（化学工艺专业论文）溶胶凝胶法固定化脱氢酶制备及其应用研究.pdf

天津大学硕士学位论文摘要 摘要 溶 胶一 凝胶 ( s o l - g e l ) 法以 其条件 温和、 操 作便利而 广泛用于生物分子 包埋。 固 定 化的 生 物 分子包括 酶、 蛋白 质、 核酸、 d n a , r n a以 及 细胞和小 器官， 用于生 物传感、 生物催化、 生物医学监测等领域。 本论文采用改 进的 溶胶一 凝 胶法固 定化脱氢酶 ( 醇脱氢酶、 醛脱氢酶和 酸脱氢酶) ， 并对制得的生物催化剂性质及其应用 进行研究。 首先采用溶胶一凝胶法分别对三种脱氢酶进行包埋，并比 较了 三种游离 酶和固定化酶的动力学。实验结果表明， 三种固定化酶酶促反应与游离酶酶 促反应都符合 d a z i e 基于 m i c h a e l i s - m e n t e n方程提出的 双底物 ( b i b i ) 酶促 反 应动力学模型， 三 种酶的 催化活 性和选择性都能 保持。固定 化后， 酸脱氢 酶 ( f e d h ) , 醛脱氢酶 ( f , d h ) 和醇 脱氢酶 ( a d h ) 的 酶活分别为游离酶 的5 0 - 7 0 % , 5 5 - 6 5 % , 4 0 - 5 0 。 三种酶促反应的 米氏 常 数也相应增大， 亲合 力降 低。 在凝胶过 程的 不同 阶段分 别加入酸和碱两 种催化剂，可以 加快凝胶 化速率， 并且改善凝胶材料的性质。 通过吸附检测， 含酶凝胶的孔径分布主 要集中3 .2 - 3 .5 n m之间; 通过透 射电 镜观测， 酶在 凝胶中分布均匀: 利用紫外 一 可见分光光度计检测，酶固定化后空间结构能 够保持完好。同时通过理论 方法 拟合了 醇 脱氢 酶酶促反 应动力学方程， 理论 拟合以 及实 验得到最大表观 反应速率分别为0 .4 0 s ， 和1 .6 8 ， 而两种方法得到的 米氏 常数吻合较好。 最后 采用溶胶一凝胶法将三种脱氢酶同 时包埋于凝胶体系中作为催化剂， 在常温 常压下催化二氧化碳转化为甲 醇。 关键词: 溶胶一 凝胶;固 定化; 脱氢酶; 动力学;二氧化碳;甲 醇 天津大学硕士论文 abs t ract s o l - g e l i s v e r y e f f i c i e n t , f a c i l e a n d g e n e r i c f o r b i o m o l e c u l e - im m o b i l i z a t i o n . p r o t e i n s , e n z y m e s , d n a , r n a , c e l l s a n d o r g a n e l l e s h a v e b e e n s u c c e s s f u l l y e n c a p s u l a t e d i n s o l - g e l m a t r ix f o r b i o c a t a l y s t , b io s e n s o r a n d b i o m e d i c a l d e t e c t i o n . i n t h i s p a p e r , t h r e e d e h y d r o g e n a n s e s ( f , , d h , f . ,d d h a n d a d h ) w e r e i m m o b i l i z e d b y m o d i f i e d s o l - g e l m e t h o d . p r o p e r t i e s a n d a p p l i c a t i o n s o f o b ta i n e d b i o - c a t a l y s t w e r e s t u d i e d s y s t e m a t i c a l l y . w e f i r s t c a r r i e d o u t t h e e x p e r i m e n t a l i n v e s t i g a t i o n o n t h e i m m o b i li z a t i o n o f e a c h d e h y d r o g e n a s e a n d t h e k i n e t i c s s t u d y o f e a c h fr e e a n d i m m o b i l iz e d d e h y d r o g e n a s e . k i n e t i c s o f b o t h t h e fr e e a n d i m m o b i l i z e d d e h y d r o g e n a s e s f o l l o w e d t h e b i b i e n z y m a t i c re a c t i o n m e c h a n i s m p u t f o r w a r d b y d e z ie l b a s e d o n mi c h a e l i s - me n t e n k i n e t i c e q u a t