【毕业论文】医学类杀伤细胞免疫球蛋白样受体基因多样性与强直性脊柱炎的相关性研究.pdf

山东省医学科学院 硕士学位论文 杀伤细胞免疫球蛋白样受体基因多样性与强直性脊柱炎的相关 性研究 姓名 焦玉莲 申请学位级别 硕士 专业 免疫学 指导教师 赵跃然 20070301 主要符号表 t s s u p p r e s s o rtc e l l 抑制性t 细胞 t h h e l p e rtc e l l 辅助性t 细胞 c t lc y t o t o x i ctl y m p h o c y t e 细胞毒性t 淋巴细胞 n kn a t u r a lk i l l e r 自然杀伤细胞 k i rk i l l e rc e l li m m u n o g l o b l i n l i k er e c e p t o r 杀伤细胞免疫球蛋白样受体 a sa n k y l o s i n gs p o n d y li t i s 强直性脊柱炎 s p as p o n d y l o a r t h r o p a t h y 血清阴性脊柱关节病 m h cm a j o rh i s t o c o m p a t i b i l i t yc o m p l e x 主要组织相容性复合体 h l ah u m a nl e u k o c y t ea n t i g e n 人类白细胞抗原 i t i gi m m u n et y r o s i n e b a s e di n h i b i t o r ym o t i f 免疫酪氨酸抑制基序 i t a li m m u n et y r o s i n e b a s e da c t i v a t i o nm o t i f 免疫酪氨酸活化基序 从a m i n oa c i d 氨基酸 p c rp o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 聚合酶链反应 s s ps p e c i f i cs e q u e n c ep r i m e r 序列特异性引物 i li n t e r l e u k i n 白细胞介素 i f n yi n t e r f e r o n y 干扰素一v t n f t u m o rn e c r o s i sf a c t o r a 肿瘤坏死因子一 l r cl e u k o c y t er e c e p t o rc l u s t e r 白细胞受体复合体 i l t si g 1 i k et r a n s c r i p t s 免疫球蛋白样转录物 l a i rl e u k o c y t e a s s o c i a t e di n h i b i t o r yr e c e p t o r 白细胞相关抑制性受体 e d t ae t h y l e n ed i a m i n e t e t r a ca c i d 乙二胺四乙酸 即e t h i d i u m b r o m i d e 溴化乙锭 b pb a s ep a i r 碱基对 r p mr o u n dp e rm i n u t 转数 分钟 n sn o r m a ls a l i n e 生理盐水 d 心od e i o n i z e dw a t e r 蒸馏水 l ig l m i c r o g r a m l i t e r 微克 升 ulm i c r o l i t e r 微升 i gi m m u n o g l o b u li n 免疫球蛋白 o do p t i c a ld e n s i t y 光密度 学位论文独创性声明 本人声明 所呈交的学位论文系在导师指导下本人独立完成的研究成果 文中引用 他人的成果 均已做出明确标注或得到许可 论文内容未包含法律意义上已属于他人的 任何形式的研究成果 也不包含本人已用于其他学位申请的论文或成果 学位论文知识产权权属声明 本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品 知识产权归属山东省医学科学 院 山东省医学科学院享有以任何方式发表 复制 公开阅览 借阅以及申请专利等权 利 本人离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时 署名单 位仍然为山东省医学科学院 论文作者签名 导师签名 筵 王 耋日期 毕年上月生日 日期 皿年上月盟日 杀伤细胞免疫球蛋白样受体基因多样性 与强直性脊柱炎的相关性研究 硕士研究生 焦玉莲 导师 赵跃然 中文摘要 立题依据和目的 血清阴性脊柱关节病 s p o n d y l o a r t h r o p a t h y s p a 是一组累及脊柱 周围 关节及其周围软组织的风湿性疾病 关节病变除有疼痛外尚伴有肿胀和活动障 碍 呈发作与缓解交替的慢性炎症过程 严重者可出现关节致残和内脏功能衰 竭 s p a 包括强直性脊柱炎 a n k y l o s i n gs p o n d y l i t i s a s 反应性关节炎和 r e i t e 综合征 银屑病关节炎 炎性肠病关节炎 幼年起病脊柱关节病等 其中 以a s 最常见 并具有代表性 该病起病隐匿而缓慢 发病年龄多在1 5 3 0 岁 男 性多于女性且男性患者的症状远较女性重 a s 的患病率在各国报道不一 我国 患病率初步调查为0 2 6 其发病机制至今不明 流行病学调查发现 其发病机 制涉及了遗传易感基因和环境因素 感染因素的共同作用 目前有很多学者将 a s 划归全身性自身免疫性疾病 