（植物学专业论文）苹果多酚类物质的提取分离及活性研究.pdf

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ep o m a c ee n o u g ha n d d e v e l o p i n gt h ep l a n t r e s o u r c e so f p r o a n t h o c y a n i d i n s ，a p p l ep o m a c ei su s e da sr a wm a t e r i a lm a i n l yt o e s t a b l i s ht h em e t h o do f e x t r a c t i o na n ds e p a r a t i o np r o a n t h o c y a n i d i n s m e a n w h i l e ， t o t a lp h e n o l i c sa n dp r o a n t h o c y a n i d i n si nd i f f e r e n tp a r ta n dd i f f e r e n tm a t u r ed e g r e ei n a p p l ea r ed e t e r m i n e d i na c t i v i t yl c s e a r c h , u s cp o l y p h e n o lo f a p p l ep o m a e et oc o n t r a s t w i t hu s u a la n t i o x i d a n tt 0d e t e r m i n et h ee 施c t so na n t i o x i d a t i o nt of a t s u s e p r o a n t h o e y a n i d i n so f a p p l ep o m a c et oc o n t r a s tw i t hu s u a ls c a v e n g e rt ot e s tt h e c l e a r a n c eo ff r e er a d i c a l a i lo f t h e s eh a dp r o v i d e ds c i e n t i f i cb a s i sf o rf u r t h e r r e s e a r c ho nf o o di n d u s t r y ，p h a r m a c y , c o s m e t i c sf i e l d 1 t h ed e t e r m i n a t i o nm e t h o do f t o t a lp h e n o l i e sa n dp r o a n t h o c y a n i d i n sc o n t e n ti n a p p l ea r ee s t a b l i a h e d t h eo r d e ro f t o t a lp h e n o l i c sc o n t e n ti s ：u n m a t u r e a p p l e p e e lo f m a t u r ea p p l e d r yp o m a c e p u l p ：t h eo r d e ro f p r o a n t h o c y a n i d i n sc o n t e n ti s ：p e e lo f m a t u r ea p p l e d r yp o m a c e p u l p u n m a t u r ea p p l e 2 u s i n gd r ya p p l ep o m a c ea sr a wm a t e r i a l ，t h eo p t i m a lt e c h n i q u ep a r a m e t e ro f e x t r a c t i n gt fa n dp r o a n t h o c y a n i d i n si ss e a r c h e db yo r t h o g o n a id e s i g n ：1 0t i m e s l i q u i do f 6 0 a c e t o n ea t 4 0 ( 2w i t h d r a w3t i m e s ，4h o u r se a c ht i m e 3 u s i n gp o l y a