硕士学位论文-MrgC受体对神经病理性痛的调制和AM在疼痛中的作用研究.doc

中文文摘学校编号 10394 图书分类号 学 号 20111045 密 级 全 日 制 研 究 生 硕 士 学 位 论 文MrgC受体对神经病理性痛的调制和AM在疼痛中的作用研究Modulation effect of Mas-related gene receptors on neuropathic pain and the role of adrenomedulline in pain 学 科 专 业： 细胞生物学 研 究 方 向： 神经生物学 指 导 教 师： 申请学位级别： 理学硕士 论文提交日期： 2014年 月 日 论文评阅人： 论文答辩日期： 2014年 月 日 答辩委员会主席： 学位授予单位： 福建师范大学 学位授予日期： 年 月 日 2014 年 月 中文摘要Mrg受体（Mas-related gene receptors）是一种仅存在于三叉神经节（trigeminal，TG）和背根神经节（dorsal root ganglia，DRG）中小型神经元上的G蛋白偶联受体，又被称为感觉神经元特异性受体。牛肾上腺髓质素8-22（bovine adrenal medulla peptide 8-22，BAM8-22）作为Mrg C受体特异性激动剂，可以抑制神经病理性痛大鼠的痛觉过敏。研究表明星形胶质细胞、Fractalkine、IL-1在神经病理性痛的发生中具有重要作用，研究同时发现AM作为CGRP家族成员也参与了疼痛的发生。本实验通过大鼠机械刺激痛阈值测定、免疫荧光组织化学染色等实验技术，研究了：（1）鞘内注射Mrg受体激动剂BAM8-22对大鼠机械痛阈值的影响和对大鼠脊髓背角中星形胶质细胞表达的影响；（2）鞘内注射BAM8-22对神经病理性痛大鼠DRG中fractalkine及IL-1表达的影响；（3）鞘内注射AM及H89对大鼠热痛觉过敏的影响。结果显示：（1）大鼠脊神经结扎处理后第10天机械阈值下降至基础值的50%左右，产生痛觉过敏。鞘内注射BAM8-22后能恢复大鼠的机械缩爪阈值，减轻脊神经结扎引起的机械痛觉过敏。（2）脊神经结扎能使脊髓背角GFAP和DRG中fractalkine及IL-1的表达明显增加，而鞘内注射BAM8-22能使 GFAP和fractalkine及IL-1的表达显著降低。（3）持续应用AM能使大鼠甩尾反射潜伏期降低，而联合应用AM及蛋白激酶A抑制剂H89能使大鼠甩尾反射潜伏期保持稳定，同给药前相比并无显著差异。本研究表明，Mrg受体的激活参与机体病理性痛抑制机制，可能通过抑制GFAP和fractalkine及IL-1的表达上调来减轻神经+病理性痛的痛觉过敏。AM可参与机体疼痛形成，其机制是通过激活cAMP/PKA信号通路。关键词：Mrg受体，神经病理性痛，星形胶质细胞，Fractalkine，IL-1，肾上腺髓质素AbstractMas-related gene receptors (Mrg receptors) is uniquely located in trigeminal ganglia (TG) and the small diameter neurons dorsal root ganglia (DRG). It has been demonstrated that intermittent administration of bovine adrenal medulla 8-22 (BAM8-22), a selective Mrg receptors agonist, can inhibit the sciatic nerve ligation-induced hyperalgesia. Studies have shown that glial cells, Fractalkine, IL-1 and adrenomedullin are involved in the formation and maintenance of pain.This study was presented by testing the rats mechanical threshold and Immuno histochemical techniques to examine: (1) Effects of intrathecal injection BAM8-22 on the mechanical hyperalgesia induced by ligation L5 spinal nerve and SNL-induced change of astrocytes in the spinal dorsal horn of rat. (2) Effects of intrathecal injection BAM8-22 on the SNL-induced change of fractalkine, IL-1 in DRG. (3) Effects of intrathecal