i o n . h o w e v e r , t h e c a t a ly t i c a c t i v i t y o f i m m o b i l i z e d f , tph , i m m o b i l i z e d f e n d h , i m m o b i l i z e d a d h w e r e o n l y 6 0 - 7 0 % , 5 5 - 6 5 % a n d 4 0 - 5 0 % o f t h e i r fr e e f o r m e d c o u n t e r p a r t s , r e s p e c t i v e l y . a n d t h e i n c r e a s e o f m- m c o n s t a n t v a lu e s s h o w e d t h a t t h e a ff i n i t y b e t w e e n 此 e n z y m e s a n d t h e s u b s t r a t e s d e c re a s e d . d u r in g s o l - g e l p r o c e s s , a c i d a n d a l k a li n e a c t i n g a s c a t a ly s t a t d i f f e r e n t p e r io d o f g e l p r e p a r a t i o n , w h i c h n o t o n l y d e c r e a s e d t h e g e l l i n g t i m e b u t a l s o im p r o v e d t h e p r o p e r ty o f t h e g e ls . t h e c h a r a c t e r iz a t i o n o f g e ls a n d i m m o b il iz e d e n z y m e s w it h in w e r e f o l lo w e d . t h r o u g h 从a d s o r p t io n - d e s o r p t io n e x p e r im e n t , th e a v e r a g e p o r e d i a m e t e r s o f b i o - d o p e d g e l s w e r e r a n g e d fr o m 3 .2 n m t o 3 . 5 n m w i t h n a r r o w p o r e s i z e d i s t r ib u t i o n s . t e m p h o t o g r a p h s s h o w e d t h a t t h e d e h y d r o g e n a s e s i n t h e g e l s w e r e d i s p e r s e d u n if o r m l y . d e t e c te d b y u . v s p e c t r o p h o t o m e t e r , t h e t h r e e - d i m e n s i o n a l c o n f i g u r a t io n s o f e n z y m e s w e r e w e l l p r e s e r v e d . a t t h e s a m e t im e , a m o d e l o f t h e e n z y m a t i c r e a c t i o n k i n e t i c m e c h a n i s m o f d e h y d r o g e n a s e w a s e s t a b l i s h e d . t h e s p e c i f ic v e lo c i t y o b t a i n e d fr o m t h e m o d e l a n d e x p e r i m e n t w e r e 0 .4 0 s a n d 1 .6 8 s , re s p e c t i v e l y . a n d t h e m - m c o n s t a n t v a l u e s g o t fr o m t h e m o d e l s h o w g o o d a g r e e m e n t s w it h t h a t fr o m e x p e r i m e n t . f i n a l l y , a l l t h e t h r e e d e d y d r o g e n a s e s w e r e c o - im m o b i l i z e d i n g e l s f o r t h e s y n t h e s i s o f m e t h a n o l fr o m c a r b o n d i o x i d e . 