m i d es i l i c aa n ds o l v e n te x t r a c t i o nt oi s o l a t ep ca r es t u d i e d t h e r e s u l ti s ：t h ef o r m e rw i t h d r a w sr a t ei s0 0 2 2 5 ，t h ep u r ed e g r e ei s4 3 9 5 ；t h e l a t t e rw i t h d r a w sr a t ei s0 0 3 4 2 i t sp u r ed e g r e ei s3 4 2 t h e s es h o w st h a t a l t h o u g ht h ef o r m e rw i t h d r a wr a t ei sl o w e rb u ti t sp u r t yi sh i g h e r ，t h i si sg o o df o r t h ep cf u r t h e rs e p e r a t i o n 4 t h ea n t i o x i d a t i v ea c t i v i t yo fa p p l ep o l y p h e n o la r er e s e a r c h e d ，i te x p r e s s e dt h e o r d e ro f a n t i o x i d a t i o ni s ：d r yp o m a c e p e e lo f m a t u r ea p p l e u n m a t u r ea p p l e p u l p 5 c o n t r a s tw i t ho t h e ra n t i o x i d a n t , t h ea c t i v i t yo f a n t i o x i d a t i o ni s ：t b h q t h e p o l y p h e n o lo f d r yp o m a c e t h et e ap o l y p h e n o l b h t = v e 6 t h ep r o c e s so f a n t i o x i d a t i o ne x s i t st h ee q u i l i b r i u md e n s i t yo 0 8 ，l o w e rt h a n t h i sd e n s i t y ，h e l p st oo x i d i z e ；h i g h e rt h a nd e n s i t ye x p r e s s e st oh e l pt o a n t i o x i d i z e 7 i nt h ep r o c e s so f a n t i o x i d a t i o n ，t h ee f f e c to f a n t i o x i d a t i o nw o u l db ei n c r e a s ei f p o m a c c ep o l y p h e n o lm a t c hv cu s e st o g e t h e r 2 西北大学硕士学位论文 8 t h es c a v e n g i n go f t h ef r e er a d i c a l so f0 2 一：t h er e l a t i o no f p r o a n t h o c y a n i d i n s q u a n t i t ya n de f f e c ti sr e m a r k a b l e ，s c 5 0i s6u e gm 1 9 t h es c a v e n g i n go f t h ef l e er a d i c a l so f o h ：t h er e l a t i o no f p r o a n t h o c y a n i d i n s q u a n t i t ya n de f f e c th a v ec e r t a i n l y ，s c 5 0i s0 0 5m e g m 1 k e y w o r d ：a p p l ep o m a c e ；p o l y p h c n o l i c s ；p z o a n t h o c y a n i d i n s ；e x t r a c t i o n a n d i s o l a t i o n ；a n t i o x i d a t i o n ；f r e er a d i c a l 3 任静苹果多酚类物质的提取分离和活性研究2 0 0 5 年6 月 第一章文献综述 1 i 植物多酚类物质研究概述 1 1 1 植物多酚的概念 人们最初研究的植物多酚是单宁，“单宁”( t a n n i n ) 一词来自皮革工业， 是s e g i u m y u 于1 7 7 8 年提出，它指槲树树皮中使生皮成革的成分。