injection AM and H89 on the thermal hyperalgesia. Results showed that: (1) the paw withdraw pressure threshold dropped to about 50% of the baseline latency on 10th day after spinal nerve ligation (2) The expression of GFAP in the spinal dorsal horn and fractalkine, IL-1 in dorsal root ganglion were increased following the surgery of SNL. Applying BAM8-22 to activate the Mrg receptors can inhibit the increase of GFAP, fractalkine and IL-1 , so as to reduce the hyperalgesia of the spinal nerve ligation rats. (3) Applying AM can reduce the tail-flick latency. However, co-administration of AM with H89 everyday will keep the tail-flick latency steadily. This study indicates that the activation of Mrg receptors may be involved in inhibiting the maintenance of neuropathic pain. It is possible that inhibit the expression of GFAP, Fractalkine and IL-1 can relieve SNL-induced hyperalgesia in pain. AM can participate in the regulation of pain, and its mechanism may be transmit pain signals through the activation of cAMP/PKA pathway. Keywords: Mrg, neuropathic pain, astrocyte, Fractalkine,IL-1, adrenomedullin 中文文摘 星形胶质细胞是神经系统内数量最多的一类胶质细胞。在炎症或组织损伤引起的神经病理性痛中，星形胶质细胞的特异性标志物GFAP的表达量显著增加。被激活的胶质细胞释放促炎因子（IL-1、IL-6、TNF-、神经生长因子）等作用于痛觉感受神经元使其敏感性和反应性增强，从而导致疼痛持续发生。病理状态下，星形胶质细胞常在损伤较晚期开始激活，但持续时间较长，其对于疼痛的维持起重要作用。因此探讨星形胶质细胞在神经病理性痛发生中的作用具有重要理论意义和临床价值。趋化因子fractalkine（CX3CL1）是一种神经元跨膜糖蛋白，可以在伤害性刺激作用下由神经元末梢释放出来，与小胶质细胞和星形胶质细胞上的fractalkine受体CX3CR1结合并将其激活。Fractalkine通过介导神经元胶质细胞间的信号通路，使激活的小胶质细胞和星形胶质细胞释放促炎因子（IL-1、IL-6、TNF-、神经生长因子等）及神经活性物质（NO、ATP等）导致感觉神经元敏感性和反应性增强，从而引起疼痛持续发生。IL-1是一种由机体的免疫和非免疫细胞经刺激后合成并分泌的促炎细胞因子。病理状态下，激活的小胶质细胞可以增加包括IL-1在内的多种细胞因子和趋化因子的合成与分泌。IL-1通过复杂的机制诱导其他疼痛相关因子的释放并与其协同调制神经病理性痛，也可以直接作用于伤害感受器发挥促炎作用并参与疼痛的发生。Fractalkine与IL-1在调制神经病理性痛发生中起重要作用。感觉神经元特异性受体又称为Mrg受体（Mas-related gene receptors, Mrg），MrgC受体属于Mrg家族成员。Mrg受体可以被内源性的牛肾上腺髓质8-22肽（bovine adrenal medulla peptide8-22，BAM8-22）激活。由于MrgC受体仅存在于DRG中小型神经元上，通常认为小型感觉神经元具有传导伤害性刺激信息的作用，因此MrgC受体可能参与调制伤害性信息传递。我们实验室研究发现BAM8-22对神经病理性痛有抑制作用，但其具体作用机制仍不清楚。由于星形胶质细胞、fractalkine与IL-1可参与神经病理性痛的调制，我们推测BAM8-22可能通过相关信号通路产生作用。因而研究Mrg受体在调制痛觉信息传递中的作用机制，对于开发新型镇痛药物具有重要价值。Kitamura等于1993年从人类嗜铬细胞瘤分离出来的一种血管活性肽并将其命名为肾上腺髓质素(adrenomedullin，AM)。