[精品论文] 八氢番茄红素脱氢酶活性测定体系的相关研究.pdf

南开大学 硕士学位论文 八氢番茄红素脱氢酶活性测定体系的相关研究 姓名：戎清清 申请学位级别：硕士 专业：植物学 指导教师：朱晔荣；王勇 2012-05 摘要 摘要 植物体内，类胡萝卜素可以吸收、传递光能，其合成一旦受阻，植物的光 合作用、生长发育将不能顺利进行。八氢番茄红素和六氢番茄红素是类胡萝卜 素合成途径中两种重要的无色类胡萝卜素，因此催化八氢番茄红素脱氢生成六 氢番茄红素的关键酶八氢番茄红素脱氢酶( p d s ) 成为酰胺类除草剂的作用 靶标。近年来，针对该靶标设计合成了许多的目标化合物，本研究拟采用原核 表达系统进行酶活分析，通过摸索底物八氢番茄红素的合成和八氢番茄红素脱 氢酶的表达情况，以及酶活性的分析方法，建立一种稳定，快速，高效的适合 高通量筛选该类除草剂的检测方法。 本论文确定八氢番茄红素h p l c 的条件为：c 1 8 柱，纯乙醇流动相，柱温为 室温，流速为1 m l m i n ，检测波长为2 8 6 n m 。探究了光对八氢番茄红素稳定性 的影响，结果显示光源导致其氧化降解程度大小为：白炽灯 自然光。对于p d s 酶的表达，成功转化获得了ec o l ib l 2 1 ( d e 3 ) p l y s s 、ec o l ir o s e t t a t m 2 ( d e 3 ) p l y s s 以及ec o l ij m l 0 9 三种p d s 蛋白原核表达菌株，并进行了p d s 蛋白原核 表达的初步研究，包括菌体的培养时间、温度、诱导时间等，结果显示3 7 。c 下， 菌体生长o d 6 0 0 为0 6 0 8 时，加入i p t g 终浓度为l m m o l l ，2 8 下表达4 至5 个小时是较适宜的表达条件；摸索了促进ec o l ir o s e t t a t m 2 ( d e 3 ) p l y s sp d s 蛋 白可溶性表达的条件，包括菌体裂解方式和不同调节剂的添加，如蔗糖，n a c l ， 以促进可溶性p d s 的表达。 另外，本研究还初步建立了两种p d s 酶活测定体系：体外酶活分析和体内 酶活测定。分别进行了三种ec o l i 表达菌株中p d s 酶活性的测定分析，得到了 能同时合成底物八氢番茄红素和表达八氢番茄红素脱氢酶的ec o l ij m l 0 9 ，为进 行体内酶活测定提供了实验材料，研究结果为除草剂筛选系统的进一步建立提 供了基础。 关键词：八氢番茄红素八氢番茄红素脱氢酶h p l c 可溶性表达酶活测定 除草剂筛选 a b s t r a c t a b s t r a c t c a r o t e n o i d sp l a yav i t a lr o l ei np h o t o s y n t h e s i s ，g r o w t ha n dd e v e l o p m e n to f p l a n t t h e r ea r et w oi m p o r t a n tc o l o r l e s sc a r o t e n o i d si nt h ec a r o t e n o i db i o s y n t h e t i cp a t h w a y ： p h y t o e n ea n dp h y t o f l u e n e ，w h i c ha r es u b s t r a t e so fp h y t o e n ed e s a t u r a s e ( p d s ) p d s i st h et a r g e to fa m i d eh e r b i c i d e s i nr e c e n ty e a r s ，m a n yc o m p o u n d st h a tm a yi n h i b i t t h ea c t i v i t yo fp d sh a v e b e e ns y n t h e s i z e d i nt h i ss t u d y , t w op r o k a r y o t i ce x p r e s s i o n s t r a i n sh a v e b e e nu s e df o rs y n t h e s i z i n gp h y t o e n ea n de x p r e s s i n gp h y t o e n ed e s a t u r a s e ， r e s p e c t i v e l y , t ot e s tt h ep d se n z y m a t i ca c t i v i t y w eh a v et r i e dt oe s t a b l i s has t a b l e ， f a s ta n de f f i c i e n th i g h - t h r o u g h p u ts c r e e n i n gs y s t e mf o rs e l e c t i n