按传统定义 单宁是指分子量在5 0 0 - - 3 0 0 0 之间的多酚物质，因为它们具有鞣性，或称为栲 胶和植物鞣质，而分子量过高或过低均不具有鞣性。对植物多酚的认识几乎与 栲胶生产同步i l 】，但由于人们最初对多酚的性质和应用主要基于其与蛋白质的 反应特性，而单宁是体现这一特性的有效成分，故长期以来相关科学，尤其是 葡萄、苹果加工行业习惯于用“单宁”一词来代替“多酚”。并一直混用至今。 二十世纪五十年代以后随着植物多酚与蛋白质、多糖、生物碱、微生物、酶、 金属离子反应活性及抗氧化、捕捉自由基、衍生化反应等一系列化学行为被揭 示，人们发现无论从化学、生物、药学等活性看，还是从应用角度考虑，有效 成分均不限于植物单宁，还包括其许多前体化合物，因而人们逐渐淡化了单宁 与非单宁的界限，而将植物中所含的单宁及与单宁有生源关系的化合物作为研 究对象，将其成为植物多酚( p l a n t p o l y p h e n o hp l a n t p o l y p h e n o l i e s ) 。 1 1 2 植物多酚的结构及分类 通常称植物植物多酚为次生代谢物质( s e c o n d a r ym e t a b o l i ce o m p o u n d s ) 。植 物次生代谢物质是指那些对植物整体或某一部分的存活非必需的化合物【2 】。它 们具有以下特征：结构的多样性和综合性、来自有限的生物合成前体，较为典 型的前体有：磷酸烯醇式丙酮酸、丙酮酸盐、醋酸盐、几种氨基酸、乙酰- - c o a 和丙二酰一c o a 。 植物多酚结构复杂，支链较多，可以与多种糖甙键结合，所以多酚类化合物 多种多样( 表1 ) 。这些酚类化合物存在于大多数果实和蔬菜中。酚类化合物组 成了具有广泛结构和功能的主要类别的次生代谢物，但大多数是带有一个或多 个羟基取代基的芳香环。 对于多酚的分类多种多样。k f r e n d e n b e r g 于1 9 2 0 年按照单宁的化学 结构特征将其分为水解单宁( h y d r o l y s a b l et a l l n i n s ) 和缩和单宁( c o n d e n s e d t a n n i n s ) ，这是传统的公认的分类方法。除典型的水解和缩和鞣质外，还发现了 西北太学硕士学位论文 一类兼具二者结构和性质的一类鞣质，称为新型鞣质( n e wt y p et e n n i n ) 1 3 i 。皮 革工业根据其鞣性将其分为单宁和非单宁。基于代谢生源可以将其分为：那些 来源于莽草酸途径和苯丙氨酸代谢途径的化合物，有人认为它们为“多元酚”， 这并不合适，因为并不是所有的化合物都是羟基衍生物。尤其是肉桂酸、莽草 酸和奎尼酸等一些化合物，尽管它们缺乏酚基甚至没有芳香环但考虑到代谢 途径仍称它们为酚类化合物。根据分子结构来描述多酚时，其特征是一些组成 型碳原子与基础的酚框架结构相连( 表1 ) 。分布最为广泛和种类最多的化合物 是具有c 6 一c 3 一c 6 黄酮框架的类黄酮，其中在苯环间的c 3 桥通常与氧环化。 少数的类黄酮结构依据c 3 部分的不饱和度和氧化程度来区分。还有的分类则依 据与环相连的取代基的数量和类别。酚类化合物还包括了聚合木质素和缩合单 宁【1 a , 5 , 6 】。 1 1 3 部分水果中的酚类化合物 植物是多酚化合物的主要来源。植物不同器官之间、同一种的不同种群之 间。多酚化合物的种类和数量不同。果实和蔬菜的每一部分都含有多酚化合物， 酚类化合物种类繁多，并且多以复杂的混合物存在，水果中已发现约有1 4 0 0 余 种，并不时有新的多酚物质发现。 人们对水果多酚研究主要集中在果实褐变和果酒( 葡萄酒和苹果酒) 的风 味研究上。褐变( b r o w n i n g ) 分为酶促性褐变和非酶促褐变，前者有多酚氧化 酶( p p o ) 参与，将多酚氧化生成颜色深的醌类物质，而后者没有酶的参与， 主要机制包括金属离子和酚类化合物相互作用、抗坏血酸降解和m a l l a r d 反应1 7 j 。 不同的水果中，占主要成分的多酚物质有所不同( 表3 ) 。