AM属于CGRP家族成员，在结构和功能上与CGRP具有相似性，它们都属于疼痛相关肽。AM可以通过激活多个信号通路对不同的细胞产生不同的生物学效应，从而介导疼痛的发生。但目前对于AM参与疼痛的具体机制仍不清楚。本实验通过行为学、免疫组织化学荧光染色等实验技术，研究了：（1）鞘内注射Mrg受体激动剂BAM8-22对大鼠机械痛阈值的影响和对大鼠脊髓背角中星形胶质细胞的影响；（2）鞘内注射BAM8-22对神经病理性痛大鼠DRG中fractalkine及IL-1表达的影响；（3）鞘内注射AM及H89对大鼠热痛觉过敏的影响。结果显示：（1）大鼠脊神经结扎第10天缩爪压力阈值下降至基础值的50%左右，形成痛觉过敏。鞘内注射BAM8-22后能恢复大鼠的缩爪压力阈值，减轻脊神经结扎引起的机械痛觉过敏。（2）脊神经结扎能使脊髓背角GFAP和DRG中fractalkine及IL-1的表达明显增加，而鞘内注射BAM8-22能使 GFAP和fractalkine及IL-1的表达显著降低。（3）持续应用AM能使大鼠甩尾反射潜伏期降低，而联合应用AM及蛋白激酶A抑制剂H89能使大鼠甩尾反射潜伏期保持稳定，同给药前相比并无显著差异。综上所述，MrgC受体的激活能抑制神经病理性痛，其细胞学机制是抑制星形胶质细胞激活和抑制fractalkine及IL-1的表达量增加。疼痛多肽AM可参与疼痛的形成，机制是激活cAMP/PKA信号通路。而其分子机制及信号通路等都有待进一步研究。 - 61 -目录中文摘要IAbstractIII中文文摘IV目录VII绪论- 1 -一 疼痛的简介- 1 -二 疼痛的机制- 1 -2.1伤害性感受器- 1 -2.2 DRG与脊髓- 2 -三、疼痛的分类及其模型- 3 -3.1炎性痛- 4 -3.2神经病理性痛- 6 -四、Mrg受体（Mas-related gene receptors, Mrg receptors）- 8 -4.1 Mrg受体结构及其分布- 8 -4.2 MrgC受体的激动剂BAM22和BAM8-22- 9 -4.3 MrgC受体与痛觉调制- 9 -五、星形胶质细胞参与痛觉信息的传递和调制- 9 -5.1星形胶质细胞的激活- 10 -5.2星形胶质细胞参与疼痛调制- 10 -六、Fractalkine参与痛觉信息的传递和调制- 11 -七、IL-1参与痛觉信息的传递和调制- 12 -八、CGRP参与痛觉信息的传递和调制- 12 -九、AM参与痛觉信息的传递和调制- 13 -十、本研究课题的立题背景与意义- 14 -第一章 鞘内注射BAM8-22对大鼠伤害性反应和脊髓背角星形胶质细胞的影响- 17 -1.1前言- 17 -1.2材料和方法- 17 -1.2.1试剂和仪器- 17 -1.2.2 实验方法与实验步骤- 18 -1.2.3图像分析及数据处理- 22 -1.3实验结果- 22 -1.3.1 脊神经结扎大鼠行为学变化- 22 -1.3.2 脊神经结扎大鼠机械刺激阈值的变化- 23 -1.3.3 鞘内注射BAM8-22对脊神经结扎大鼠后足机械阈值的影响- 24 -1.3.4 椎管内注射BAM8-22对SNL大鼠脊髓背角GFAP的影响- 25 -1.4讨论- 26 -第二章 鞘内注射BAM8-22对SNL诱导DRG中fractalkine及IL-1表达的影响- 29 -2.1 前言- 29 -2.2材料和方法- 30 -2.2.1 实验材料- 30 -2.2.2实验设备及器械- 30 -2.2.3 实验动物的选择与饲养- 30 -2.2.4 实验方法与步骤- 31 -2.2.5 免疫组化染色- 31 -2.2.6 图像分析及数据处理- 31 -2.3实验数据- 32 -2.3.1鞘内注射BAM8-22对脊神经结扎大鼠L5 DRG 中fractalkine表达的影响- 32 -2.3.2鞘内注射BAM8-22对脊神经结扎大鼠L5 DRG 中IL-的表达影响- 34 -2.4讨论- 36 -第三章 鞘内注射AM及H89对大鼠热痛觉过敏的影响- 39 -3.1前言- 39 -3.2材料和方法- 39 -3.2.1实验试剂- 39 -3.2.2实验设备、仪器与器械- 39 -3.2.3实验动物- 40 -3.2.4实验方法- 40 -3.2.5 实验分组- 42 -3.2.6 实验结果- 42 -3.3分析与讨论- 43 -第四章 结论- 45 -参考文献- 47 -附录2- 55 -攻读学位期间承担的科研任务与主要成果- 59 -致 谢- 60 -索引- 63 -个人简历- 65 - 绪论绪论一 疼痛的简介当今医学领域内，疼痛被认为是一种机制复杂的生理心理活动，是临床上绝大部分疾病的共同症状。疼痛主要包括机体在伤害性刺激作用下产生的痛感觉和痛反应，痛感觉是一种伴随各种复杂反射的主观体验，痛反应是指伤害性刺激引起机体产生的生理病理反应。国际疼痛协会( international association for the study of pain, IASP)于2001年将疼痛定义为一种实际或潜在的组织损伤所带来的令人不愉快的主观感受和情绪体验1。