a s 有明显的家族聚集倾向 a s 家庭中一级亲属 患a s 的概率在2 4 左右 本病另一重要特点是与人类白细胞抗原b 2 7 卧一 b 2 7 强相关 这种关联在已知h l a 与疾病的关联性中最强 相对危险值高达 8 1 8 h l a b 2 7 阳性者患a s 的概率较l f l j t b 2 7 阴性者高2 0 一4 0 倍 关联分析和 转基因动物模型研究都提示h l a b 2 7 抗原是引起此类炎症性疾病最主要的危险因 素 将h l a b 2 7 基因转至大鼠 可导致转基因大鼠发生强真性脊柱炎 家系和双 生子资料表明除h l b 2 7 以外 还有其他遗传基因参与该病的发生 说明a s 应 归属于多基因遗传病 在遗传易感的基础上 由环境因素或 和感染因素触发和 促进自身免疫反应的发生 a s 患者在多个层面存在细胞免疫功能紊乱 其体内 存在着t h l t h 2 平衡的偏移 t h l 激活程度低下 而t h 2 激活程度增强 细胞因子 水平的改变尤以t h l 细胞因子t n f a 降低特别明显 自然杀伤细胞 nk 是机体免疫系统抗肿瘤和病毒感染的第一道防线 同时又能通过早期分泌多种细胞因子来调节获得性免疫应答 在免疫应答中 nk 细胞受体承担着识别靶细胞的功能 监控细胞姗c 分子的正确装配 n 细胞 表面受体一旦识别其相应的m 一i 配基特定的氨基酸残基 产生活化或抑制信 号 将导致靶细胞裂解或抑制细胞裂解 已知k i r 2 d 分子的配体为h l a c w k i r 分子中2 d l i 2 d s l 特异性识别位点是位于h l a c w 0 2 0 4 0 5 0 6 分子口重链 上第8 0 位的赖氨酸 2 d l 2 2 d l 3 2 d s 2 2 d s 3 特异性识别c w o i 0 3 0 7 0 8 分子a 重链上第8 0 位的氨基酸为天冬氨酸 k i r 与h l a 均为共显性表达 而且 k i r 的表达强度不受h l a 的影响 因此 k i r 和h l a 在d n a 水平和蛋白质水平是 一致的 个体的k i r 和h l a 表型决定了个体n i 细胞与自身组织细胞间的作用方 式 n i 细胞发育的正常过程确保循环中的n l 细胞对自身健康细胞的耐受 这种 状态依靠n i 细胞受体与自身h l a i 类分子配体的相互作用 n k 细胞受体分为两 个家族 免疫球蛋白样受体家族和c 型凝集素 c l e c t i n 受体家族 前者包括 杀伤细胞免疫球蛋白样受体 k i l l e rc e l li g l i k er e c e p t o r s k i r s 白细 胞免疫球蛋白样受体 l e u k o c y t ei m m u n o g l o bul i n i i k er e c e p t o r s l i l r 白细胞相关抑制受体 l e u k o c y t e a s s o c i a t e di n h i b i t o r yr e c e p t o r s l a i r 和n l 细胞活化受体n k p 4 6 k i r s 由位于染色体1 9 q 1 3 4 上的跨距约1 5 0k b 头尾排列 聚集成簇和多态性丰富的多基因家族编码 迄今发现k i r 基因家 族有1 4 个k i r 基因和2 个假基因 k i r s 是继8 l a 后发现的具有高度多态性的免疫调 节基因家族 主要存在于n i 细胞和部分c d 8 t 细胞表面 能与主要组织相容性复 合体 m i c 和 或非m h c 类配体结合 通过介导免疫效应细胞 n l 细胞和t 细 胞 的抑制或活化信号 参与机体先天性和获得性抗肿瘤免疫 抗感染免疫 抗病毒免疫应答 母胎耐受 免疫监视和免疫耐受的调节 k i r 根据功能分为抑 制性和活化性两类受体 k i r s 的膜外区有免疫球蛋白 ig 样结构域 属于免 疫球蛋白超家族 k i r s 具有遗传多态性 不同地区 不同种族和不同个体 不 同n l 细胞克隆 k i r s 的表达格局 基因数目均存在差异 而且k i r 的多态性还表 现在同 k i r 基因座位包含多个等位基因 类似于h l a d r 的基因多态性 虽然 k i r s 在n l 细胞和t 细胞上的表达是克隆性的 但个体的基因型是其表达的决定性 因素 近年来 k i r 基因与感染性疾病和自身免疫性疾病遗传易感性的的关系以及 k i r 与h l a c w 组成免疫抑制信号传导系统在免疫调节中发挥的作用引起人们的关 注 研究发现 抑制性 活化性k i r s 基因的失衡可能和i 型糖尿病 银屑病性关 节炎等自身免疫病相关 为探讨k i r s 及h l a c w 在a s 发病中的作用 本研究采用 序列特异性引物聚合酶链反应 p c r s s p 基因分型技术分析a s 患者k i r s 基因 及 也a c w 等位基因 由k i r 基因型推断单倍型 计算k i r s 基因频率 抑制性和活 化性k i r 基因数目 同时以正常人群做对照 探讨k i r s 以及其相应的配体h l a c w 等位基因基因多态性与a s 和的相关性 资料与方法 2 l 临床资料筛选山东省立医院风湿免疫科门诊和住院a s 患者8 6 例作为研究 组 所有病例符合1 9 8 5 年全国部分省市中西医结合风湿病学术座谈会制定的诊 断标准 且h l a b 2 7 阳性 年龄8 6 8 岁 其中 男7 l 例 女1 5 例 正常对照 4 1 2 例 为山东省立医院健康查体的无血缘关系的随机个体 山东省和济南市中 心血站自愿献血者 对照组无自身免疫性疾病 年龄l o 7 0 岁 