这些酚类化合物 或赋予它们各自不同的特征或赋予水果更大的营养价值。如柿子涩味是由于它 含有大量的单宁；核果坚硬的果实夕 壳是由于大量的木质素导致，而某些葡萄 品种中含有的一种多羟基芪类化合物自藜芦醇是亦具有降血脂、抗血栓、增强 免疫力等生物活性；含有大量花青素的樱桃被用作食用色素添加剂。目前多酚 研究最为系统的水果是葡萄，其次是苹果。 任静 苹果多酚类物质的提取分离和插性研究 2 0 0 5 年6 月 表1 植物酚类化合物的主要类别 t a b l elt h em a i nc l a s s e so f p l a n tp o l y p h e n o l i c s 9 c 6 - - c 3羟基肉桂酸类 h y d r o x y c i n n a m i ca c i d s 苯丙烯类 p h e n y l p r o p e n e s 香豆素类 ( 氧杂奈邻酮) c o u m a r i n s 色酮类 c h r o m o n e s 咖啡酸c a f f e i ca c i d 阿魏酸f e r u l i ca c i d 肉豆蔻油醚m y r i s t i c i n 丁香酸( 丁香酚) e u g e n o l 7 一羟基香豆素 u m b e l l i f e r o n e 秦皮乙素( 6 ，7 二羟基香豆 素) a e s c u l e t i n 岩白菜内酯( 异香豆素异构 体) b e r g e n i n 丁子香色酮e u g e n i n 1 0c 6 一c 4萘醌类胡桃醌( 5 羟基1 ，4 - 奈醌) j u g l o n e 西北大学硕士学位论文 n a p h t h o q u i n o n e s蓝雪醌( 蓝茉莉素) p l u m b a g i n 表2 植物酚类化合物的主要类别( 续) t a b l e2t h em a i nc l a s s e so f p l a n tp o l y p h e n o l i c s ( c o n t i n u e ) 1 5c 6 一c 3 一c 6 黄酮类化合物( 类黄酮) 槲皮甙q u e r c e t i n f l a v o n o i d s二甲花翠甙( 锦葵色素甙) m a l v i n 异黄酮类化合物 i s o f l a v o n o i d s染料木素g e n i s t e i n n ( c 6 - c 6 ) 。木质素类l i g n i n s ( c 6 ) n儿茶素黑色素类 c a t e c h o im e l a a i n s ( c 6 一c 3 一c 6 ) n浓缩鞣质类( 单宁) f l a v o l a n s ( c o n d e n s e dt a n n i n s ) 任静苹果多酚类物质的提取分离和活性研究2 0 0 5 年6 月 表3 部分果实中多酚物质的主要类别 t a b l e3t h em a i nc l a s s e so fp o l y p h e n o l i c si nk i n d so ff i u i t s 7 c 6 一c l羟基苯甲酸类 h y d r o x y b c n z o i c 对一羟基苯甲酸草莓 p - h y d r o x y b e n z o i cs t r a w b e r r y a c i d s a c i d 葡萄是世界广泛种植的水果之一，葡萄浆果由果皮、果肉和种子组成，葡 萄酿酒或进行果汁加工的下脚料主要是葡萄皮与葡萄籽。葡萄果肉中主要含有 五类多酚化合物，即酚酸、黄酮醇、黄烷醇、黄烷酮醇和花青素甙。葡萄籽具 有“补气血、强筋骨、利小便，治气血虚弱、肺虚咳嗽、心悸盗汗、风湿痹通” 8 西北大学硕士学位论文 等功效，因为葡萄籽中含有多种营养保健成分“1 ，如多酚、油脂、粗蛋白、矿物 质和氨基酸等，主要含有的是多酚类物质( g s p ) 。g s p 具有抗氧化和降低胆固 醇水平的功能。g s p 中的各种成分的具体含量受品种、产地、季节、气候等的影 响。况且提取分离方法不同( 提取主要有甲醇一水系、丙酮一水系、超临界流体 等，所得结果也就不太一致。一般认为主要g s p 的主要成分是儿茶素类、原花 青素类( 即缩合鞣质类) ，大体上单聚体占1 1 、寡聚体3 4 、多聚体5 5 ，低聚 体中以儿茶素、表儿茶素和原花青素二聚体b l 、b 2 含量最高叫。其g s p 主要的 功效成分是白藜芦醇、白藜芦醇甙和原花青索，它们结构相似、功能相近。