疼痛是机体对伤害性刺激产生的保护性行为，在一定程度上疼痛的表达能够减少机体所受的伤害。疼痛常作为警示信号提示机体在所处环境中已经或可能将遭受损伤，疼痛产生后能够通过神经系统的调节作用诱使机体产生一系列保护反应，保护机体免遭更多潜在的损害。但是严重的疼痛已经成为一种疾病，不仅导致病患精神痛苦和生活质量降低，长期遭受疼痛还会使机体各个器官产生功能紊乱，导致免疫功能严重减弱从而引发多种并发症，重者还会导致患者丧失行动能力。虽然目前对于疼痛机制的研究已经取得重大进展，但有效治疗疼痛的临床手段并不多，所以深研究镇痛药物作用靶点及作用机制既有理论意义，又有临床价值。二 疼痛的机制疼痛传导通路：一、伤害性刺激作用于外周神经系统中的伤害性感受器并导致其兴奋性增加。二、伤害性感受器通过产生神经冲动，将伤害性刺激信号沿有髓的A纤维和无髓的C纤维传导至脊髓背角进行初步处理。三、刺激信号经脊髓-丘脑束及脊髓网状系统传导至丘脑和大脑皮层，大脑对疼痛信号进行分析并作出反应产生痛觉。四、疼痛信号在中枢系统传递时引起离子通道、神经介质以及受体水平的变化并通过下行通路进行调节2。2.1伤害性感受器伤害性感受器是感受和传递伤害性刺激信号的感觉神经元外周部分，由游离的未特化的神经末梢所构成，主要存在于皮肤、肌肉、关节及内脏等组织。伤害性感受器上存在多种特异性受体及离子通道，可以直接被伤害性刺激激活，也可以被释放的炎症物质间接激活。其基本特征如下，敏化作用：伤害性感受器的一个重要特征是其具有敏化作用。敏化作用是指伤害性感受器在伤害性刺激作用下，其表面存在的多种特异性受体与离子通道的感受范围扩大、阈值降低且数目增多，导致初级传入神经纤维兴奋性升高，最终使得伤害性感受器在非伤害性刺激作用下也可以被激活并产生疼痛3。研究表明长时间持续性的伤害性刺激会导致伤害性感受器敏感化水平明显增加4。虽然敏化作用对于伤害性感受器具有重要意义，但其对于伤害性感受器来说并不具有特异性，研究发现其他感觉传入模式同样具有敏化作用5。结构特征：伤害性感受器一般包含轴突、胞体及中枢末梢等结构。伤害性感受器的胞体主要位于脊髓背根神经节和三叉神经节中，发出单个轴突在节中延伸一段后分为外周神经轴突和中枢轴突两个部分，外周神经轴突可以外延向外周组织并能够感受刺激信息；中枢轴突则能够接受外周初级感觉信息并将其传至脊髓背角区域。根据结构与功能的不同，伤害性感受器主要分为以下三类。（1）多觉性伤害感受器，主要与无髓鞘的C纤维有关，该类型的伤害性感受器对机械刺激、物理刺激和化学刺激均可以产生反应，被伤害性刺激激活后能够将感觉信息传送到脊髓背角中。（2）与有髓鞘的A类神经纤维相关的机械-热伤害性感受器，该类型的伤害性感受器能被机械刺激、热刺激所激活，接受外周初级感觉信息。（3）非机械伤害性感受器，在正常情况下无法被机械或热刺激激活，但在炎症或化学刺激作用下能够被激活并可产生疼痛，非机械伤害性感受器多数位于关节部位。2.2 DRG与脊髓脊髓背根神经节（Dorsal Root Ganglion，DRG）是伤害性感受器的胞体所在部位，同时也是伤害性感觉信息从外周传送到中枢的的初级感觉神经元，其主要位于脊髓旁侧椎间孔内。根据细胞的大小可以将DRG神经元可以分为以下三种：大型神经元（S1200 ），主要发出有髓鞘的A神经纤维，在传递非伤害性刺激信息的同时，对于抑制伤害性刺激信息的传递也具有重要作用；中型神经元（600 S 1200 ），主要发出有髓鞘的A神经纤维，在传递快速的急性疼痛中起重要作用；小型神经元（S600 ），主要发出直径较细的无髓鞘C类神经纤维，在传递慢性疼痛中起重要作用6。脊髓是机体处理疼痛刺激信号的初级整合中枢，脊髓接受初级传入纤维传导的刺激信息后，能够对刺激信息进行整合和加工并将其传入高级神经中枢部位。感受伤害性刺激信息的细胞主要集中于脊髓背角，是机体调节或整合伤害性信息的关键位点，Rexed将脊髓背角分成六层。A与A纤维终止于-层，其功能主要是对机械性刺激信号起反应； A细纤维终止于、和层，具有传导伤害性刺激信息的功能； C细纤维终止于层，在传导机械刺激、物理刺激、化学刺激等伤害信息中起作用。脊髓背角中有三类神经元与伤害性信息传递有关：能够将伤害性刺激传递到高级中枢的投射神经元，可以将伤害信息传递到其他神经元的兴奋性中间神经元，以及能够抑制伤害性信息传递的抑制性中间神经元。这三类神经元及其释放的疼痛相关递质组成了机体伤害性信息传递调控网络。痛觉过敏主要是伤害性感受器敏感化引起脊髓背角神经元的过度兴奋导致的。组织损伤后初级传入纤维能够传入伤害性信息并导致CGRP、神经生长因子等递质的释放，这些递质能够分别结合各自的特异性受体并引起脊髓背角神经元兴奋性增强。初级传入神经纤维在伤害性刺激作用下能够释放各种疼痛相关递质，引起cAMP水平上升，cAMP可以通过激活PKA、PKC等蛋白激酶引起靶细胞蛋白磷酸化，导致脊髓背角感觉神经元对接收到的非伤害性和伤害性刺激产生过度兴奋、反应增强。