天津大学硕士论文 ke y wo r d s : s o l - g e l ; i m m o b i l i z a t i o n ; e n c a p s u l a t i o n ; d e h y d r o g e n a s e ; k i n e t i c s ; c a r b o n d i o x i d e ; me t h a n o l 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果， 除了文中特别加以标注和致谢之处外， 论文中不包含其他人己经发表 或 撰 写 过 的 研 究 成 果 ， 也 不 包 含 为 获 得 达 生叁生 或 其 他 教 育 机 构 的 学 位 或 证 书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已 在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名:签字日期: 年月日 学位论文版权使用授权书 本 学 位 论 文 作 者 完 全 了 解一 人圭垫有 关 保 留 、 使 用 学 位 论 文 的 规 定 。 特 授 权 一 孟生人 兰 一 可 以 将 学 位 论 文 的 全 部 或 部 分 内 容 编 入 有 关 数 据 库 进 行 检 索， 并采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存、 汇编以供查阅和借阅。 同 意学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名: 导师签名 签字日 期:年月日签 字日 期:1 - i 年 ，月/ z日 天津大学硕士学位论文前言 9 i1舌 溶胶一凝胶固定化生物分子是通过低温的溶胶一凝胶法将生物分子包 埋 于无 机s i 0 : 体 系中 的 过 程。 采用 溶 胶一 凝 胶 法制得无 机玻 璃早 在一 个世 纪 以 前 就 为 人 所 知， 1 9 5 0 年d ic k e y 采 用 溶 胶一 凝 胶法 将 几 种 酶 包 埋 于 无 机s iq 体系中并使酶的活性得以 保持，不过这个发现的意义在当时并没有为人们所 认识， 1 9 9 0年 a v n i r 等采用溶胶一 凝胶法包埋蛋白 质分子研究发现， 许多 酶如天冬氨酸酶、碱性磷酸酶能被包埋于以正硅酸乙醋 ( t e o s )为前驱体 的凝胶玻璃中而得到活性生物材料。随后 z i n k等报道了其他蛋白质如细胞 色素 c 、血红蛋白等包埋于以正硅酸甲酩 ( t mo s )为前驱体的凝胶玻璃中 后， 仍然具有 。 : 结合能力。 与其它生物分子固 定化方法相比，溶胶一凝胶 包埋法优势独特: 凝胶基质内透明，且没有光降解现象，适合作以光学如 光度、发光或荧光检测器的基质;可采用多种方法进行凝胶过程修饰， 如 聚合物添加剂、 氧化还原修饰剂以 及有机硅氧烷修饰剂 ( o r m o s i l s ) 等， 可 制备导电 材料如电 化学传感器; 凝胶材料具有一定的刚性，从而提高了 掺 杂分子的热稳定性，并且孔径可控，分布可调，能保证小分子和离子扩散进 入材料， 而包埋的生物分子仍能固定于材料中; 由于基质含有足够量的水， 生物分子处于水溶液的微环境中，保持了它的活性和稳定性，与在水溶液中 有相似的行为; 该方法包埋生物分子通用性强， 蛋白、核酸、抗体甚至细 胞都适于包埋。 迄今为 止，已 有许多 种 类的 酶 和 其它蛋白 质 被包埋于s o l - g e l 法形成的 基 质中，如铜锌超氧化物岐化酶、细胞色素 c 、肌红蛋白、血红蛋白、过氧化 氢酶、脂肪酶、 大豆过氧化酶、脉酶、葡糖氧化酶、碱性磷酸酶、 c u - z n超 氧化歧化酶、脉酶、 胰岛素、 辣根过氧化物酶、 硝酸还原酶、氯化氢水解酶。 研究表明，包埋后酶的稳定性提高，并可重复使用，包埋酶的活性一般可达 到未包埋时的 3 0 % - 1 0 0 % ，甚至有些超过了 相同条件下在溶液中的活性。固 定化生物分子所得生物材料己 广泛应用于生物催化剂、生物传感器、生物医 学检测、治疗等方面。 本文完成的主要工作有:改进的溶胶一凝胶法固定化醇脱氢酶、醛脱氢 酶和酸脱氢酶过程研究; 游离酶和固定化酶酶促反应动力学研究;理论方法 关联脱氢酶酶促反应动力学研究:三种脱氢酶共同包埋于凝胶体系中在常温 常压下催化二氧化碳转化甲 醇过程研究. 天津大学硕士学 位论文第一章文献综述 第一章文献综述 1 .1 1 .1 c 0 2 资源化 1 c 0 2 资源化的 意义 二 氧化碳是碳和含碳化合物的最终氧化产物， 在地球上储量极为丰富， 在大气中的 含 量 约 为0 .0 3 - 0 .0 4 % ， 总 量 约为2 .7 5 x 1 0 1 ， 吨。 另 外， c o : 的 潜 在资源一碳酸盐在自 然界中分布极广， 其含碳量更高， 碳酸盐中约含有 1 0 16 吨碳。随着工业化进程的加快，大量化石燃料 ( 煤、石油、天然气)的使用 造成大气层中的c o , 含量逐年上升， 温室效应越来越严重。另外， 化石燃 料日 渐枯竭， 也需要有新的碳源补充。c q作为未来碳源，既可弥补因石 油、天然气的大量消耗引起的 “ 碳源危机” ，又可有效地解决温室效应问题。 