血红蛋白的提取和分离医学PPT.ppt

血红蛋白的提取和分离 课标领航1 概述凝胶色谱法 电泳法等分离大分子的基本原理 2 能根据凝胶色谱过程中的现象和结果 评价实验操作的过程是否规范 分析实验结果 3 尝试对血液中血红蛋白的提取和分离 体验从复杂的体系中提取生物大分子的基本过程和方法 重点 凝胶色谱法 电泳法基本原理 难点 实验操作的过程及分析 情境导引为年老多病的人注射丙种球蛋白 可以在一定程度上增强其身体的抵抗力 在动物体内 丙种球蛋白和许多蛋白质混合在一起 要获得纯净的丙种球蛋白制品 就必须进行提取和分离 电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小 形状的不同 使带电分子产生不同的迁移速度 从而实现了样品中各种分子的分离 蛋白质分离的原理 根据蛋白质各种特性的差异 如分子的形状和大小 所带电荷的性质和多少 溶解度 吸附性质和对其他分子的亲和力等等 可以用来分离不同种类的蛋白质 一 基础知识 一 凝胶色谱法 2 凝胶 大多数凝胶是由多糖类化合物 如葡聚糖或琼脂糖 构成的多孔小球体 内部有许多贯穿的通道 根据被分离物质的蛋白质相对分子质量的大小 利用具有网状结构的凝胶 来进行分离 1 概念 分配色谱法 相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的进行过程可表示为图中哪一个 B 3 原理 当不同的蛋白质通过凝胶时 相对 的蛋白质容易进入凝胶内部的通道 路程 移动速度 而 的蛋白质无法进入凝胶内部的通道 只能在 移动 路程 移动速度 相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离 相对分子质量较小 较长 较慢 相对分子质量较大 凝胶外部 较短 较快 大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙 路程短 流动快小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部 路程长 流动慢 思考 所有的蛋白质都可以用凝胶色谱法来分离吗 进行体外实验时 如何保证蛋白质不会发生变性呢 不是 能分离的蛋白质分子必须是具有相对分子质量不同的蛋白质 1 概念 在一定的范围内 能对抗外来少量强酸 强碱或稍加稀释不引起溶液PH发生明显变化的作用叫做缓冲作用 具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液 2 作用 能够抵制 对溶液的 的影响 维持PH基本不变 外界的酸或碱 PH值 二 缓冲溶液 3 缓冲溶液的配制 通常由 种缓冲剂溶解于水中配制而成 调节缓冲剂的 就可以制得 使用的缓冲液 1 2 使用比例 在不同PH范围内 思考 说出人体血液中缓冲对 NaH2PO4 Na2HPO4 H2CO3 NaHCO3 思考 在血红蛋白整个实验室中用的缓冲液是什么 它的目的是什么 使用的是磷酸缓冲液 目的是利用缓冲液模拟细胞内的PH环境 保证血红蛋白的正常结构和功能 便于观察 红色 和材料的科学研究 活性 如何证明凝胶色谱法获得的蛋白质是目的蛋白 三 电泳 血红蛋白的分离鉴定方法 1 概念 带电粒子在作用下发生的过程 2 原理 许多重要的生物大分子 如多肽 核酸等都具有的基团 在一定的PH下 这些基团会带上或 在电场的作用下 这些带电分子会向着的的电极移动 电泳利用了待分离样品中各种分子以及分子本身的 的不同 使带电分子产生不同的 从而实现样品中各种分子的分离 3 类型 琼脂糖凝胶电泳 聚丙稀酰胺凝胶电泳 电场 迁移 可解离 正电 负电 与其所带电荷相反 带电性质的差异 大小 形状 迁移速度 3 类型 琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳 影响蛋白质分子运动速度的因素 聚丙烯酰胺凝胶电泳 在测定蛋白质分子量时常用十二烷基硫酸钠 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂N N 亚甲基双丙烯酰胺在引发剂和催化剂的作用下聚合交联成的具有三维网状结构的凝胶 N N 亚甲基双丙烯酰胺 形成交联 丙烯酰胺和交联剂N N 亚甲基双丙烯酰胺的交联共聚反应 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素 1 原理 SDS能使蛋白质发生完全变性 由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链 因此测定的结果只是单条肽链的分子量 SDS能与各种蛋白质形成蛋白质 SDS复合物 SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量 