三、疼痛的分类及其模型疼痛主要可以分为两种类型：第一种是生理性痛，主要是指感觉神经纤维将外周的伤害性刺激信息传递至神经中枢系统时，机体能够感觉到的疼痛，警示机体外周环境中存在伤害性刺激的存在。第二种是病理性痛，主要是指机体在外周神经系统或中枢神经系统受损或功能障碍状态下所产生的疼痛。病理性痛主要表现为自发性痛、痛觉过敏、触诱发痛和感觉异常等特征。自发性痛是指在无可见的外界刺激下产生的疼痛，其主要特点是具有自发性、偶然性、长期性等异常感觉；痛觉过敏指机体在伤害性刺激作用下表现出过度的伤害性反应及持续性疼痛等症状；触诱发痛是指对非伤害性刺激产生的疼痛。目前病理性痛分为神经病理性痛与炎性痛两种类型，在病理性痛的治疗中，神经病理性痛的比炎性痛更为困难。对于其发病机制的研究已成目前研究热点。病理性痛的发生机制非常复杂，为了模拟临床上人类病理性痛的特点，在研究过程中人们建立了多种疼痛模型。一般来讲，一种成功的疼痛模型应该满足以下几方面的要求：首先，该疼痛模型应该具有与病理性痛的相关的生物学特性；其次，采用该疼痛模型能够对病理性痛相关的细胞和分子作用机制进行研究；最后，还要具有客观而量化的指标可供观察，其相关检测结果也必须具有可靠性与可重复性7, 8。3.1炎性痛炎性痛主要是指由外周神经系统损伤导致产生炎症并释放相关炎性物质时所引起的疼痛。炎性痛产生的机制主要是机体组织损伤引起外周伤害性感受器和脊髓背角感觉神经元敏感性增加。当组织受到伤害性刺激后，周围细胞将会释放与炎症相关的介质如P物质、降钙素基因相关肽、5-羟色胺、缓激肽等介质，这些介质与对应的受体结合能够将伤害性感受器激活，伤害性感受器被激活后产生的兴奋将被传递至脊髓背角部位。脊髓背角中接收的的伤害性刺激信息经过初步整合后通过引起Ca2+水平上升激活第二信使系统，改变蛋白激酶如PKC、PKA的活性使得蛋白质磷酸化，导致背角神经元兴奋性增加、对伤害或非伤害刺激的反应增强，这些伤害性刺激信号经过初级处理后最终投射到大脑边缘系统和大脑皮层产生疼痛感觉，即产生触诱发痛。目前广泛应用的炎症痛模型包括完全弗氏佐剂(complete Freunds adjuvant，CFA)炎性痛模型、福尔马林炎性痛模型和角叉菜胶炎性痛模型。这些模型主要是利用致炎物质注入动物体内引起模型动物产生炎症，使得伤害性感受器对伤害或非伤害刺激的敏感性增加，在机械或者热刺激条件下可产生自发性痛，表现出痛觉过敏或触诱发痛症状。3.1.1完全弗氏佐剂炎性痛模型该模型操作简单易行，常被用来模拟慢性炎症。通常将一定浓度的完全弗氏佐剂注射到大鼠后足底皮下位置，导致动物足底表现出明显的红肿症状，动物在行为学观察中表现出自我保护和运动机能障碍，同时在机械刺激和热刺激作用下表现出明显的痛觉过敏现象。在注射CFA后两个小时左右大鼠足下皮肤注射部位开始出现炎症，注射24小时后大鼠伤害性刺激痛阈值达到最低，大鼠足底水肿和痛觉过敏症状能够持续超过七天。很多研究表明注射 CFA 会诱导一系列的介质产生或激活，如P 物质、CGRP、缓激肽9等炎症介质在神经元内表达的增加。这些炎性物质的产生和激活能够促进伤害性信息在神经纤维上的传导，引起感觉神经元的兴奋性增加，导致外周和中枢产生敏化的作用，最终使产生痛觉过敏或触诱发痛。由于该疼痛模型特征明显且持续时间较久，因此人们将完全弗氏佐剂模型广泛用于研究炎性疼痛发生的相关机制10。3.1.2 福尔马林炎性痛模型福尔马林炎性痛模型在试验中经常被用于模拟急性炎症引发的疼痛，其操作过程简单易行。将福尔马林液注入到大鼠后爪皮下，能够导致动物出现屈腿、舔足、缩爪等行为变化。大鼠处理后疼痛症状大致可表现出明显的双时相痛相关行为反应，手术处理后五分钟内为第一个时相，第二十分钟至一小时为第二个时相。研究表明福尔马林炎性痛模型大鼠的这种双相炎性痛反应通常与A纤维和C纤维双相持续产生电兴奋性有关。这表明大鼠后爪皮下注射福尔马林溶液引起的这种炎性疼痛症状是由于外周部位受到损伤导致外周神经系统敏感化，而不是中枢神经系统敏感化的结果11。3.1.3 角叉菜胶炎症模型角叉菜胶(carrageenan)又被人们称为鹿角菜胶，是一种从水生植物鹿角菜中发现并提取出来的混合胶状物，注入动物组织内可诱发产生剧烈的炎性痛，联合使用角叉菜胶与白陶土可以使炎症症状表现得更为明显。将用生理盐水配制的角叉菜胶溶液注入到大鼠后爪皮下部位后，可导致大鼠注射部位皮肤明显红肿且温度显著升高。用热刺激和机械刺激注射部位可以发现角叉菜胶炎性模型大鼠痛阈明显降低，这表明该模型大鼠产生热或机械性痛敏。人们经常采用角叉菜胶炎性痛模型来模拟亚急性炎性痛症状，该疼痛模型中具有的毛细血管扩张、血管通透性增加等症状，是一种经典的疼痛模型。3.2神经病理性痛神经病理性痛 ( neuropathic pain) 主要是指由于某些病理性因素如机体组织受损、病毒感染或疾病 (如糖尿病和癌症)导致外周或中枢神经系统受损引发疼痛感觉异常或功能障碍所发生的持续性疼痛。神经病理性痛的主要症状表现为痛觉过敏以及自发性疼痛等。与急性疼痛引发机体的防御性反应从而保护机体免遭伤害不同，神经病理性痛的发生机制错综复杂，它的存在会导致患者的生活质量严重下降。