将二氧化碳用作化工生产过程的基本原料不但可以 减缓温室效应带来的危 害， 对碳平衡具有重要意义， 而且具有独特的优势: ( 1 )二氧化碳无毒、廉 价， 可代替有毒的 化学药品 例如光气 ( 碳酞氯) 、异氰酸盐;( 2 )与石油和 煤相比较， 二氧化碳可 完全再生; ( 3 )由 二 氧化碳转化生成的 产物可制备一 些新型材料;( 4 )开发的用二氧化碳生产化学中间体和产品的新的生产工艺 将比目 前的方案更具有经济效益和环保意义;( 5 ) c q性质稳定，易于运输 和 储 藏。 由 于 世 界 各国 对c q开 发 、 利 用、 转 化、 固 定 的 高 度 重 视， 使 得c o , 的 研究 开发 工作 近 年 来 取 得了 迅 猛的 发 展。 在 本世纪c o , 将 作为新的 碳 源发 挥出日 益重要的 作 用， c o : 的 应用将得到前所未有的 普及vn。 1 。 1 . 2 c 0 2 资 源 化 研 究 进 展 迄今为 止， 对c o t 的 研究、 处 理、 开 发 应 用大 致经历了 三 个阶段。 第一 阶 段 是c o : 的 一 般 研究 应用 阶 段。 在该 阶 段中c o t 只 是作 为 一 般的 非 金 属化 合物进行研究，根据其物化性质进行开发、应用，但大部分是物理方面的应 用。 第二阶段是温室气体阶段。自 从 2 0世纪以来人们就己经意识到使用化 石燃料会增加c q在大气中的 浓度， 从而产生温室效 应。 投入了一定的 人力 物力来着手解决c o : 问 题。 其中多 数是采用物理手段， 例如通过煤气化联合 天津大学硕士学位论文第一章 文献综述 循环发电( i c t c c ) 有 效 减 少c o , 的 排 放 量; 或 通过c q 的 地 下 与 海洋贮 内 y ol 尹/ k o - s .1 c h 苏o h 图1 - 1以 二氧化 碳为原料的 化工 合成 f i g . i - p r o d u c e s d e r i v e d f r o m c a r b o n d i o x id e 存。 而化 学 方 法 转 化c q的 研 究 大多 处 于 实 验 阶 段。 第 三 阶 段 是c o , 当 作 新 碳源阶段。 2 世纪 7 0年代的全球能源危机使人们己 清楚地认识到地球上的 矿产资源并非取之不尽用之不竭。目 前 世界上应用最广泛的 碳源石油与天然 气 到2 1 世 纪中 叶 将 会 枯 竭 ， 必 须 有 新 的 碳 源 补 充 进 去， 而 丰 富 的c o , 完 全 可以 作为 新 碳 源。 另 外c o , 作 为 碳 源， 其 最 大 优点 是 可 以 同 时 解 决 由c q不 断蓄积所产 生的 温室 效 应问 题。 使 地球 上c o : 达 到良 性 循环。 于 是， 人们将 c 仇的 研究、 开 发 应 用重点 放 在c o , 的 转 化上， 通 过 化学 催 化、 光 化 学 辐射、 电 化学还原、 微波、 等离 子 体、 生 化等 各 种方法 将c o , 转化 成其它 有用的 物 质必 ， 或将 其固 定 在 其他物 质 上 得到 新的 有用物 质。 利 用c o , 合 成的 化合 物 见图 1 一i所示。 其中， 采用二氧化碳催化加氢制备甲 醉的 方法受 到了科学 界的 广 泛重视。 许多 研究 者 指出 ， c o : 催 化加氢 制取甲 醇是 有效 利 用c q的 一 个重要途径， 也 是 今后c o , 作为 新 碳 源的一 种 标志。由 于c o , 催 化加氢反 应是 放热反 应， 收 率 随 着 温度 的 升高 而降 低， 但随着c o , 浓 度增大 而 增大， 天津大学硕士学位论文第一章文献综述 所以 需要寻求低温下促使c o , 氢化生成甲 醇反 应的 催化剂。 1 1 . 3 c o , 台 成甲 醇技术 甲醇是一种重要的大宗基础化工原料，从甲醇出发可以制取许多化工产 品。 另外，甲 醇又可作燃料， 在很多 情况下可直接用于能量转化系统， 其中 甲醇燃料电池是最有希望成为电动汽车电 源的化学电源。最近的研究发现， 甲 醇可以用作植物生长促进剂和制备甲醇蛋白， 其潜在用量会非常大。目 前， 甲 醇的 市场需求十分旺盛， 需求量以 每年 4 %一 6 % 的速度递增， 2 0 0 5年世 界甲 醇总需求量将达到约3 5 0 0 万吨【3 -0 1 . 1 . 3 . 1传统二氧化 碳合成甲 醇技术 早 在1 9 4 5 年， l p a t i e ff和m o n r o e 就首次 报道了在c u - a l 催化剂 上c o , 加氢合成甲 醇的 研究， 讨论了 催化剂组成、反 应温度、 h , / c o : 配比 和反应压 力的影响。 此后， 有许多催化剂体系的研究报道， 催化剂体系大致分成三类: 一类是铜基催化剂;另一类是以贵金属为主要活性成分的负载型催化剂，例 如银类催化剂，它具有非常高的甲醇选择性，但其活性较铜基催化剂低;还 有一类是其它催化剂，其中以铜基催化剂的研究居多，其综合性能最好，例 如 c u - z n - a i 催化剂， 而 c u - z n -a l 中加入少量过渡金属的四组分催化 剂的甲 醇合成活性比三组分催化剂好。