gn e wc o m p o u n d sb y a n a l y z i n g i t si n h i b i t i o nt op d se n z y m a t i ca c t i v i t y i nt h i ss t u d y , h p l ca n a l y s i sc o n d i t i o n sw e r eo p t i m i z e d w ef o u n dt h a t10 0 e t h a n o la sm o b i l ep h a s ew a sb e t t e rt h a nm e t h a n o lw h e nu s i n gac 18c o l u m na n d r u n n i n ga tr o o mt e m p e r a t u r ea n dlm l m i nf l o wr a t e t h ed e t e c t i o nw a v e l e n g t hw a s 2 8 6 n m b e s i d e s ，t h ei n f l u e n c eo fl i g h tt op h y t o e n el o s sw a sa s s a y e d ，a n dt h er e s u l t s h o w e dt h a ti n c a n d e s c e n t l i g h tc a u s e dm o r eo x i d a t i v ed e g r a d a t i o nt op h y t o e n e c o m p a r e dt ot h a to fn a t u r a ll i g h t m e a n w h i l e t h r e eec o l ip r o k a r y o t i ce x p r e s s i o n s t r a i n s ：e c o l ib l 2 1 ( d e 3 ) p l y s s , e c o l ir o s e t t a t m 2 ( d e 3 ) p l y s sa n de c o l ij m l 0 9 h a v eb e e nu t i l i z e dt oe x p r e s sp d sp r o t e i n t h ee x p r e s s i o no fs o l u b l ep d sw a s a n a l y z e di nec o l ir o s e t t a t m 2 ( d e 3 ) p l y s s , f o rw h i c ht h ec u l t u r et i m e ，t e m p e r a t u r e a n dt h ec o n c e r t r a t i o na n di n d u c t i o nt i m eo fi p t gw e r ec h a n g e d t h er e s u l t ss h o w e d t h a tt h el e v e lo fp d se x p r e s s i o nw a sh i g h e rw h e no d 6 0 0w a sb e t w e e n0 6a n d0 8 ， i p t gc o n c e n t r a t i o nw a slm m o l l ，a n de x p r e s s i o nt i m ew a s4 h - 5 h t h ee f f e c t so f d i f f e r e n tb a c t e r i a ll y s i sm e t h o d sa n ds o m es u b s t a n c e sa d d e dt ot h ee x p r e s s i o ns y s t e m w e r ea l s os t u d i e di nec o i lr o s e t t a t m 2 ( d e 3 ) p l y s s t w ok i n d so fa c t i v i t yd e t e r m i n a t i o ns y s t e m sw e r ee s t a b l i s h e d ：i nv i t r oe n z y m a t i c a c t i v i t ya s s a ya n di nv i v oe n z y m a t i ca c t i v i t ya s s a y i i lt e r m so ft h ei nv i t r oa s s a y , w e 砸e dt h r e ep d sf r o md i f f e r e n te x p r e s s i o ns t r a n s t oe s t a b l i s h8 1 1i nv i v oa s s a y , w eg o t at r a n s f o r m