白 藜芦醇及其糖苷作为植物雌激素，日益引起人们关注，雌激素是决定女性生理 特征的核心物质，被称为女性“维生素”，因此在改善女性更年期综合症( 骨 质疏松症、免疫力下降、高血脂等) 的基础上研制新型美容( 特别是保持皮肤 水分和祛斑) 保健食品具有广阔的前景。由于低聚原花青素( o p c ) 优越的抗 氧化活性和对血管疾病的治疗作用使它在保健食品和化妆品中得到广泛应用， 如国外生产的o p c 制剂已像维生素一样，成为人们经常服用的具有延缓衰老和 美容等功能的保健食品。 此外茶多酚也是目前研究比较系统的。茶叶( t e a ，c a m e l l i as m e n s 括) 是由 山茶科植物的芽叶加工制成。按加工方法和成分的不同，可分为绿茶、红茶和 乌龙茶三大类。绿茶加工的主要特点是用高温抑制茶多酚氧化酶，保留原有嫩 茶叶特性，因而其成分与新鲜茶叶相似，主要为茶多酚，约占茶叶干重3 0 ；红 茶在加工过程中儿茶素被氧化聚合成醌类化合物，茶黄素约占红茶干重的1 2 ，决定了红茶的味道和颜色；鸟龙茶的加工经过部分发酵。全世界每年生产 2 5 0 万吨茶叶，绿茶占2 0 ，主要消费于亚洲国家；红茶占7 8 ，主要在西方国 家消费；2 5 为乌龙茶，主要由中国东南地区生产和消费“。茶多酚类化合物包 括黄烷醇、黄烷双醇、类黄酮和酚酸4 类物质，黄烷醇即通常所称的儿茶素， 约占茶多酚的7 0 ，绿茶儿茶素主要包括表没食子儿茶素没食子酸酯( e g c g ) 、表 没食子儿茶素( e g c ) 、表儿茶素没食子酸酯( e c g ) 、表儿茶素( e c ) 、没食子儿茶 素和儿茶索。其中e g c g 含量最高，约占儿茶素的8 0 9 6 1 。 茶多酚有着广泛的生物效应，主要有抗突变、抗肿瘤形成、抗炎抗病毒及 清除自由基和抗氧化等作用“”。而e g c g 作为一种无毒的抗氧化剂，对其抗突变、 9 任静 苹果多酚类物质的提取分离和活性研究2 0 0 5 年6 月 抗肿瘤形成的性质，国内外的许多学者己展开了大量的工作，并有研究显示， 口服e g c g 可以降低亚硝基胍衍生物诱发小鼠十二指肠癌的机率“”：并对u v b 导 致的a p l 活性有明显的抑制作用“。对于e g c g 的抗突变、抗肿瘤形成的机制， 一般归结为主要是清除活性氧自由基的结果“，而且能修复由羟基进攻导致的 d n a 损伤“”。 1 1 4 苹果中的主要多酚类物质 苹果中的多酚物质主要由黄烷醇、黄酮醇类化合物、羟基肉桂酸、二氢查 耳酮、花青素组成，如果按照酚类的酸碱性来划分，苹果多酚可分为酸性酚类( 主 要是绿原酸和咖啡酸) 和黄酮类化合物( 如儿茶索、表儿茶素、原花青素等黄烷醇、 黄酮醇、异黄酮) 【1 5 , 1 9 】，其中酸性酚类占总酚的1 3 ，而黄酮类化合物则占总酚 的2 3 。未成熟苹果和成熟苹果相比，虽然其成分组成相似，但成分含量上有很 大差别。成熟苹果的主要多酚类为绿原酸、儿茶素以及原花青素等，而未成熟 苹果中含有较多的二氢查耳酮、槲皮酮等化合物。总之，根据分子量大小大体 可以分为低分子组和高分子组分两类，如图1 和表4 所示主要的低分子类多 酚有酚酸酯类、根皮苷以及单体儿茶素等。另外，在一些红色的苹果品种中还 存在花色的苷色素成分c y a n i d i n - - 3 - - g a l a c t o s i d e ( i d e a i n ) 。高分子多酚( 单宁) ， 又大体可以分为两种，以没食子酸为主体的“加水分解型”( h y d r o l y z a b l e t a n n i n ) 和以儿茶素为主体的“缩和型”( c o n d e n s e d t a n n i n ) 。苹果中的高分子酚主要为 缩和型，另外一种含量很少 2 0 l 。绝大多数多聚原花青素是以( + ) 儿茶素、( ) 表 儿茶素、( + ) 蓓儿茶素和( - ) 蓓儿茶索等4 种黄烷醇组成，以一种结构单元缩合 而成的多聚原花青素较少见1 。 表4 苹果中酚类化合物的主要种类 t a b l e4t h em a i nc l a s s e so f p o l y p h e n o l i c si na p p l ef r u i t 咖啡酰奎宁酸( r = h ) 羟基肉桂酸类 c a f e o y l q u i n i q u ea c i d h y d r o x y c i n n a m i ca c i d s 邻香豆酰奎宁酸( r 早0 h )果肉和果皮 p - - - c o u m a r o y l q u i n a t ea c i d 0 西北大学硕士学位论文 木糖根皮苷( r 3 = 2 1 3 一d 一 木糖基一1 3 - ( 1 。