神经病理性痛的发生不仅涉及神经信号通路和背根神经节的施旺细胞、卫星细胞，也涉及到脊髓小胶质细胞和星形胶质细胞。 神经病理性痛的发生主要与外周神经系统和中枢神经系统中的两种机制有关。外周机制主要包括外周感觉神经纤维在遭受损伤后产生异位放电、感觉神经元的兴奋性增强等；中枢机制包括脊髓背角神经元的敏化及大脑中枢神经系统的敏感化等。 目前为了研究神经病理性疼痛的发生机制，人们广泛应用慢性坐骨神经结扎模型（the chronic constriction injury of the sciatic nerve model，CCI）12、部分坐骨神经结扎模型（the partial sciatic ligation model，PSL）13、坐骨神经分支选择切断模型(the spared nerve injury model，SNI)14和脊神经结扎疼痛模型(the spinal nerve ligation model，SNL)15等来模拟人体神经病理性痛的临床特点，探讨其具体作用机制，为寻找神经病理性痛的临床治疗方案提供理论支持。3.2.1慢性坐骨神经结扎1988年美国的Bennett等人通过采用将神经轻度结扎来代替原来直接切断坐骨神经的方法建立了慢性坐骨神经结扎模型。具体操作步骤是将大鼠一侧坐骨神经结扎后用铬肠线环绕后轻度结扎，结扎时大鼠腿部会产生轻微颤抖，神经纤维在轻度结扎后会产生水肿症状，这导致铬肠线对神经产生压迫而引起部分神经选择性变性坏死，但可以传递痛觉信息的C纤维保持完整。慢性坐骨神经结扎模型的大鼠在结扎处理1-5天后便会产生机械痛觉过敏和热痛觉过敏症状，该模型动物产生的痛觉过敏症状通常能够保持2-3个月。该模型大鼠的症状可以模拟人体外周或中枢神经系统在机体损伤、病毒感染或糖尿病和癌症等疾病作用下受损后产生的神经病理性痛症状和痛行为反应，自从创造以来被广泛应用于研究神经病理性痛。3.2.2部分坐骨神经损伤由于临床上多数神经病理性痛患者都是部分神经损伤，为了模拟外周神经病变和创伤引起的各种疼痛，Seltzer等于1990年建立了一种类似于CCI 模型的部分神经损伤模型用以分析剩余神经纤维中未结扎部分的作用。他们采用丝线将部分坐骨神经紧紧结扎的方法，然后测试动物疼痛行为反应，这种结扎了部分坐骨神经的模型被称为部分坐骨神经损伤模型。该模型将受损的脊神经和正常的脊神经完全分开，有利于对它们进行比对研究。该模型能够表现出抬足、舔足等痛行为反应，但不会产生自残行为。该模型动物手术侧后爪能够表现出明显的热痛敏与机械痛敏。该模型一般在结扎处理几个小时之后出现痛行为反应且能够持续几个月时间，与CCI模型动物相比痛反应出现的时间要更早。3.2.3坐骨神经分支选择性切断模型Woolf等于2000年保留大鼠腓肠神经分支但将其一侧坐骨神经干的腓总神经分支和胫神经切断从而建立坐骨分支选择性切断模型。该模型可观察损伤的初级传入神经元与相邻未损伤初级神经元的变化。检测发现手术侧后肢足底出现机械痛敏，表现出不愿承重而表现出爪外翻的症状。大鼠术后24小时开始表现出机械痛敏，14天达高峰且持续不变；热刺激引起的的缩足时间延长但热痛阈值却并未改变。该模型的主要特点是热刺激可导致鼠屈爪时间延长，但其热痛阈值却不会发生改变。3.2.4脊神经结扎Bennett-Xie和Seltzer模型虽然能够模拟人体神经病理性痛的特征，但其结扎部位均位于坐骨神经部位，因此无法模拟所有临床神经病理性痛。此外，该模型还存在难以控制受损的神经数量和类型等缺陷，使得动物模型在个体生物学体征方面出现较大差异，导致神经病理性痛相关症状表现的不够明显。因此，美国的Kim和Chung等人于1992建立了能够模拟人神经病理性痛症状的脊神经结扎模型。具体操作步骤是使用医用丝线将麻醉后的大鼠L5和L6脊神经紧紧结扎，或是只结扎大鼠L5脊神经。该模型动物在神经结扎处理后会在短时间内出现机械痛敏和触诱发痛，手术后1220小时也会出现热痛敏，持续12 周左右。手术后第1天出现会出现痛觉过敏症状，手术后第3天时机械痛敏和热痛敏表现得最为显著。脊神经结扎模型与其他模型相比在对模型动物进行结扎处理时结扎部位和结扎强度差异减小而且能够将脊髓中受损和未受损节段完全分开从而减小实验误差对结果的影响16。但是该模型的主要缺点是部分大鼠在手术处理后会出现自残行为，影响实验进程。四、Mrg受体（Mas-related gene receptors, Mrg receptors）2002年Lembo等发现一些G蛋白偶联受体的mRNA仅仅存在于背根神经节和三叉神经节的小感觉神经元上，因此这些受体被命名为感觉神经元特异性受体17。感觉神经元特异性受体又称为Mrg受体，Hong等研究发现Mrg受体能够被内源性的牛肾上腺髓质22肽（bovine adrenal medulla peptide 22，BAM22）激活，为了叙述方便我们统一将其称为Mrg受体。由于Mrg受体仅存在于DRG中小型神经元上，通常认为小型感觉神经元具有传导伤害性刺激信息的作用，因此Mrg受体可能参与调制伤害性信息传递。