a n tw h i c hc o n t a i n e db o t ht h ep a c cp l a s m i d ( p r o d u c i n gp h y t o e n e ) a n dt h e i l a b s t r a c t 一 p e t - p d sp l a s m i d ( e x p r e s s i n gp d sp r o t e i n ) a b o v er e s u l t s p r o v i d ef o u n d a t i o n a l i n f o r m a t i o nf o re s t a b l i s h i n ga n do p t i m i z i n gt h ep d ss c r e e n i n gs y s t e mi nt h ef u t u r e k e yw o r d s ：p h y t o e n e p h y t o e n ed e s a t u r a s e h p l c e x p r e s s i o no fs o l u b l e p r o t e i na c t i v i t yd e t e r m i n a t i o n h e r b i c i d es c r e e n i n g i i i 第一章引言 第一章引言 第一节八氢番茄红素的相关研究 1 1 1 八氢番茄红素的生物合成 八氢番茄红素( p h y t o e n e ) 是生物体内类胡萝卜素合成途径中一个重要的产 物，八氢番茄红素是此途径中合成的第一个类胡萝卜素类物质，也是4 0 个碳的 碳氢化合物，属于类异戊二烯聚合物及萜类【l 】【2 1 。像胡萝卜素一样，八氢番茄红 素普遍存在于高等植物、藻类等光合自养生物以及非光合生物如动物、非光合 细菌和真菌中。据文献报道【引，它的合成开始于两个牦牛儿基牦牛儿基焦磷酸( g e r a n y l g e r a n y lp y r o p h o s p h a t e ，g g p p ) 分子的缩合，首先形成中间过渡性形式一 一前八氢番茄红素焦磷酸【4 】，然后在酶的作用下切去焦磷酸基团，再经过结构上 的三维变化，进而生成1 5 顺式一八氢番茄红素【5 】【6 】，之后经过去饱和反应，脱去 两个氢原子生成六氢番茄红素，然后再经过四步去饱和脱氢反应，加入四个新 的碳碳双键，最终形成第一个有色类胡萝卜素红色的番茄红素( 1 y c o p e n e ) 【7 】【8 】【9 】，由此再经过衍生反应生成其他的类胡萝卜素【1 0 ( 见图1 1 ) 。 异戊- j _ _ 肝鼍型竺! ：竽瑚 即二甲基两蜡基= - 一 。；滋蟊。黜黜斛，一，一 m r m “ b j - j 哆b r 气冉丫p y l o ，、船茄红曩 一 l ， d h w h j ；p j ，j p 。寸审一 勺丫9 h y 砷u 崎六氲赫虹曩 m l l c w * , o 人o j p o o q 吖、一v ”r ：q n m - 胡，r 素 ；m k b j 。p q 勺丫“m 蚴 o d 志v 融卜q 一丫烊p 懈叠茹缸蠢 “喀q r - i c y 一， 、l ，伽_ n ，h ，d - 改沁“q k 。 。怠q 。p 硷 墨慧i - l l = = 了三。；= 兰鼍2 髯写黧量0 嘲萝* q m 硇i _、工响晔_ _ ，h = y d 一r a m 砷一 t 一聊，r i 、- p p m t 肿”；百，“b q ”p 翻 ! ”蝌“ t潲v 敬“确改沁战_ 胡 图1 1 类胡萝卜素合成图( 修改) l 第一章引言 1 1 2 八氢番茄红素的结构特征、理化性质 1 1 2 1 八氢番茄红素的共轭结构及异构体 八氢番茄红素的主链碳骨架结构中包含有异戊二烯五碳单位。异戊二烯是 一种共轭二烯烃类物质，化学名称是2 甲基1 ，3 丁二烯，分子式为c s h s ，结 构式见图1 2 。因为这个五碳化合物结构中存在有典型的共轭双键，所以它是众 多新陈代谢物质( 如维生素a 、胡萝卜素等) 的基本组成结构单元。所谓共轭双 键，即由一个碳碳单键隔开的两个碳碳双键，以c = c c = c 表示，该结构的存在 会影响物质本身的颜色特征和理化性质，而且随着共轭双键数目的不断增多， 物质的最大吸收波长将变长，此类化合物的颜色也会逐步加深【1 1 】。 c h 3 i 。 c h 2 一c c i _ = c h 2 图1 2 异戊二烯结构式 八氢番茄红素的结构只有三个共轭双键( 见图1 3 ) ，自然界中，共轭双键 数目必须大于7 个，其吸收波长才能到达可见光区，该物质也才能呈现出人眼 能够识别的色彩【1 2 】。双键的存在，使得八氢番茄红素有l5 顺式和全反式两种同 分异构体( 见图1 3 ) 。在人体内，这两种异构体的含量比例依据器官功能而异。 在肾上腺和血浆中，1 5 顺式八氢番茄红素和全反式八氢番茄红素的的比例基 本维持在1 ：1 ，但是在肝脏、脾中，全反式八氢番茄红素的含量是1 5 顺式八氢 番茄红素含量的三倍，这也说明全反式八氢番茄红素的活性要强于1 5 顺式八 氢番茄红素【1 3 】。