其中 男2 6 0 例 女1 5 2 例 2 研究方法 2 1 基因组d n a 抽提a s 病例和健康对照均取静脉血5 m l e d t a k 2 防凝 2 0 保存 用本室研制d n a 提取试剂盒提取全血基因组d n a 2 0 保存 2 2k i r 基因序列特异性引物聚合酶链式反应 s e q u e n c e s p e c i f i cp r i m e r p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n p c r s s p 参照文献及i h w g 推荐的引物序列 共合 成3 0 对引物 由上海博亚生物工程有限公司合成 用p c r s s p 方法进行k i r 基因 频率检测 h l a c w 参照文献共合成引物1 3 对 分别检测m a 曲 0 1 0 8 等位基 因 2 3 对照以k i r 框架基因3 d l 2 3 d l 3 2 d l 4 为阳性对照 以不含d n a 的p c r 体系 作阴性对照 2 4 结果判断p c r 产物经1 5 琼脂糖凝胶电泳 凝胶电泳成像仪观察泳带并保 存图象 根据电泳的结果 对患者组和对照组人群k i r 基因的基因频率 基因型 频率及h l a c w 等位基因频率进行分析比较 2 5 统计学方法 每个k i r 基因及h l a c w 等位基因频率出现频率 p e 通过 计数测得 p f 产基因阳性数 n n 为研究组例数 基因频率 g e n e f r e q u e n c y g f 计算公式为 g f 卜 1 一 k i r 单倍型频率 h a p l o t y p e f r e q u e n c y 单倍型阳性数 2 n n 为研究组例数 患者组与正常对照组 间差异显著性用s p s s 软件计算 结果 3 1 与正常对照人群相比 a s 患者活化性基因k i r 3 d s i 出现频率和基因频率显 著增高 p o 0 5 其他k i r 基因位点频率差异无统计学意义 3 2 活化性k i r 基因数量和a s 相关性 携带2 个或2 个以上活化性k i r 的个体 在a s 患者组占7 7 9 1 在对照组占3 3 7 4 而携带1 个活化性k i r 的个体a s 组占2 2 0 9 在对照组占6 6 2 6 两者差异具有显著性 p 0 0 5 3 3k i r 基因型分析 a s 患者组共检出2 8 种k i r 基因型 其中2 6 种在正常对 照组检出 另外2 种基因型各检出1 例 以3 d l 3 2 d l 3 2 d l 2 2 d l i 2 d p i 2 d l 4 3 d l l 2 d s 4 3 d l 2 模式最多见 占1 2 7 9 该模式在正常对照组占8 0 1 两组 比较差异有统计学意义 p o 0 5 正常对照组共检出7 6 种基因型 基因型 3 d l 3 2 d l 3 2 d l i 2 d p i 2 d l 4 3 d l l 2 d s 4 3 d l 2 组合出现频率最高 占2 0 1 5 该模式在a s 组占5 8 1 两组比较差异有统计学意义 p o 0 5 3 4k i r 基因单倍型分析 a s 患者组共8 6 人 1 7 2 个单倍型 其中单倍型a 1 0 7 个 占6 2 2 1 单倍型b6 5 个 占3 7 7 9 同法对4 1 2 例正常对照所测 基因型进行单倍体分型 单倍型a5 3 3 个 占6 4 6 8 单倍型b2 9 1 个 占 3 5 3 2 两组比较 差异无统计学意义 3 5h i a c 和a s 与正常对照人群相比 a s 患者h i a c w 0 2 基因频率明显升高 p o 0 1 a s 患者表达h l a c w l y s 者比正常对照高 p o 0 5 两组 比较 差异有统计学意义 3 6k i r 2 d s l 及其配体和a s a s 患者k i r 2 d s l 的基因频率与正常对照基本相等 但同时表达其配体h l a c w l y s 者比例明显升高 p o 0 1 结论 1 k i r 基因失衡可能和a s 的免疫病理有关 携带2 个及2 个以上活化性k i r 基因的a s 患者明显高于对照组 致使抑制性和 活化性k i r 受体的失衡 可能降低了n l 细胞和细胞毒性t 淋巴细胞的活化阈值 对自身组织产生免疫应答 2 在特异性配体h l a c w l y s 存在时 k i r 2 d s l 可能是a s 的一个易感基因 3 k i r 3 d s i 可能是是a s 的一个易感基因 本研究提示k i r 基因及其配体h l a c 等位基因平衡紊乱有可能打破n l 细胞和 或t 细胞受体平衡 使n i 细胞和 或t 细胞功能异常而打破机体的免疫自稳状 态 可能是导致强直性脊柱炎的免疫因素 关键词基因 自然杀伤细胞 受体 脊柱炎强直性 基因型 4 a s s o c i a t i o no fk i l l e rc e l li m m u n o g l o b l i n l i k er e c e p t o r s g e n ep o l y m o r p h i s m sw i t ha n k y l o s i n gs p o n d y l i t i s b a c k g r o u n da n do b j e c t i v e p o s t g r a d u a t e j i a oy u l i a n t u t o r p r o z h a oy u e r a n a b s t a c t s p o n d y l o a r t h r