因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别 使电泳迁移率完全取决于分子的大小 2 SDS作用机理 用SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量的方法 使用SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量时 可选用一组已知分子量的标准蛋白同时进行电泳 根据已知分子量的标准蛋白的电泳区带位置 可以测定未知蛋白质的分子量 市场上有高分子量 次高分子量及低分子量的标准蛋白试剂出售 琼脂糖凝胶电泳操作简单 电泳速度快 样品不需要事先处理 电泳后区带易染色 样品极易洗脱 便于定量测定 测定蛋白质的相对分子质量常用SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 这是因为该方法分离蛋白质完全取决于分子的大小 而非所带电荷的性质和分子的大小 形状 二 实验操作 蛋白质的提取和分离一般分为四步 样品处理 粗分离 透析 纯化 纯度鉴定 电泳 1 血液有哪些成分 二 实验操作 知识回顾 每个肽链环绕 此基团可携带 血红蛋白因含有 而呈红色 本课题可选用猪 牛 羊或其他脊椎动物的血液来分离血红蛋白 一个亚铁血红素基团 一分子氧或一分子二氧化碳 血红素 2与其他真核细胞相比 红细胞有什么特点 这一特点对你进行蛋白质的分离有什么意义 鸡的红细胞具有细胞核 含有DNA 便于进行DNA的提取 人的红细胞无细胞核 结构简单 血红蛋白含量丰富 便于提取血红蛋白 血红蛋白 答 血红蛋白是有色蛋白 因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液 这使血红蛋白的分离过程非常直观 大大简化了实验操作 1 你认为鸟类血液和哺乳动物血液中 最好哪种血液来提取血红蛋白 为什么 采集得到血液 加入抗凝血剂柠檬酸钠 二 操作过程 防止血液凝固 1 样品的处理 1 红细胞的洗涤A 洗涤目的 B 分离时采用离心 用洗涤 重复洗涤 直至为什么要低速短时离心 防止白细胞沉淀 P69 C 能否用蒸馏水代替生理盐水 去除杂蛋白 以利于后续步骤的分离纯化 低速短时间 五倍体积的生理盐水 三次 上清液不再呈现黄色 表明红细胞已洗涤干净 不能 生理盐水能保持红细胞的渗透压而不至于破裂 若红细胞提前破裂 使血红蛋白与杂质血浆蛋白混在一起 加大分离难度 D 为什么要缓慢搅拌 防止红细胞破裂释放出血红蛋白 洗涤过程图解 血液100mL 重复洗涤3次 直至上清液没有黄色 再加入用 的 质量分数为0 9 的氯化钠溶液洗涤 缓慢搅拌10MIN 离心 五倍体积 如此重复洗涤 次 直至上清液中已没有 表明洗涤干净 利于后续血红蛋白的分离纯化 不可洗涤次数过少 三 黄色 生理盐水 低速短时间 初次离心后的结果 3次洗涤后的结果 2 血红蛋白的释放 加蒸馏水到原血液体积 再加40 体积的甲苯 置于磁力搅拌器上充分搅拌10分钟 加速细胞破裂 细胞破裂释放出血红蛋白 3 分离血红蛋白溶液 过程 将搅拌好混合液转移到离心管内 以2000r min的速度离心10min 试管中溶液层次 第1层 最上层 甲苯层 无色透明 第2层 中上层 脂溶性物质沉淀层 白色薄层固体 第3层 中下层 血红蛋白的水溶液层 红色透明液体 第4层 最下层 杂质沉淀层 暗红色 分离 用滤纸过滤 除去脂溶性沉淀层 于分液漏斗中静置片刻后 分出下层的红色透明液体 二 实验操作 2 释放血红蛋白 思考 释放血红蛋白过程中 在洗涤好的红细胞加入了哪些物质 为了加速释放过程 采取了什么措施 使用磁力搅拌器充分搅拌 目的分析 蒸馏水的作用是 加入甲苯的作用是 充分搅拌的目的是 使红细胞大量吸水胀裂 溶解红细胞的细胞膜 加速红细胞的破裂 蒸馏水 40 体积的甲苯 磁力搅拌器 搅拌器转子 搅拌器正在工作 3 分离血红蛋白溶液 将搅拌好的混合溶液转移到离心管中 以2000r mim的速度离心10mim后 可以看出溶液分为4层 从上往下数 第一层是无色透明的甲苯层 第二层为白色薄层固体 是脂溶性物质沉淀层 第三层为红色透明液体 这是血红蛋白的水溶液 第四层是其他杂质的暗红色沉淀物 将试管中的液体用滤纸过滤 除去脂溶性沉淀物 于分液漏斗中静置片刻后 分出下层的红色透明液体 第1层 甲苯层 第2层 色薄层固体 的沉淀层 第3层 的液体 的水溶液层 第4层 其它杂质 的沉淀层 无色透明 脂溶性物质 白 血红蛋白 红色透明 暗红色 用过滤 除去 于分液漏斗中静置片刻后 分出下层的红色透明液体 滤纸 脂溶性沉淀层 分离血红蛋白 分离过程 红细胞混合液 2 粗分离 透析 去除分子量较小的杂质 1 用方法进行粗分离 透析袋由半透膜制成 常用 将透析袋放入溶液中进行透析 2 透析的原理是 3 透析的目的是 透析 玻璃纸 肠衣 膀胱膜 透析袋能使小分子自由进出 