而且，由于Mrg受体仅存在于外周神经系统，激活Mrg受体不会引起类似吗啡那样的中枢性的副作用。因而研究Mrg受体在调制痛觉信息传递中的作用机制，对于开发新型镇痛药物具有重要意义。4.1 Mrg受体结构及其分布人与大鼠的Mrg受体家族成员有七个-螺旋跨膜蛋白结构域，都包含具有高度保守特性的NPXXY序列 18。Mrg家族成员分为MrgA、MrgB、MrgC、MrgD四种亚型17。大鼠的Mrg与MrgC超家族亲缘性较高而人类的Mrg则与MrgA超家族亲缘性较高19，本实验选用MrgC受体为代表来研究其家族的功能与作用。Mrg受体主要表达于DRG中小神经元，原位杂交结果表明大鼠DRG中76%的Mrg受体阳性神经元与IB4共表达，56%的Mrg受体阳性神经元能够和TRPV1共表达，7%Mrg受体阳性神经元能够和CGRP共表达20。小型神经元主要被分为SP/CGRP/TrkA和IB4两种类型，Mrg受体主要分布于IB4阳性小型神经元上21。4.2 MrgC受体的激动剂BAM22和BAM8-22BAM22最早发现于牛肾上腺髓质中，是一种脑啡肽前体（proenkephalin A）经酶切断裂后形成的产物，由22个氨基酸构成，BAM22其N-末端含有典型的阿片肽结构YGGFM 序列，不仅能激活阿片受体，而且对MrgC受体也具有高亲和性。研究发现BAM22 mRNA位于大鼠背根神经节和脊髓背角中，可参与痛觉的调制22。BAM8-22是由人工合成的BAM类神经肽，与BAM22相比少了具有阿片肽功能的YGGFM氨基酸序列，只能与MrgC受体高度亲和，不具有阿片样作用。BAM8-22是MrgC受体的激动剂，而且其和MrgC受体的结合不会被非选择性阿片拮抗剂纳洛酮所抑制，可被用来研究MrgC受体的功能。4.3 MrgC受体与痛觉调制目前，对MrgC受体功能和作用机制的研究尚处于初级阶段，其生理功能尚不十分明确。我们实验室发现对大鼠鞘内注射BAM8-22能显著抑制CFA炎性痛模型大鼠产生的热痛觉过敏症状，使炎性痛模型大鼠甩尾潜伏期延长，同时导致脊髓背角和背根神经节中nNOS和CGRP表达量明显降低23。Chen等发现鞘内注射BAM8-22激活MrgC受体能够抑制福尔马林模型大鼠的痛觉过敏症状，使脊髓背角c-fos蛋白的表达量降低24。此外，纳络酮无法阻断BAM8-22的这种作用，这表明MrgC受体在炎性痛中的产生镇痛作用与阿片受体并不相关。Guan等发现鞘内注射BAM8-22激活MrgC受体能抑制CFA模型和SNL模型大鼠产生的痛觉过敏症状25。以上发现均表明激活MrgC受体可起到镇痛作用，具体机制可能是激活MrgC受体能够促进背根神经节释放具有抑制兴奋性功能的的神经递质，从而导致伤害性刺激信号的传递被抑制而达到镇痛效果26。五、星形胶质细胞参与痛觉信息的传递和调制 星形胶质细胞在外周及中枢神经系统内分布广泛，数量众多。其中外周神经系统中存在的胶质细胞主要是施旺细胞，而中枢神经系统中存在的胶质细胞主要是小胶质细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞。生理状态下，脊髓小胶质细胞和星形胶质细胞的主要作用是维持内环境的稳定，为神经元提供能量和合成神经递质等疼痛相关物质提供营养和支持，在神经元的发育过程中起重要作用。病理状态下，脊髓背角胶质细胞被激活，促炎因子释放增加、相关蛋白表达量上升。中枢或外周或组织损伤后小胶质细胞可立刻被激活，但持续时间较短，其主要作用是参与疼痛的发生27。而星形胶质细胞常在损伤较晚期才开始激活，但持续时间较长，其对于疼痛的维持起重要作用28。5.1星形胶质细胞的激活在炎症或中枢神经受损引起的病理性疼痛中，星形胶质细胞可被激活，主要特征是星形胶质细胞的特异性标志蛋白GFAP（glial fibrillary acid protein）表达量明显增多。星形胶质细胞被激活以后，包括IL-1、TNF-、神经生长因子等在内的促炎因子、神经递质及神经营养因子将会被大量释放出来参与神经病理性痛的发生29, 30。脊髓背角星形胶质细胞被激活后可引起痛觉过敏，研究发现阻断胶质细胞的激活能阻止或翻转病理性痛从而减轻该症状31。研究同时也发现阻断神经病理性痛的药物也能够抑制星形胶质细胞的激活32。这表明星形胶质细胞在病理性疼痛的发生中起重要作用。在生理条件下星形胶质细胞可被两种物质激活：第一类是脊髓背根神经节释放的P物质、CGRP及缓激肽等，该激活过程涉及第二信使系统的激活、蛋白质的磷酸化等。第二类是感觉神经元被伤害性刺激激活后合成并释放的一氧化氮（NO）、趋化因子Fractalkine和前列腺素（PGE2）等物质。5.2星形胶质细胞参与疼痛调制研究表明被激活的星形胶质细胞在神经病理性痛的发生和持续中起重要作用33。在炎症或组织损伤引起的神经病理性痛中，星形胶质细胞的特异性标志物GFAP的表达量明显增加34。被激活的胶质细胞释放促炎因子（IL-1、IL-6、TNF-、神经生长因子）等作用于痛觉感受神经元使其敏感性和反应性增强，从而导致疼痛持续发生。