o p a t h y s p a w h i c hi sac o l l e c t i v ec o n c e p t r e f e r st oa sag r o u po f r e l a t e dc l l r o m ca u t o i m m u n ed i s e a s e so ft h ej o i n tw i t hd i s t i n c tc l i n i c a lf e a t u r ea n da c o m m o ng e n e t i cc h a r a c t e r i s t i c s r a t h e rt h a no n l yo n ed i s e a s ew i t hd i f f e r e n tc l i n i c a l m a n i f e s t a t i o n s c l i n i c l y s p ac o m p r i s e sf i v em b t y p e s a n k y l o s i n gs p o n d y l i t i s a s r e a c t i v ea n l x i t i s r e a m a j o rp a r t so ft h ea r t h r i t i s s p o n d y l i t i ss p e c t r u ma s s o c i a t e d w i t hp s o r i a s i s p s o a n di n f l a m m a t o r yb o w e ld i s e a s e r o d a n du n d i f f e r e n t i a t e ds p a u s p a o f t h e s ei nt h i sc o n c e p t a si st h em o s tf r e q u e n tp r o t o t y p ed i s o r d e rt h a tm o r e t h a n9 0 c a s e si sa s s o c i a t e dw i t hh u m a n l e u k o c y t ea n t i g e nb 2 7 h l a b 2 7 m o r e o v e r h l a d ra n di la r ea l s oi m p l i c a t e di na s a s 他p r e s e m sac l l r o m c d i s a b l i n gr h e u m a t i cd i s e a s ec h a r a c t e r i z e db yi n f l a m m a t o r y b a c kp a i n r e s t r i c t e ds p i n a lm o b i l i t y f r e q u e n t l yp e r i p h e r a la r t h r i t i s e n t h e s i t i s a n d a c u t ea n t e r i o ru v e i t i s s y m p t o m so fa sc o m m o n l ya p p e a r si nl a t ea d o l e s c e n c ea n d e a r l ya d u l t h o o d a l t h o u g hw o m e na r ea l s oa f f e c t e d at y p i c a lp a t i e n ti say o u n gm a n o f1 5 3 0y e a r so l dw i t hp a i na n ds t i f f n e s si nt h es p i n e t h et a r g e to r g a n si np a t i e n t s w i t ha si n v o l v ei nn o to n l yt h ej o i n t b u tt h eg u t e y e a x i a ls k e l e t o n e n t h e s i s u r o g e n i t a lu a c t a n ds k i n 勰w e l l t h u s a tan o r m a l l yp r o d u c t i v et i m eo fl i f e i ti sa m u l t i d i m e n s i o n a lc o n s t r u c ti nw h i c hp r o b l e m sa tt h eb o d i l y p e r s o n a l a n ds o c i a ll e v e l a r eu n i t e d i fu n d i a g n o s e di nt i m eo rt r e a t e di n a d e q u a t e l y c o n t i n u o u sp a i na n d s t i f f n e s sf a t i g u eo c c u r 勰t h ec o n s e q u e n c e so fa sp r o g r e s s i o n f u r t h e r m o r e a p o t e n t i a l l yp r o g r e s s i v el o s so f s p i n a lm o b i l i t ya n df u n c t i o nr e