而将大分子保留在袋内 去除样品中分子量较小的杂质 磷酸缓冲 取 ml的血红蛋白溶液装入 中 将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol L的 中 pH为 透析12小时 目的是 或用于更换样品中的 除去样品中分子量较小的杂质 透析袋 磷酸缓冲液 7 0 缓冲液 4 透析 粗分离 1 透析过程中如何去除无机盐离子和小分子有机物 半透膜的选择透过性 大分子物质不能通过半透膜 离子和小分子能够通过半透膜 在透析过程中 血红蛋白溶液中的离子和小分子不断通过半透膜扩散进入到pH 7的磷酸缓冲液中 透析过程中为何使用pH 7的磷酸缓冲液 为什么缓冲液量远多于血红蛋白溶液量 维持血红蛋白的正常特性 有利于杂质分子充分地向外扩散 一 样品处理 1 红细胞的洗涤 2 血红蛋白的释放 3 分离血红蛋白溶液 4 透析 如何除无机盐离子和小分子有机物质呢 血液 柠檬酸钠 低速短时离心 吸出上层血浆 红细胞 5倍体积生理盐水 缓慢搅拌10min 低速短时离心 吸出上清液 反复洗涤直至上清液无黄色 在蒸馏水和甲苯 作用下 红细胞破裂释放 红细胞破碎混合液 中速长时离心 2000c min 10min 滤纸过滤除去脂质 分液漏斗分离出血红蛋白 得到红色透明液体 装入透析袋并置于磷酸缓冲液中 PH为7 0 透析 二 实验操作 样品处理 粗分离 纯化 纯度鉴定 二 凝胶色谱操作 1 凝胶色谱柱的制作 2 凝胶色谱柱的装填 教材图5 19 3 样品的加入和洗脱 血红蛋白的纯化 2 凝胶色谱操作 1 凝胶色谱柱的制作 取长40厘米 内径1 6厘米的玻璃管 两端需用砂纸磨平 底塞的制作 打孔 挖出凹穴 安装移液管头部 覆盖尼龙网 再用100目尼龙纱包好 插到玻璃管的一端 注意事项 底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面 否则难以铺实尼龙网 还会导致液体残留 蛋白质分离不彻底 顶塞的制作 打孔 安装玻璃管 组装 将上述三者按相应位置组装成一个整体 安装其他附属结构 装配好的凝胶柱 2 凝胶色谱柱的装填 凝胶的选择 A 材料 交联葡聚糖凝胶 G 75 凝胶的前处理 配置凝胶悬浮液 计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后 配成凝胶悬浮液 凝胶色谱柱的装填方法 A 固定 将色谱柱装置固定在支架上 B 装填 将凝胶悬浮液一次性缓慢倒入色谱柱内 装填时轻轻敲动色谱柱 使凝胶填装均匀 注意 1 凝胶装填时尽量紧密 以降低凝胶颗粒之间的空隙 2 装填凝胶柱时不得有气泡存在 因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序 降低分离效果 洗涤平衡 装填完毕后 立即用缓冲液洗脱瓶 在50cm高的操作压下 用300ml的20mmol l的磷酸缓冲液 pH为7 0 充分洗涤平衡12小时 注意 1 液面不要低于凝胶表面 否则可能有气泡混入 影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果 2 不能发生洗脱液流干 露出凝胶颗粒的现象 50cm高 2 凝胶色谱柱的装填 3 样品加入与洗脱 调节缓冲液面 打开下端出口 使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐 关闭出口 滴加透析样品 吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶端 滴加样品时 吸管管口贴着管壁环绕移动加样 同时注意不要破坏凝胶面 注意 正确的加样操作是 1 不要触及并破坏凝胶面 2 贴壁加样 3 使吸管管口沿管壁环绕移动 样品渗入凝胶床 加样后打开下端出口 使样品渗入凝胶床内 等样品完全进入凝胶层后 关闭下端出口 洗脱 小心加入pH 7 0的20mmol l的磷酸缓冲液到适当高度 连接缓冲液洗脱瓶 打开下端出口进行洗脱 收集 待红色的蛋白质接近色谱柱底端时 用试管收集流出液 每5ml收集一试管 连续收集 在分离过程中 如果红色区带均匀一致的移动 说明色谱柱制作成功 教材P70 为什么凝胶的装填要紧密 均匀 如果装填不够紧密 均匀 就会在色谱柱内形成无效的空隙 使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过 搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序 影响分离的效果 思考 3 样品的加入和洗脱 调整缓冲液面 与凝胶面平齐 滴加透析样品 用量为1mL 样品渗入凝胶床 样品完全渗进凝胶层 洗脱 打开下端出口 用磷酸缓冲液洗脱 收集 待红色的蛋白质接近色谱柱底端时 用试管收集流出液 每5mL收集一管 