美国工业溶剂公司的p e o r i a 工厂首先 采 用z n o - c r o 3 、 z n o - c u o , z n 0 - c r o 3 - c u o等 为 催 化剂， 在 高 压下， c 0 2 和h z 反 应 生 成6 8 % 的 甲 醇 和3 2 % 的 水 。 k ie ff e r 在5 . 1 5 m p a , 5 4 8 k下， 以 c u - z n ( ) 一几 q为 催 化 剂， c 仇转化 率 达1 6 % ， 甲 醇 选择 性达2 8 .2 %; 在5 7 3 k 时 ， c o , 的 转 化 率 为2 9 % ， 甲 醇 选 择 性 为1 5 . 1 2 % m a n d l e r 和w i l ln e r 则 利用r u 户 / m .v z + 系统产生 光导电 子， 然后将其转移到电 子转移分子 ( e l e c t ro n t r a n s f e r m o l e c u l e ) 如 2 - 疏基乙 醇、双硫丙氨酸和琉基丙氨酸，这些电子转移体能将 n a d p将还原为 n a d p h ， 而n a d p h在酶催化下可以 把 c o : 转 化为甲 酸。 但是酶在光照下 容易失活，且按酸脱狡在热力学上有利的， n a d h的还原能力不足以 促使正 反应发生。 k u w a b a t a等人则采用连串 反 应将 c o , 转化为甲 醇，反 应过程利 用酸脱氢酶和醇脱氢酶做催化剂，过程通过电化学方法产生电子，以甲 基哇 琳酮 ( p p q ) 或甲 基紫晶作电 子载体。 该反应为电 化学反应，因 此需要电 解 溶液、电 极、电 流输入以 及p p q和m .v z ， 并且反应必须在暗室中 进行。因 此对设备要求较高， 且没有解决酶易失活的问 题。 利用酸 脱氢酶 ( f d h ) . 醛 脱氢 酶 ( f . ,d d h ) 和醇 脱氢酶 ( a d h ) 三种 脱氢酶作为催化剂，以还原型二磷酸毗吮核昔酸 ( n a d h ) 作为电子供体， 可 将c 仇转 化为甲 醇。 与 传统方 法相比 ， 酶法的 优点 主 要 有: ( 1 ) 选择性可 达1 0 0 %; ( 2 )收率高;( 3 ) 反应在常温低压下即可迅速进行(8 -9 1 。 天津大学硕士学位论文第一章文献综述 上述反应途径早在 2 0世纪 6 0年代就有生物化学家进行了热力学和动力 学方面的基础理论研究，但所用酶均以游离态形式存在，研究的重心在脱氢 氧化过程而不是加氢还原过程。至于应用研究方面，则几乎没有文献报道。 为使生物酶与反应物 ( 底物)和产物易于分离，提高酶的物理化学稳定 性，并且能够实现酶的重复利用，需要寻求酶的适宜固定化方法。 s o l - g e l 法一般是前驱体在水及催化剂 ( 酸、 碱、盐) 存在下， 发生水解 和缩聚反应，释放出水和相应的醇，形成三维网络，得到湿凝胶，湿凝胶经 过老化、干燥得到干凝胶。其特点是:通过低温化学手段相对灵活地调控材 料的微观结构，使凝胶粒子的孔径达到纳米尺度。与吸附交联法和化学键合 法等传统固定化方 法相比， s o l - g e l 法固 定化酶优点突出， 其应用研究也日 益 深入，这将在后面章节中着重介绍。 1 . 2 溶胶一 凝胶法固定化生物分子 ， . 2 . 1 溶胶一 凝胶固定化生物分子研究简介 溶胶一 凝胶法固 定化生物分子过程是利用前驱体正硅酸醋 ( 或t i , a i , v , s n , z r 等的氧烷)水解、缩聚后形成凝胶网络，然后将生物分子毛囊于 其中的 p 0 4 4 1 。水解反应是在酸或碱的催化下完成的，形成的溶胶或者直接使 用，或者存放数周使溶胶粒子继续形成。存放过程中，水解和缩合反应进一 步发生， 形成更 大 范围 的 链 状、 枝状 或 者 胶体 状的 聚s i q。 将 水解 后的 前 驱 体与含有生物分子的 缓冲溶液混合形成包囊生物分子的 凝胶， 凝胶最初含水 量大 ( 5 0 -8 0 %) ， 孔径也比 较大 ( 约 2 0 0 m n ) . 经过几天或者几周的 老化， 凝胶结构进一步稳固。在此期间，在凝胶反应过程中产生的水和醇会从凝胶 体系中挥发，凝胶收缩 1 0 -3 0 %，孔径也会减少约 2 5 。最后，经过老化 的 材料部分干燥， 其中的水分也逐渐挥发，体系经过进一步交联， 结构也发 生坍塌， 孔径变为1 -2 0 n m， 孔体积也比原来减少8 5 。 在凝胶制备过程中， 可以 采用经过修饰的硅氧烷前驱体或在凝胶化过程中 加入添加剂对过程进行 修饰， 得到 有机/ 无 机杂 化凝 胶， s o l - g e l 过 程如图1 - 2 所 示。 为保证溶胶一凝胶法包埋的生物分子具有高的活性和稳定性，溶胶一凝 胶过 程需要 在一定 条 件下进 行， 保 证凝胶 过 程的 温度、 p h 、 离 子 强度 等都比 较适宜生物分子存活阴:溶胶一 过程凝胶需要在水相进行，因为多数生物 天津大学硕士学位论文第一章文献综述 金属氧烷前驰体 或经过修饰的硅氧烷 )掩:.l 碱 1* ft p j 亨 、 、 一一一 尸 图1 - 2 s o l- g e ， 法 包 埋 生 物 分 子 过 程 示 意图 f i g . 