在细菌与植物质体中的类胡萝卜素合成途径中主要生成的是1 5 顺式八氢番茄红素。 l l l - - t t t a s - p h yt o en c 。 图1 3 八氢番茄红素同分异构体 1 5 - c i s p h y t o e n e ：1 5 顺式八氢番茄红素；a l l - t r a n s p h y t o e n e ：全反式- 八氢番茄红素 2二 第一章引言 1 1 2 2 八氢番茄红素的理化性质 八氢番茄红素脱氢形成的六氢番茄红素具有五个共轭双键( 见图1 4 ) ，它 们都是无色类胡萝卜素。除此之外都为有色类胡萝卜素，有色类胡萝卜素共轭 双键数目多且具有不同的长链结构和官能团，因此颜色各有不同，如玉米黄质 ( z e a x a n t h i n ) 、1 3 胡萝卜素( 1 3 c a r o t i n ) 、番茄红素( 1 y c o p e n e ) 、虾青素( a s t a x a n t h i n ) 、角黄素( c a n t h a x a n t h i n ) 等( 见图1 5 ) 。 ，广戡。 ，。 图1 4 八氢番茄红素和六氢番茄红素结构式 p h y t o e n e ：八氢番茄红素；p h y t o f l u e n e 六氢番茄红素 l 孙删州 2 攀肌棚 3 鬃认、“认” 、 、， i j d ”，3 4 1 帕型铆 5 霉扩剖 图1 5 常见有色类胡萝卜素的颜色及结构 1 ：玉米黄质；2 ：1 3 胡萝卜素；3 ：番茄红素；4 ：虾青素；5 ：角黄素裸藻酮 八氢番茄红素是不饱和脂溶性类胡萝卜素，不溶于水，可溶于甲醇、乙醚、 石油醚、氯仿、苯等有机溶剂。i u p a c ( 国际纯粹与应用化学联合会) 英文名 称是6 e ，i o e ，1 4 e ，1 6 z ，1 8 e ，2 2 e ，2 6 e 2 ，6 ，1 0 ， 1 4 ，1 9 ，2 3 ，2 7 ，3 1 - o c t a m e t h y l d o t r i a c o n t a - 2 ，6 ，1 0 ，l g ，1 6 ，1 8 ，2 2 ，2 6 ，3 0 - n o n a e n e ；其他名称有 1 5 一c i s p h y t o e n e ；7 ，7 ，8 ，8 ，1 1 ，1 1 ，1 2 ，1 2 - o c t a l l y d r o - 1 l r ，1 l r - c a r o t e n e ； 3 第一章引言 分子式为c 4 0 h “；分子量为5 4 4g m o l 可以顺反异构化，可以被氧化剂氧化， 光源的照射也对其有较大的氧化伤害；可以耐受一定范围的高温( e 娶 睦 撩 楼 1 鲁 脯 、 图3 1h p l c 检测八氢番茄红素回归曲线 3 1 2h p l c 检测条件的优化 根据文献报道并结合本实验室的前期工作，当以纯甲醇作为流动相时， 2 8 6 n m 下，八氢番茄红素的保留时间为7 0m i n 左右，保留时间过长严重影响了 工作效率，也降低了体系的稳定性，导致谱带变宽，增加了结果的误差。一般 改进的方法是改变流动相中不同组分的比例。本实验中，八氢番茄红素的分子 结构中全部为碳氢键，极性较小，而反相色谱中固定相的极性要小于流动相， 根据相似相溶的原理，样品的极性越小，样品与固定相结合的时间越长，洗脱 时间越长，保留时间越大，所以为了缩短保留时间，就要减小流动相的极性。 常用流动相中，乙醇的极性要小于甲醇，本实验中探究了甲醇和乙醇不同比例 组合对保留时间的影响。另外，柱温是影响保留时间的一个重要因素，温度升 高时，色谱柱中固定相与样品分子的结合能力下降，因此温度增高，样品分子 与固定相结合作用减小，出峰时间变短，而流速的增加，也会相应缩短样品的 出峰时间。 实验发现，当流动相从纯甲醇逐渐过度为纯乙醇，柱温从室温升高到3 5 ， 流速从1 m l m i n 增加到1 5 m l m i n 时，保留时间呈现减小的变化，结果见表3 1 。 当检测条件变为纯乙醇做流动相，柱温为室温，流速为l m l m i n 时，我们发现， 2 7 第三章结果与讨论 此时的保留时间较为理想，为9 1 m i n ( 见图3 2 ) ，而且柱压变化也很小，柱效、 分离度也较高，于是确定此时的检测条件为八氢番茄红素h p l c 的检测条件。 图3 2h p l c 检测八氢番茄红素：流动相为纯乙醇，保留时间为9 1 m i n 表3 1h p l c 检测条件组合 3 1 - 3 八氢番茄红素最低检测浓度的确定 h p l c 检测中，检测物浓度的确定对于整个体系至关重要。虽然被测体系中 底物的含量在较高的浓度时能得到更好的反映，但是过高的底物浓度，会超过 柱子的承载范围和检测器的检测范围，进而导致出现平头峰、拖尾峰、裂峰等 情况；但是如果底物浓度过低，就无法达到仪器所要求的灵敏度，也就无法准 确检测出底物的含量【6 引。 最低检出限是指某一特定分析方法中，在给定的显著性水平内，可以定性 地从样品中检测出待测物质的最小浓度或最小量。