连续收集 3 样品加入与洗脱 加样前 打开下端出口 使柱内凝胶面上的 缓慢下降到与 平齐 关闭出口 缓冲液 凝胶面 注意 正确的加样操作是 1 不要触及并破坏凝胶面 2 贴壁加样 3 使吸管管口沿管壁环绕移动 加透析样品 3 样品的加入和洗脱 调整缓冲液面 与凝胶面平齐 滴加透析样品 加到色谱柱的 样品渗入凝胶床 再调整缓冲液面洗脱 收集 待 接近色谱柱底端时收集 顶端 样品完全进凝胶层 红色的蛋白质 色谱柱制作成功的标志 红色区带均匀一致的移动 记 收集得到的纯化后的蛋白 4 纯度鉴定 电泳 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳1 垂直板电泳装置2 稳流稳压电泳仪 3 微量进样器 可用微量移液器代替 判断 的蛋白质是否达到要求 需要进行蛋白质的鉴定 纯化 5 装槽 点样 拔出梳子 将胶板固定在电泳槽上 凹板一侧向内 在电泳槽中加入缓冲液 点样 6 电泳 7 剥胶 染色及脱色凝胶板剥离 电泳结束后 撬开玻璃板 将凝胶板做好标记后放在大培养皿内 加染色液染色 然后用脱色液脱色 8 结果 观察你处理的血液样品离心后是否分层 见教科书图5 18 如果分层不明显 可能是洗涤次数少 未能除去血浆蛋白的原因 此外 离心速度过高和时间过长 会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀 也得不到纯净的红细胞 影响后续血红蛋白的提取纯度 三 实验结果分析与评价 1 你是否完成了对血液样品的处理 你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗 2 你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生 你的色谱柱装填得成功吗 你是如何判断的 由于凝胶是一种半透明的介质 因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯 检查凝胶是否装填得均匀 此外 还可以加入大分子的有色物质 例如蓝色葡聚糖 2000或红色葡聚糖 观察色带移动的情况 如果色带均匀 狭窄 平整 说明凝胶色谱柱的性能良好 如果色谱柱出现纹路或是气泡 轻轻敲打柱体以消除气泡 消除不了时要重新装柱 如果凝胶色谱柱装填得很成功 分离操作也正确的话 能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀 狭窄 平整 随着洗脱液缓慢流出 如果红色区带歪曲 散乱 变宽 说明分离的效果不好 这与凝胶色谱柱的装填有关 3 你能观察到蛋白质的分离过程中红色区带的移动吗 请描述红色区带的移动情况 并据此判断分离效果 五 操作提示1 红细胞的洗涤 洗涤次数 与离心时间十分重要 洗涤次数过少 无法除去血浆蛋白 离心速度过高和时间过长会使 等一同沉淀 达不到分离效果 离心速度 白细胞 2 色谱柱填料的处理 商品凝胶使用前需直接放在洗脱液中膨胀 可以将加入其中的湿凝胶用 加热 加速膨胀 3 凝胶色谱柱的装填 在装填凝胶柱时 不得有气泡存在 气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序 降低分离效果 4 蛋白质的分离 如果红色区带 地移动 说明色谱柱制作成功 沸水浴 均匀一致 1 在加样示意图中 正确的加样顺序是 2 用吸管加样时 应注意正确操作 分别是 贴着管壁加样 3 等样品 时 才加入缓冲液 待 接近色谱柱底端时 用试管收集流出液 每 mL收集一管 连续收集 尝试解答 1 2 不要破坏凝胶面使吸管管口沿管壁环绕移动 3 完全进入凝胶层红色的蛋白质5 探规寻律 对分离效果的判断 1 若血红蛋白的红色区带均匀 狭窄 平整地随洗脱液缓慢流出 则装填成功 分离操作正确 2 若血红蛋白的红色区带歪曲 散乱 变宽 则说明分离效果不好 装填不成功 互动探究 1 凝胶色谱柱的装填应注意哪些事项 2 血红蛋白溶液是如何分离的 提示 1 装填前为了加速膨胀 可以加入洗脱液的湿凝胶 用沸水浴加热 优点是 节约时间 除去凝胶中可能带有的微生物 排除胶粒内的空气 装填时不能有气泡 气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序 降低分离效果 装填后不能发生洗脱液流干露出凝胶颗粒的现象 血红蛋白是有色蛋白 因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液 这使血红蛋白的分离过程非常直观 大大简化了实验操作 思考 血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步 包括 样品处理 粗分离 纯化和纯度鉴定 首先通过洗涤红细胞 血红蛋白的释放 离心等操作收集到血红蛋白溶液 即样品的处理