶活性的方面，通过 构建反义基因进行转化( s e d e r o f f ，1 9 9 9 ) 和获得自然或人工突变体等。最初发现c o i t 与c a d 基因 突变可引起术质素含量下降，因此c o m t 与c a d 在利用基因工程调节植物木质素生物合成的研究中 成为焦点( t s a i ，1 9 9 8 ) 。许多c o m t 相关研究均表明，抑s f j c o m t 表达的转基因植物中木质素组分 发生改变( i h i v e ，1 9 9 4 ；a t a n a s s o v a 1 9 9 5 ：d o o r s s e l a e r e ，1 9 9 6 ) ，s g 比值下降，并伴随5 羟基g 木质素的出现( a t a a a s s o v a ，1 9 9 5 ；d o o r s s e l a e r e ，1 9 9 6 ) ，但多数研究中术质素古量 未降低。迄今为止，仅在转基因烟草( n i ，i 9 9 4 ) 与杨树中有使木质素含量明显降低的报道 ( j o u a n i n 。2 0 0 0 ) 。但前者无组分改变，亦无5 一羟基愈创木基木质素出现；后者s g 比值下降。 以上研究的结果并不一致，产生差异的原因尚无明确解释。抑制p a l ( b a t e ，1 9 9 4 ；s e w a l t ，1 9 9 7 ： n i ，1 9 9 4 ) 、c 4 h ( s e w a l t 1 9 9 7 ) 与c c r ( p i q u e ，1 9 9 8 ；r a l p h ，1 9 9 8 ) 的转基因植物木质素 下降伴随非正常生长，因而难以实际应用。抑制或增强f s h 表达仅影响木质素的组分( f r a n k e ， 2 0 0 0 ) 。i p e l c l ( 1 9 9 9 ) 等通过抑制杨树的一种过氧化物酶的表达，使木质素含量下降1 0 2 0 是唯一抑制木质素单体聚合而降低木质素含量的报道。 2 3 3 木质素生物合成相关基因的分离和克隆 木质素调控的主要因素是得到编码木质素生物合成过程中的关键酶蛋白序列的基因，所以 在研究木质素生物合成途径的过程中，也会分离出报多有关的酶蛋白，得到其氨基酸编码的基 因序列。最早报道的是d o o u g a l a s 等( 1 9 8 7 ) 从皱叶欧芹( p e t r o s e l i n u mc r i p u m ) 中克隆出的两个 4 c l 基因：p c 4 c l l 和p c 4 c l - 2 。h u 等( 1 9 9 8 ) 在杨树中克隆了2 个结构、功能均不同的4 c l 基因。 至今已在拟南芥、烟草、杨树等植物中克隆出p a l 、c 4 h 、4 c l 、c c r 、c a d 、f 5 h 、c o m t 等多种 关键酶的基因或c d n a ( 表1 ) 。 2 4 问题与展望 木质素在植物体内具有多种生理功能，但同时也给以木材利用为主的造纸工业及牧草利用 带来许多不利的因素。由于林木生长周期长，传统育种策略不太适合。现代生物技术为利用基 因工程改变术质素含量或组成提供了有效手段，已有成功的报道，但应用于实际生产还存在许 多问题需要解决。首先，木质紊的合成涉及到许多基因的参与，调控基因的不同，代谢物质也 会受到影响，如用反义r n a 技术调控p a l 基因的袭达，达到一定程度后木质素含量降低，但植物 个体往往伴随着非正常生长现象的发生。其次，降低木质紊的含量需兼顾其组分的改变，由_ r 术质索单体所含有化学键各不相同，在造纸处理过程中使其断裂也各有难易。双子叶植物中的s 类型木质素，在造纸过程中相对比较容易去除。裸子植物中木质素为g 类型，其结构稳定难以去 除。j o u a n i n 等( 2 0 0 0 ) 以c o m t 共抑制的转基因杨树进行制浆研究，结果由于木质素含量下降， 出浆率增加约1 0 ；但伴随s g 下降导致木质素结构致密，不易去除，纸浆k a p p a 值升高，影响质 量和后续漂自。因此，降低木质素含量需同时重视组分的改变，使木质素下降的同时s g 比值增 加。目前，利用反义c c o a o m t 基因技术，仅在杨树、烟草中有成功的报道( z h o n g ，2 0 0 0 ) 。再 次，术质素具重要生物学功能，降低木质素的含量虽有利于资源植物的利用，但会给植物自身 0 塾丝堕焦壁壁壑堕苎里堕塞堕兰堡型坌堑 生长带来不利影响，削弱植物对外界不良环境因素的抵抗能力。如何找到切实有效的办法来解 决上述矛盾也是今后研究的重点 表i 植物木质素合成基因