计算方法为：被测样品信号 2 8 第三章结果与讨论 强度是噪音( 或背景信号) 强度1 0 倍时所对应的样品浓度值。由于本实验没有购 买到八氢番茄红素标样，所以确定的最低检出限的浓度值由回归曲线查得后以 原液倍数关系来表示。由图3 3 可以计算出噪音强度为：0 0 3 m v ，而此时信号强 度为噪音强度1 0 倍的信号峰的峰面积为7 8 0 9 9 m v ，将此面积带入到回归曲线方 程可以得出此时信号峰浓度为原液o 1 0 8 9 7 1 倍时对应的浓度值。由此我们可以 确立酶活测定体系中八氢番茄红素含量的最低值，从而指导酶促反应之前应该 加入的底物八氢番茄红素的最少量。 图3 3h p l c 噪音强度 3 1 4 八氢番茄红素稳定性的研究 据文献报道【6 6 】，八氢番茄红素遇光易被氧化，在一般的存放条件下，很不 稳定，容易发生顺反异构化或被氧化降解，降解后产物多为醛、酮类化合物。 在酶活测定时，取样加样等过程中，八氢番茄红素会不可避免地暴露于光中， 因此由于氧化而导致的含量的减少，势必会给实验带来系统误差。于是我们探 究了光照对本实验室工程菌生产的八氢番茄红素稳定性的影响，对其进行了黑 暗、自然光照射、白炽灯照射处理。将新提取的八氢番茄红素分为三组，每组 三个平行，放置于透明的e p p e n d o r f 管内，密封后分别放置于黑暗、自然光、白 炽灯下，每隔一定时间取样，采用h p l c 检测分析八氢番茄红素含量的变化。 白炽灯组中，光源为1 0 根三基色灯管，光照强度为7 0l am o l m 2 s ，样品放置垂 直距离为1 5 厘米，每隔一定时间，检测八氢番茄红素的含量变化( 见图3 4 、 图3 5 ) 。 从图3 4 可以看出，在黑暗条件下放置的八氢番茄红素在7 2 小时内的含量 变化很小，即八氢番茄红素在黑暗条件下很稳定。当处于自然光照条件下时( 见 2 9 第三章结果与讨论 图3 5 ) ，1 天之内八氢番茄红素的含量就开始减少，当八氢番茄红素处于白炽灯 下时，相比于自然光下含量的减少更为明显，这说明，白炽灯光下放置的八氢 番茄红素氧化程度最大。但是，在4 小时之内，无论是处于什么光照条件下， 外界光照对八氢番茄红素的氧化程度极弱，这也就保证了在酶活测定过程中底 物的稳定性，避免了因为底物性质不稳导致被降解而带来的实验误差。 ，- 、 逞 娶 喹 躲 总 樱 糨 蛹 、 逞 娶 眶 搬 楼 牺 脯 、 - 4 1 - 燃1 1 膏 t ， 0 5 h2 5h2 4 h 4 8 h 时间( 小时h ) 图3 4 黑暗条件下八氢番茄红素含量的变化 时间( 小时h ) 图3 5 自然光和白炽灯照射条件下八氢番茄红素含量的变化 3 0 o 0 o o o o o o o 0 o o o o o 0 o 0 o o o o o o o o o o o o o o o o o o 0 o o o 9 7 5 j 1 9 7 s ，工，j，j， l o o o o 0 o o o 0 o o o o o o o o o o o o 0 o o o o o o o 0 o o 0 0 o o o o o o 9 7 s 3 1 9 7 s 1 1 1 ，j 1 第三章结果与讨论 第二节p d s 蛋白原核表达的研究 3 2 1p d s 蛋白表达菌株的获得及鉴定 建立p d s 酶活测定方法是以p d s 为靶标的除草剂筛选体系中一个必不可少 的重要环节，所以利用含有p d s 基因的工程菌表达p d s 活性蛋白酶，也就成为 重中之重。我们实验室前期也进行了相关实验的研究，重新构建了p d s 的表达 载体p e t - 1 5 b - p d s 。p e t - 1 5 b 载体是一个常用的原核表达载体，它具有双链环状 d n a ，由5 7 0 8b p 个碱基组成。此外，本实验室通过p c r 重新克隆到了大小为 1 4 2 5 b p 的p d s 基因，并在p d s 基因两端分别加上b a m hi 和n d ei 酶切位点， 由此成功获得了p e t - 1 5 b - p d s 表达载体，用于p d s 蛋白的原核表达。 3 2 1 1p e t - 1 5 b - p d s 转化ec o bb l 2 1 ( d e 3 ) p l y s s 的分子鉴定 p e t - 1 5 b 的宿主菌ec o l ib l 2 1 ( d e 3 ) p l y s s 的基因型为：f - ，o m p t ， h s d s b ( r b m b ) ，d c m ( d e 3 ) ，g a l ，p l y s s ，该菌株所带p l y s s 具有氯霉素抗性， 能够进行i p t g 诱导的表达。p e t - 1 5 b - p d s 转化ec o l ib l 2 1 ( d e 3 ) p l y s s 茵落p c r 鉴定中( 见图3 6 ) ，检测到了1 4 2 5 b p 的目的条带，提取阳性转化子中的质粒， 电泳检测结果如图3 7 。