s u l ti nc o m p r o m i s i n gt h e q u a l i t yo f l i f e t h ee p i d e m i o l o g yo fa si sb e i n gg e n e r a t e d i n d i c a t i n gt h a ta si s l i k e l yt og oo n o c c u p y i n gap r o m i n e n tp l a c ew o r l d w i d e i ti se s t i m a t e dt h a tp r e v a l e n c eo f a si sa b o u t o 2 6 i nc h i n a u n t i ln o w 鹞t h ep r e c i s em e c h a n i s m su n d e r l y i n gt h ei n i t i a t i o na n d p r o g r e s s i o no fa si s s t i l lu n c l e a r t h e r e f u r e s t u d i e so na si sar a t h e rc o m p l e x r e s e a r c hs u b j e c tb e c a u s em u l t i p l eg e n e s e n v i r o n m e n t a la n di n f e c t i o nf a c t o r sa r e i n v o l v e di nt h ep a t h o g e n e s i so fa s t w i na n df a m i l ys t u d i e sh a v er e v e a l e dag e n e t i c c o n t r i b u t i o nt ot h ee t i o l o g yo ft h ed i s e a s ea s p o i n t i n go u tt h a ta si sah i g h l y h e r i t a b l e c o m m o ni n f l a m m a t o r yr h e u m a t i cd i s e a s e s i n c e1 9 7 0 s e v i d e n c eh a si n c r e a s i n g l yp o i n t e dt oh l a b 2 7a st h em a j o rg e n e i n v o l v e di ns u s c e p t i b i l i t yt oa s h o w e v e r g e n o m e w i d es c a na n da s s o c i a t i o ns t u d i e s h a v es h o w n i na d d i t i o nt oh l a r e g i o n so u t s i d et h eh l aa r ea l s oi n v o l v e di n s u s c e p t i b i l i t yt oa s f u r t h e r m o r e t h e r ei sc o m p e l l i n ge v i d e n c et h a tn o n b 2 7g e n e s e i t h e rw i t h i no ro u t s i d et h eh l a a r ei n v o l v e di nd i s e a s ee t i o l o g y i nt h i sr e g a r d r e a c h i n gt h eg o a lf o rt h ee f f e c t i v ed i a g n o s i sa n dm a n a g e m e n to fa sm u s tb eal o n g a n df r u s t r a t i n gr o a dt op r o c e e d c u r r e n t l y a v a l a i b l ed a t ah a v ei n d i c a t e dt h a t t h e r ee x i s t sa ni m b a l a n c eo f t h l t h 2 t y p ec y t o k i n e si np a t i e n t sw i t ha s p a t i e n t sw i t ha sh a v ea ni m p a i r e dt h l c y t o i d n ep r o f i l e i e d e c r e a s e di f n o a n di l 2 a n d i n c r e a s e di l i o c o m p a r e dw i t h h e a l t h yc o n t r o l s b r i d g i n gi n n a t ea n da d a p t i v ei m m u n i t y t h en k c e l li sa ni m p o r t a n t e f f e c t o rl y m p h o c y t et h a tp a r t i c i p a t e si nt h ee a r l yi m m u n er e s p 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