具有强烈致痛作用的促炎因子同时也能促进P物质、CGRP、缓激肽等促痛物质的合成与释放。研究表明应用拮抗剂抑制星形胶质细胞释放的促炎因子对神经病理性痛的发生具有抑制作用，而应用相关药物抑制星形胶质细胞的代谢功能也具有相同的效果35。这进一步证实星形胶质细胞与神经病理性痛的发生有密切关系。研究发现星形胶质细胞表面存在多种与疼痛密切相关的受体。被激活的胶质细胞可释放多种促炎因子如IL-1、IL-6、TNF-等，在星形胶质细胞和神经元上都有这些促炎因子相应的受体。这些物质被释放后反过来能通过增加初级传入神经SP、EAA的释放和增强产生疼痛物质神经元的兴奋性来促进疼痛信息传递36。fractalkine是神经元释放的一种跨膜糖蛋白，该糖蛋白在被水解后形成的可溶性fractalkine蛋白可以将星形胶质细胞激活。研究发现鞘内注射fractalkine能够导致大鼠产生明显的痛觉过敏症状，而阻断fractalkine受体则对于产生的痛觉过敏具有明显的抑制作用37。以上研究均证实激活的星形胶质细胞参与了神经病理性痛的发生与持续，而抑制星形胶质细胞胶质细胞的激活能阻止其释放疼痛相关物质，使得神经病理性痛的持续痛觉过敏得到缓解。探讨星形胶质细胞在神经病理性痛发生中的作用及相关机制对于治疗疼痛具有一定的理论价值及临床意义。六、Fractalkine参与痛觉信息的传递和调制 趋化因子Fractalkine（CX3CL1）是一种神经元跨膜糖蛋白，可以在蛋白质水解后由感觉神经元末梢释放出来。正常情况下DRG和脊髓背角的神经元中均能够合成并分泌fractalkine，而星形胶质细胞在神经系统损伤后也能够表达该蛋白38。研究发现神经病理性痛时fractalkine的受体CX3CR1在星形胶质细胞和小胶质细胞上的表达上调38。近期研究表明在鞘内注射fractalkine可导致大鼠痛觉过敏，而鞘内注射可中和fractalkine 或CX3CR1的抗体能够减轻神经损伤引起的动物的痛觉过敏症状39。Fractalkine可以被小胶质细胞释放的组织蛋白酶S水解产生可溶性的fractalkine。水解后的fractalkine可以被转运到其他部位从而诱导局部小胶质细胞的激活和迁移，同时提高神经系统的病理性反应而引发神经病理性痛40。研究发现对初级传入纤维的伤害性刺激可以诱导小胶质细胞释放组织蛋白酶S41。Clark等发现对大鼠鞘内注射组织蛋白酶 S会立即产生机械痛敏，具体机制可能为组织蛋白酶S促进释放可溶性fractalkine，其可以激活CX3CR1从而诱导p38的磷酸化，促进促痛介质的表达40。Fractalkine能够在伤害性刺激作用下由神经元合成并释放出来。释放出来的可溶性fractalkine与小胶质细胞和星形胶质细胞表面的fractalkine特异性受体CX3CR1结合并将其激活42。小胶质细胞和星形胶质细胞被fractalkine激活后能够释放促炎因子、神经活性物质等引起感觉神经元敏感化且反应性增强，从而导致疼痛持续发生42。Samuel等发现小胶质细胞的抑制剂米诺环素能够减轻神经损伤引起的急性疼痛，减轻fractalkine诱导的热痛敏和机械痛敏43，这表明fractalkine是通过介导神经元一胶质细胞间的信号通路来调制神经病理性痛的发生。七、IL-1参与痛觉信息的传递和调制 IL-1是机体在伤害性刺激作用下释放的一种促炎细胞因子，能够参与机体免疫反应和炎症的发生。IL-1可由多种细胞合成，其中胶质细胞和巨噬细胞被认为是其主要来源44, 45。生理条件下IL-1的含量较低，神经病理性痛发生后其含量会显著增加46。细胞内产生的IL-1前体须经IL-1转化酶剪切成成熟型 IL-1并分泌至细胞外才能发挥生物学功能47。IL-1在神经病理性痛引发的痛觉过敏中具有重要作用。研究发现生理条件下少突胶质细胞与星形胶质细胞表达IL-1受体而小胶质细胞表达量则较低，脊髓损伤后激活的小胶质细胞开始表达IL-1及其受体48。Wolf等发现IL-1受体缺失可以减轻小鼠神经损伤引起的神经病理性痛，这表明IL-1在其中起重要作用49。Mika等发现在CCI模型大鼠结扎7天后其结扎侧脊髓和DRG中IL-1的表达量均有上升50。以上研究均表明IL-1对于神经病理性痛的发生和持续中具有重要意义。IL-1促炎作用的机制可能是通过复杂的机制诱导其他疼痛相关因子的释放并与其协同调制神经病理性痛。McMhon等发现应用IL-1的抗体抑制其表达对于IL-1诱发的疼痛具有显著的抑制效果，而应用神经生长因子的阻断剂和抗体也能明显减轻IL-1引起的的痛觉过敏症状51。研究发现IL-1的另一个可能的促炎机制是直接作用于伤害感受器。研究发现外周神经系统中IL-1在DRG神经元及施旺细胞都有表达52。研究同时证实机体内IL-1可以在短时间内使传递伤害性信息的神经纤维兴奋性明显增加53，体外环境下IL-1作用于制备的皮肤神经对于热刺激导致的CGRP的释放具有促进作用54，这都表明着IL-1有一个更直接的作用机制。神经病理性痛动物模型中，激活的小胶质细胞可以增加包括IL