进一步将质粒进行b a m hi 和n d ei 双酶切鉴定，如图 3 8 ，泳道1 显示b a m hi 和n d ei 双酶切阳性质粒得到了两个线性片段，大小符 合p e t - 1 5 b 载体片段和p d s 基因片段长度，分别是5 7 0 8b p 和1 4 2 5 b p 。综上所 述通过菌裂解p c r ，质粒电泳和酶切检测，说明p e t - 1 5 b - p d s 表达载体成功转 化入ec o l ib l 2 1 ( d e 3 ) p l y s s 中，从而得到了转化有p e t - 1 5 b - p d s 的ec o l i b l 2 1 ( d e 3 ) p l y s s 的p d s 蛋白表达菌株。 图3 6p e t - 15 b - p d s 转化ec o l ib l 21 ( d e 3 ) p l y s s 菌落p c r 电泳检测图 3 l 第三章结果与讨论 m ：l k bd n a l a n d d e rm a r k e r ；1 ：负对照；2 、3 ：转化子； ml 2 图3 7 p e t - 1 5 b - p d s 转化ec o l ib l 2 1 ( d e 3 ) p l y s s 质粒电泳检测图 m ：l k bd n al a n d d e rm a r k e r ；1 、2 ：转化子的质粒； 2 0 0 0 b p 1 0 0 0 b p 图3 8p e t - 1 5 b - p d s 转化子质粒d n a 的b a m hi 和n d e i 双酶切电泳检测图 m - l k bd n a l a n d d e rm a r k e r ；l ：转化于质粒b a m hi 和n d ei 双酶切； 3 2 1 2p e t 1 5 b 廿d s 转化ec o l ir o s e t t a t m 2 ( d e 3 ) p l y s s 的分子鉴定 p e t - 1 5 b - p d s 转化ec o l ir o s e t t a t m 2 ( d e 3 ) p l y s s 菌落p c r 鉴定中( 见图3 9 ) ， 检测到了1 4 2 5 b p 的目的条带，提取阳性转化子中的质粒进行p c r 鉴定，电泳检 测与预期相符( 如图3 1 0 所示) 。进一步将质粒进行b a m hi 和n d ei 双酶切鉴 定，结果如图3 1 1 ，泳道2 和泳道3 显示了b a m hi 和n d ei 双酶切后得到的线 性片段，有大小分别为5 7 0 8b p 的p e t - 1 5 b 载体片段和1 4 2 5 b p 的p d s 基因片 段。综上所述通过菌裂解p c r ，质粒p c r 和酶切检测，p e t - 1 5 b p d s 载体己经 成功转化入ec o l ir o s e t t a t m 2 ( d e 3 ) p l y s s 菌中，从而得到了p e t - 15 b - p d s 转化 3 2 bb p p p p p p vkvb k u b b b o o v o o o o o o v o o o o 0 0 0 o o o o l口06 s，3 2 p b p p p p p o b b b b b o 0 d o o o o o o o o o o o 0 o o o 1 8 6 5 4 3 第三章结果与讨论 ec o l ir o s e t t a t m 2 ( d e 3 ) p l y s s 的p d s 蛋白表达菌株。 2 0 0 0 b p 1 0 0 0 b p ml23 1 4 2 5 b p 图3 9p e t - l5 b - p d s 转化e c o l ir o s e t t a t m 2 ( d e 3 ) p l y s s 菌落p c r 电泳检测图 m ：1 k bd n a l a n d d e rm a r k e r ；1 ：r o s e t t a 空菌负对照；2 、3 - 转化子； 1 0 0 0 b p ml2 3 1 4 2 5 b p 图3 1 0p e t - 1 5 k p d s 转化e c o l ir o s e t t a t m 2 ( d e 3 ) 础泸s 质粒p c r 电泳检测图 m ：1 k bd n al a n d d e rm a r k e r ；1 ：负对照；2 、3 ：转化子； 3 3 p b p p p p p o b b b b b o o o o 0 o o o o o o o 0 0 0 o 0 d 1 8 6 5 l 3 p b pfdp p nvbkp、yio1v b 00vn5 o ounuvvnu-nvnv o008 o ol口口-， 第三章结果与讨论 5 7 0 8 b p 1 4 2 铀p 图3 i ip e t - 1 5 b p d s 转化ec o l i r o s e t t a t m 2 ( d e 3 ) p l y s s 质粒 b a m hi 和n d ei 双酶切电泳检测图 m ：l k b d n a l a n d d e r m a r k e r ：1 ：r o s e t t a 空菌；2 、3 ：转化子质粒b a m hi 和n d ei 双酶切； 3 2 2p d s 蛋白的原核表达及可溶性表达的摸索 3 2 2 1 三种表达菌株中p d s 蛋白的表达 通过上述转化和分子鉴定，我们已经成功拿到了p e t - 1 5 b - p d s 转化ec o l i b l 2 1 ( d e 3 ) p l y s s 、p e t - 1 5 b p d s 转化ec o l ir o s e t t a t m 2 ( d e 3 ) p l y s s 以及实验室 保存的p g - p d s 转化j m l0 9 的三个表达菌株。