1 - 2 s k e t c h o f i m m o b i l iz a t io n o f b io m o le c u le s d u r in g s o l- g e l p r o c e s s 分子 在有机 相极易失 活， 在水 相中 可以 保 持生 物分 子 活 性; 聚合反 应的p h 和离子强度必须适宜于生 物分子保持活性 ( 通常p h 4 - 1 0 ,离子强度 o .o l m - l o o m) ; 为使生物分 子保持 其活性和空间 构象， 过程多在接近室温下进行; 所得材料孔径适中，分布均匀，能保证生物分子不泄漏，但分析物/ 反应 物能扩散到生物分子活性位点，并且需要通过修饰调节来凝胶材料的内部环 境从而使生物分子活性回收率最大。 溶胶一凝胶过程得到的材料如果用于传 感器，必须光学透明或者导电，以便进行光谱或电化学检测。凝胶材料的结 构需要加强，并可重复生产， 整块玻璃、薄膜、纤维状、柱状、粉末等形状 天津大学硕士学位论文第一章文献综述 都能得以控制。 1 . 2 . 2 溶胶一凝胶法固定化生物分子研究进展 采用溶胶一 凝胶法制得 无机玻 璃早在一个世纪以 前就为人所知， 至1 9 5 0 年d i c k e y采用 溶胶一 凝 胶 法 将 几 种 酶包埋 于无 机s i o : 体系中 并 使 酶的 活 性 得以保持，不过这个发现的意义在当时并没有为人们所认识， 三十年以 后 采用溶胶一凝胶法包埋生 物活 性物质才得以 重新研究。1 9 9 0 年a v n i r 等采用 溶胶一凝胶法包埋蛋白 质分子研究发现，酶分子如天冬氨酸酶、 碱性磷酸酶 能被包埋于以正硅酸乙酷 ( t e o s )为前驱体的凝胶玻璃中，能够得到活性 生物材料。随后z i n k 等报道了 蛋白 质如细胞色素c 、血红蛋白 等包埋于以 正 硅酸甲 醋 ( t mo s ) 为前驱体的凝 胶玻璃中后， 仍然具有q结 合能力。 从此， 大量采用各种凝胶化方法包 埋生 物分子包括酶、抗体、 常规蛋白 、膜蛋白 、 核酸以 及细胞的研究都得以 展开。目 前，许多研究都在寻找高活性和高选择 性的酶和蛋白质用于化学和生物传感器或可循环使用的生物催化剂。肌血球 素、 血色素、细胞色素c , 葡糖氧化酶、 碱性磷酸酶、 c u - 2 n 超氧化歧化酶、 脉酶、 胰岛素、 噬菌调理素、 辣根过氧化物酶、 硝酸还原酶、 芳去津、氯化 氢水解酶等许多生物分子都包埋于溶胶一 凝胶中，多 数包埋后的 细胞和酶能 保持其生物活性和光学特性。 溶胶一 凝胶生物分子固定化技术研究的日 益深 入， 同时也在很大程度上促 进了 生 物分子在合成化学、 分析化学、 生物检测、 医学诊断和治疗等领域的发展阴，固定化生物分子的范围逐扩大，包括蛋白 质、多肤、 氨基酸、 d n a , r n a 、 抗体甚至整个细胞。 1 . 2 . 3溶胶一凝胶法固 定化生物分子的优势与现存问题 传统生物分子固定 化方 法阴包括物理吸附， 共价键合， 这些方法存在明 显的缺点， 共价键合法条 件苛刻， 生物分子与介 质作用强烈， 活性回收率低; 物理吸附法生物分子容易脱附， 且这些固定化介质大多光学透明 性差，光学 手段检测难以 实现，固定 化的生物分子专用性强， 通用性差。 与其它生物分 子固定化方法相比，溶胶一 凝胶包埋法优势独特1 时 叹 ( 1 ) 固定化酶的可调控性 酶作为三维有序的有机分子， 可从微观和 介 观 水 平 上 控 制s o l - g e l 过 程， 从 而 形 成 具 有 特 殊 组 装 方 式 和 特定 结 构 形 态的 生物矿化凝胶。 根据需要，固定化酶可以 制成薄膜状、 块状、粒状或涂覆于 其它载体的表面。 天津大学硕士学位论文第一章文献综述 ( 2 ) 固定化过程的高效性 s o l - g e l 法固定化酶通常在常温或低温下进 行，通过温和、简便的物理过程，即可达到很高的酶空间结构维持率。另外， 基 质的 笼 效应 ( c a g e e ff e c t ) 使固 定 在基质中的 酶一 般不会渗出 ; 基质的 刚 性提高了酶的热稳定性;基质中足够量的水为酶分子提供了适宜的微环境， 从而保证了酶的活性和稳定性，使固定化酶呈现出与游离酶相似的行为。化 学键合法则要求酶分子具有一定的取向，这样可能会阻碍底物分子进入酶的 活性位点而影响酶的催化活性。 ( 3 )固定 化方法的 普适 性 s o l - g e l 法 包埋酶的 过 程是 在溶 胶转变为 凝 胶的过程中逐步把酶包埋在基质中的，因此，酶对基质无特殊要求，而吸附 交 联法 则要考 虑基 质孔 与 酶的 适 配性。 s o l - g e l 法基 质 对酶也 无特殊要求， 而 化学键合法则要求酶分子要有一定的功能基团。 但现有的s o l - g e l 法也 有一 些明 显 缺点， 总体 表 现是由 于s o l - g e l 反 应的 复杂性和缺乏分子水平上调控凝胶结构的手段，生物分子的 s o l - g e l 固定化 基本上停留在试差水平。具体的问 题主要体现在下述方面: ( 1 )机理研究方面。一般是简单沿用传统的溶胶凝胶过程的机理，而忽 略酶在凝胶结构形成中 所起的 ( 模板)作用。 ( 2 )凝胶制备多用一步法， 缺乏对水解缩聚速率有效的调控手段。此外， 前驱体多为烷基硅酸盐、烷氧基烷基硅烷，水溶性差需助溶剂和催化剂，而 助溶剂和催化剂都会对凝胶的性能带来不利影响。水解反应释放出的醇容易 引 起酶分子的 折叠和团簇化而使二级和三级结构受到一定程度的破坏，醇蒸 发在千凝胶形成时会引 起较大 幅度的收 缩和孔塌陷。 ( 3 ) 凝胶结构与性能。凝胶基质的刚性强而柔性差，易破碎:基质的孔 径偏小 ( 一般均小于 1 .5 n m )且分布较宽，内扩散阻力大，底物与产物在基 质中的传递速度慢;基质的生物相容性差，一定程度上破坏酶的活性和稳定 性。这样的复杂性再加上老化效应控制方面的困难意味着重复地制备结构适 宜、活性和稳定性高、机械强度大的生物凝胶到目 前为止还面临着不少来自 理论和实践两方面的困 难和挑战。 1 . 2 . 4 溶胶一凝胶过程影响因素 凝胶制备 过 程中 的 前 驱 体 类型， 水解 度 r ( r = 总 水量1 / 1 硅烷 1 ) ， 催 化 剂 类 型 ( 比 如酸 碱类型h f , h c i , n h , h , o等) 等的 确定， 对 溶 胶一 凝 胶 过 程中 反 应 速 率、 凝 胶 化 时 间( t , ) 和 老 化时 间 均 影 响 很 大 ， 从 而 影 响 到 凝 胶的孔径大小、孔径分布、比表面积和其他物理化学性能， 这些将在下面进 天津大学硕士学位论文第一章文献综述 行阐述。 ， .2 . 4 . 1 前驱体的影响 金属醇盐的水解、缩聚活性和金属原子中心的有关2 0 1 。一般而言，金属 原子的电负性越小，离子半径越大，配位不饱和度越大，金属醇盐水解的活 性越强。而元素周期表中从上到下金属原子半径增大，电负性降低，金属醇 盐更易于水解。表1 -1 列出了 金属醇盐的电负性、离子半径等数据2 1 -2 3 1 表1 - 1 溶 胶一 凝胶过 程中 常 见四 价金 属原 子的电 负 性氏， 部 分电 荷s m ， 离 子半径r , 不饱和度n 一，最高配位数n t a b l e l - l : p r o p e r ty o f m e t a l a t o m u s e d i n s o t - g e l p ro c e s s 金 属 醇 盐e 、一 r ( a ) - 一五 一一卫 一 卫 j - z s i ( o r ) 4 1 .7 4 / 1 . 9 0 0 .4 0 + 0 . 3 2 4 0 s n ( o r ) 4 1 .8 9 / 1 . 9 3 0 .6 0 6 2 t i ( o r ) 4 1 . 3 2 / 1 . 5 4 0 .6 4 + 0 .6 0 6 2 z r ( o r ) 4 1 .2 9 / 1 . 3 3 0 .8 7 + 0 .6 4 7 3 c e ( o r ) , 1 . 1 7 / 1 . 1 2 1 .0 2 + 0 . 7 5 8 4 ;., a l( o r )q.二 州_一 / 1 .6 于 - 一一 一 一 一 一 一 一 一 一 6 一 一 3 注: 此处为r = 异丙基的数值 由上表可知， 硅原子的四配体醇盐 ( n = 4 )中硅原子的电负性很高 ( e , = 1 .7 4 ) ， 部 分正电 核 很小( s = + 0 .3 2 ) 因 此， 其 水 解和聚合反 应通常不 易发生，要加入酸碱催化剂来促使反应的发生，不过由于硅醇盐易得，并且 生物相容性好，所以 应用最为广泛。 而过渡金属的四配体醇盐一般具有配位 数增高的趋势，反应较之硅的醇盐容易发生，凝胶化时间也很短，有的甚至 需 要在低 温或加入 其 他 溶剂 与 金 属络 合 来 控制反 应的 速 度。 另外， 烷氧基的空间结构也对凝胶化过程影响很大， 例如，由于位阻效 应， 同 样 条 件 下， t m o s 的 凝 胶 化 时 间( t g ) 明 显 比t e o s 要 短 ; 含 叔 碳 原 子或仲碳原子的醇盐不易发生齐聚，而伯碳原子的醇盐容易发生齐聚。 1 . 2 . 4 . 2催化剂的影响 天津大学硕士学位论文第一章文献综述 凝胶过程的催化剂主要为酸或碱，也盐类，其影响因素主要为酸碱 ( 或 盐)的类型以及量的多少，研究的主要方向集中在酸碱量的多少，即溶液的 p h对溶胶一 凝 胶过程水 解和聚 合反 应的 影响 上。 在酸性环境中，因 为水 解 反应过程发生首 先是凡。 十 进攻 s i 原子， 硅烷的水解速率随 着p h的降低而 加快，此时的水解速率大于缩合速率，凝胶化过程因强酸环境中的聚合过程 类似于有机物的聚合过程。该条件下制得的凝胶致密且比表面积较低。在碱 性条 件下， o i t 进攻s i 原 子， 随 着p h升高， 水 解 速率 会 加 快， 此时 的 水 解 速率也大于缩合速率。 而在中 性p h下， s i 0 : 粒子的溶解程度加剧，同时 还 导 致 粒子的 去 质 子 化的 表 面电 荷 增 加， 从 而 使团 聚 和 凝 胶 化 过 程 延 迟， t 8 增 加ix a i 。 因 此在酶分 子活性 范围内 较高 或较 低的p h都 会加快 凝 胶 化速 度。 采 用单一催化剂制得的凝胶孔径在1 . 5 m n 左右。 