我们用上述三个表达菌株进行了 初步的诱导表达，将得到的粗酶液进行s d s p a g e 电泳检测。在图3 1 2 中，泳 道1 显示，p e t - 1 5 b - p d s 在新转化的b l 2 1 菌株中得到表达，在5 3 2 9 6k d a 处 有一条蛋白条带，而不带p d s 基因的空菌( 泳道4 ) 没有这条特异的条带，泳 道2 、3 中显示了p g - p d s 蛋白在j m l 0 9 菌种的表达情况。虽然，p d s 蛋白在 b l 2 1 菌株和j m l 0 9 菌种中都得到了表达，但是表达量很低，而且我们研究发现， 这两个菌株中p d s 蛋白的表达情况很不稳定，在经过几次传代培养之后，表达 量非常少，甚至停止表达( 见图3 1 3 和图3 1 4 ) 。经过稀有密码子分析软件的检 测分析，发现在p d s 的氨基酸序列中含有约2 2 的稀有密码子。原核表达体系 中，当异源目的基因在ec o l i 中过表达时，一个或多个t r n a 的稀有或缺少可 能导致翻译的停止，不充足的t r n a 库可能会导致翻译延迟、成熟前翻译终止、 翻译移码和氨基酸错配等，由此推测可能是稀有密码子的大量存在导致了较低 水平的表达及翻译的终止。 第三章结果与讨论 9 7 ，2 功- 一 6 6 功i “3 功i 一 2 9 。o 皿一 2 0 1 d i ml25l5 # 镕 一5 3 2 9 6 d l 图3 1 2 p e t - 1 5 b - p d s 转化ec o l ib l 2 1 ( d e 3 ) p l y s s 蛋白表达和 p g - p d s 转化j m l 0 9 蛋白表达的s d s - p a g e 电泳图 m ：低分子量蛋白m a r k e r ；1 ：p e t - 1 5 b - p d s 转化ec o l i b l 2 1 ( d e 3 ) p l y s s p d s 蛋白表达； 2 、3 ：p g - p d s 转化j m l 0 9p d s 蛋白表达；4 ：b l 2 1 空菌；5 ：j m l 0 9 空菌 12m34 9 7 2 功i 一 6 6 1 n 一 4 4 3 d 蒸瀑。5 _ 9 6 鬻鬻 雠埔黛_ i 2 0l 【d t 一 2 k 图3 1 3p e t - 1 5 b - p d s 转化ec o l ib l 2 1 ( d e 3 ) p l y s sp d s 蛋白表达s d s - p a g e 电泳图 m ：低分子量蛋白m a r k e r ；1 ：b l 2 1 空菌沉淀；2 ：p e t - 1 5 b - p d s 转化ec o l ib l 2 1 ( d e 3 ) p l y s s 沉淀中p d s 蛋白；3 ：p e t - 1 5 b - p d s 转化ec o l ib l 2 1 ( d e 3 ) p l y s s 上清中p d s 蛋白； 4 ：b l 2 1 空菌上清 9 7 2 d 一o “i 功i 一_ “5 d - 一瓣 觏一5 5 2 9 6 d t 图3 1 4p g - p d s 转化j m l 0 9p d s 蛋白表达s d s p a g e 电泳图 m ：低分子量蛋白m a r k e r ； 1 ：转化有p g - p d s 的j m l 0 9 上清液中p d s 蛋白 2 ：转化有p g - p d s 的j m l 0 9 沉淀中的p d s 蛋白 3 5 裁囊 第三章结果与讨论 相比于ec o l ib l 2 1 ( d e 3 ) p l y s s 菌株和ec o l ij m l 0 9 菌株，ec o l ir o s e t t a t m 2 ( d e 3 ) p l y s s 菌株，也常被用做表达菌株。r o s e t t a 菌株能够由一种氯霉素抗性的、 与p e t 相容的质粒提供a u a ，a g g ，a g a ，c u a ，c c c 和g g a 的t r n a ， 所以这类菌株能够明显改善大肠杆菌中由于稀有密码子造成的表达限制【6 9 1 ，提 高外源基因，尤其是真核基因在原核系统中的表达水平，因而具有较高的表达 量，从图3 1 5 可以看出，p e t - 1 5 b - p d s 转化r o s e t t a 菌株后，p d s 蛋白表达量有 了明显的增高。但是，超声之后发现p d s 蛋白基本都在沉淀中，形成了包涵体 ( 见图3 1 6 ) ，所以需要进一步优化r o s e t t a 菌株的表达条件。 卯z 印t 一一攀霉豢豢鋈蘩 z = 霉蠢蠢纛搏组拼如。“；m 一薰豢蠢分s ，：蛐t z 妨a 一一薰琴蓁霉薰爹 123456 黔” i 套! 三三豢三薹薹黧豢一豇：，。皿。 6 6 4 助i 一# ”7 囊覆鍪 通 一案匪，羹j 翟匿 一 4 4 3 妣一獬攀獬势鬈繁零 ：皿。一豢藜鍪 霸蝴女 要 ： 一 图3 1 6p e t - 1 5 b - p d s 转化e c o l ir o s e t t a 刑2 ( d e 3 ) p l y s sp d s 蛋白表达的s d s p a g e 电泳图 m - 低分子量蛋白m a r k e r ；1 ：r o s e t t a 空菌上清：2 、3 ：转化子上清中p d s 蛋白； 4 ：r o s e t t a 空菌沉淀；5 6 ：转化子沉淀中p d s 蛋白 3 2 2 2ec o l ir o s 舻2 ( d e 3 ) p l y s s 菌株p d s 蛋白可溶性表达的摸索 1 表达时间对p d s 蛋白可溶性表达的影响 3 6 蝴鬻瓣 羹 第三章结果与讨论 在菌体生长到对数期时加入诱导物，蛋白表达后，随即开始蛋白的折叠和 加工过程，诱导时间的不同，会影响其折叠和加工过程的充分进行，如果此过 程未完全进行即蛋白折叠没有完成，就会出现折叠中间体，即形成包涵体。所 以，在表达菌液中加入诱导物i p t g ( 终浓度为1m m o l l ) 后，放置在2 8 。c 恒 温培养箱中，分别震荡培养1h 、2h 、4h 、8h ，然后收集菌体，超声裂解，s d s - p a g e 鉴定表达时间对p d s 可溶性表达的影响情况。 从图3 1 7 可见，从加入诱导物起，在8 个小时之内，随着表达时间的增加， p d s 的表达量有所增加。但是，超声波裂解菌体后发现，分别表达1 h ，2 h ，4 h ， 8 h 的p d s 蛋白都形成了包涵体，并且，当表达1 h 时，包涵体就已经形成。因 为r o s e t t a 菌株含有稀有密码子的量比较高，所以其表达速度较快，表达1 h 时， 总体表达量就已经很高，但是超高的表达速度使得蛋白来不及正确折叠，如此 高速的表达，可能是导致形成包涵体的原因之一。 土煎避 mc 一1 h2 h4 h8 h l h2 h4 h8 h 9 7 2 皿一” 6 6 4 功i t 一。”、+ 。_ - ，_ - ，掣睁一5 3 2 9 6 k i ) # 4 4 3 i i ) i 一鼯赢溢* 豁一一 一x 黼。” ，r 。m 。* m 撩j 紫4 2 9 o 如i 一, , j i i i i l l 豢篡 图3 1 7p e - 1 5 b - p d s 转化ec o l ir o s e t t a t m 2 ( d e 3 ) p l y s s p d s 蛋白表达s d s - p a g e 电泳图 m ：低分子量蛋白m a r k e r ；c ：p e t - 1 5 br o s e t t a 对照上清；l h 、2 h 、4 h 、8 h ：p e t - 1 5 b - p d s r o s e t t a 2 表达温度和诱导物i p t g 浓度对p d s 可溶性表达的影响 在原核表达体系中，表达稳定对于菌体自身的生长活力和表达能力有重要 的影响，温度高时，菌体生长快，表达速度加快，同时也会增加包涵体形成的 概率；温度低时，菌体自身生长活性受到抑制，表达活性也会降低，会影响目 的蛋白的表达水平。构建大肠杆菌表达系统时，i p t g 诱导的l a c 乳糖操纵子调 控基因是常用元件，i p t g 具有一定的细胞毒性，菌体的生长在过高的i p t g 浓 度下会受到抑制，而i p t g 浓度低时导致细胞中的诱导力不足，降低蛋白表达量。 所以，在本实验中需要对表达温度和诱导物浓度的组合进行优化，以期得到较 多的可溶性蛋白。表达菌株活化之后，待长至适宜o d 6 0 0 值时，向培养液中加入 3 7 第三章结果与讨论 不同终浓度的i p t g ，设置不同的温度条件，恒温震荡培养，具体条件设置见表 3 2 ，待表达结束后收集菌体，超声裂解，s d s p a g e 鉴定。 表3 2 不同温度和p t g 浓度组合 注：表示按照该组合的表达条件进行实验；表示此组合的表达条件没 有进行实验。 在2 8 c 下，大肠杆菌菌体活力旺盛，此温度是表达外源蛋白的常用温度。 由图3 1 8 可见，在表达温度为2 8 ，表达时间为4 小时， p t g 浓度从0 m m o u l 逐渐增加到l m m 0 1 l ，p d s 的总体表达量在增加，但是超声波裂解菌体后发现， 包涵体的量很高，在i p t gl m m o l l 时在上清中才能检测到可溶性蛋白。所以， 2 8 下，诱导物的降低并没有明显改善p d s 可溶性表达。 塑墨莛 mc 一0 刈0 c 一叫o 柚0 l 9 7 2