然而， 研究表明 酸或盐的阴离子对溶胶一 凝胶过程也有很大影响， 例如， 氟离子 f 一 的存在能缩短凝胶化时间，可能的原因是由于离子半径小于经基 o r，它能代替轻基发生亲核取代反应，因此氢氟酸 ( h f ) 或者氟化钾能明 显加快凝胶化速度。另外，在乙酸催化条件下由于乙酸能和从金属醇盐上脱 落的醇生成酷，同样加快反应速度。 1 . 2 . 4 . 3 其他影响因 素 温度升高能明 显提高 凝胶化时间，以t e o s为 前驱体， h c i 和h f催化 剂的凝胶化时间数据如表 1 - 2所示。但是在酶活性温度范围内，温度对凝 胶化参数影响与前述相比相对较小。 表1 - 2不 同 温 度 下h c i , h f 催 化 的 凝 胶 化 时 间、 s c h e m e 1 -2 t h e g e l - t i m e o f h c i , h f a t d i ff e re n t t e m p e r a t u re s hci hf 温度 2 5 0c 5 0 0c 7 0 0 c 另 外， 水 解 度r j g * jj ia j 当r _ 4 时 ， 水 解 能 完 全 ， 并 且 改 变r , 对t . 影 响 不 大 。 这也 表明 ， 当 大 量 水 存 在 下 ， t : 主 要 受 缩 聚 时 间 控 制。 目 前 采 用 溶 胶一 凝 胶 天津大学硕士学位论文第一章文献综述 法合成的有机/ 无机杂合材料应用也很广泛，该过程中添加的有机小分子或预 聚体对凝胶结构也有一定影响。 1 .2 1 . 2. .5 包埋生物分子在凝胶中的性质 5 . 1包埋生物分子在凝胶中的分布 生物分子在凝胶中的 分布情况是决定包埋后生物分子活性以 及分析物/ 反应物能到否达生物分子的关键因素之一。生物分子包埋过程中， 水相中的 生物分子首先需要在凝胶化之前扩散到凝胶体系中。通过吸收光谱分析蛋白 质如细胞色素 c的 研究表明， 简单的混合能使生物分子在宏观规模上均匀扩 散。 利用扫描电 镜可以 清楚观察凝胶中生物分子的分布情况12 5 1 ， 但是这种方 法不能确定生物分子所处的微环境，而利用有机探测剂小分子对荧光蛋白 进 行的荧光检测表明， 生物分子实际是在凝胶材料中的一些不同的微环境中扩 散的。利用凝胶前驱体、 添加剂、生物分子形成的材料，包埋生物分子以不 同的分子取向均匀扩散到凝胶孔中或吸附于凝胶表面， 伴随着凝胶一溶剂间 的不同官能团间的相互作用。并且，生物分子内部亲/ 疏水性、离子、氢键 的存在在某种程度上影响凝胶材料【2 6 1 1 .2 .5 .2 包埋生物分子的构象稳定性 保持生物分子结构序列和构象稳定性对保持生物分子活性功能非常重 要， p h 、 离子强 度以 及 介 质与 生 物分子间的 各 种作用 都生 物 分子构象稳 定性 和生物分子功能影响很大。 包埋生物分子的构象稳定性可以通过吸收光谱、 荧光、共振、 r o m a n 以 及偶极释放等手段检测。 对许多包埋蛋白( 小清蛋白、 癌钙蛋白、牛血清蛋白 ( b s a ) 、人血清蛋白 ( h a s ) )的构象研究表明12 7 1 在包埋之初这些蛋白 趋于保持它们的构象。不过超过2 0 %醇的存在能使生物 分子变性，由于在生物分子包埋过程中醇存在，它们能使一些生物分子在包 埋时 变性， 所以 在包 埋之初一 些生 物分子也会发生构象变化， 如h s a 。而溶 胶一凝胶体系在老化时能 够导致生物分子明显的构象变化，如对包埋 h a s 的研究就证明了这一点。 这些生 物分子结构的变化是由凝胶内部溶液组成( 水 的蒸发)变化以 及生物分子一 凝胶间的相互作用造成的，生物分子的这些构 象变化是不为我们所希望的。 对包埋生物分子进行深入研究的另外一个方面是生物分子在变性条件下 构象稳定性。在这些研究中，大量包埋生物分子在引入使生物分子变性物质 如盐酸孤或者提高包埋生物分子环境温度等条件下，分子构象发生了很大变 天津大学硕士学位论文第一章文献综述 化，这表明，包埋蛋白例如 b s a的许多构象运动在凝胶中受到限制，包埋 生物分子会以无活性的空间构象存在于凝胶体系中。而小分子蛋白，如细胞 色素 c和小清蛋白，包埋后能表现出所有构象变化，只是在老化时构象变化 受一定影响。大生物分子在凝胶材料中因为不能完全伸展而失活，表明凝胶 小的孔径不能给生物分子提供一个完全伸展的空间 ( 老化后凝胶的孔径一般 1 . 2 0 n m) a 对包埋生物分子的另外一些研究表明，包埋可以提高生物分子抵抗失活 的能力， 包埋生物分子需要在较高的 温度或苛刻的变性条件下才失活。 例如， 包埋的过氧化氢酶能在较高的醇浓度下存活， 包埋的辣根过氧化物酶 ( h r p ) 和肌红蛋白 与氧化物反应的速率降低。包埋生物分子稳定的提高与 “ 分子限 制”过程有关ip s i ，生物分子被限制在活动能力范围内不能发生构象变化，只 有足够高的能量才能使其结构展开。但是， 研究表明，生物分子提高的热力 学稳定性是暂时的， 凝胶材料老化时包埋生物分子会逐渐失去构象的整体性 而变性。这些研究也表明许多情况下生物分子的展开是不可逆的，主要因为 生物分子在展开时和凝胶表面发生作用，如生物分子和凝胶表面存在不希望 的静电作用。但可逆的变性同样有， 如癌钙蛋白。 总的来说， 包埋生物分