6 ) - b d 二氢查耳酮葡萄糖苷) d i h y d r o c h a l e o n e s p h l o r c ：t i n x y l o g h c o s i d e 果肉和果皮 根皮苷( r 2 - 2 1 3 一d 一葡萄糖苷)果肉和果皮 p l o r i d z i n e 黄酮醇类 f l a v o n o l s 芦丁r u t i n ( r 4 _ 3 一q l 一木糖基一3 一 b d 一葡萄糖苷】 金丝桃菅( 凡= 3 1 3 一d 一半乳糖苷) h y p e r s i d e 异槲皮苷( 1 h - - 3 一b d 一葡萄糖苷)果皮 i s o q u e r i t r i n 3 一b d 一木糖苷一槲皮苷 ( r c y n o u t r i n c ) 广寄生苷( 3 一n l 一阿拉伯糖呋哺糖苷) a v i c u l a r i n e 槲皮苷( 3 1 3 一d 一葡萄糖基) q u e r c e t r i n 花色素类 a n t h o c y a n s 山越橘苷( 3 一对一半乳糖苷) i d e a i n 仅存在于红色 品种的果皮中 任静 苹果多酚类物质的提取分离和活性研究 2 0 0 5 年6 月 注：分子结构见图1 芝嘲0 洲蟛 i - 1 羟基肉桂酸类 h y d r o x y c i n n a m i ca c i d s 扩展单元 束端簟元 l - 2 儿茶紊类 c a t e e h i n s 1 - 3 原花青素类p r o a n t h o e y a n i d i n s 1 - 4 黄酮醇类 f l a v o n o l s h o l 一5 二氢查耳酮 d i h y d r o e h a l c o n e s 1 - 6 花色素类a n t h o c y a n e s 图1 苹果中主要多酚化合物的分子结构式 c h a r t1m o l e c u l a rs t r c t u r e so f t h em a i na p p l ef r u i tp o l y p h e n o l 1 1 5 苹果中多酚类物质的作用： 苹果多酚具有很多生理活性功能，己明确的功能性与生理活性总结如下： ( 1 ) 与抗氧化作用相关的功能【2 2 】 1 2 r_lill_lliili_1 西北大学硕士学位论文 a 在水相系统中抑制不饱和脂肪酸( 亚油酸，d h a ) 的自动氧化； b 防止胡萝卜素( b 一胡萝h 素，辣椒红索) 的光破坏： c 防止水溶性维生素( 抗坏血酸) 的破坏； d 消除超氧化自由基离子的活性( s o d 样括性) ； e 防止各种食品( 肉制品，水产加工品，含有油脂食品，糖果，饮料) 的氧化或提高它们的品质； f 在体外的小肠吸收实验中，抑制氧化型胆固醇胶束的可溶化。 ( 2 ) 与抗过敏作用相关的功能 a ( 通过抑制细胞内的钙离子浓度的上升) 抑制动物细胞中组胺的释出； bi 型过敏模型鼠经过口投与试验表明具有抑制效果： c 配合该多酚的外用软膏剂具有改善人体过敏性皮肤炎效果： d 配合该多酚的内服剂具有改善人体过敏性皮肤炎效果。 ( 3 ) 预防龋齿效果相关的功能 a 对形成龋齿的酶具有抑制作用； b 阻害细菌在玻璃试管上的黏附； c 抑制细菌分泌乳酸作用； d 配合该多酚的洗1 3 液具有抑制齿垢的效果。 ( 4 ) 与消臭相关的功能 a 具有抑制人唾液产生口臭成分( 四硫醇) 的效果； b 抑制鱼臭( 三四基胺) 的挥发效果； c 配合该多酚的浸渍液对水产加工品具有一定的消臭效果。 ( 5 ) 与美白作用相关的功能 a 抑制酪氨酸酶的作用； b 在b 1 6 鼠黑色素瘤细胞中具有抑制黑色素的产生的效果。 ( 6 ) 与抗变异原相关的功能 a 对食品或环境来源的变异原物质( b ( a ) p ，t r p - p l ，m n n g ) 具有抑制作 用。 ( 7 ) 与血压抑制相关的功能【2 3 】 a 具有抑制a c e 活性的效果。 任静 苹果多酚类物质的提取分离和活性研究 2 0 0 5 年6 月 因此苹果多酚具有的上述这些功能和作用受到了世界的普遍关注，这也是世 界食品营养学界和医学界掀起多酚研究热潮的主要原因之一。 1 1 6 苹果中多酚物质及其在果实发育过程中的变化 苹果果实发育过程中总酚、绿原酸、黄烷醇和原花色素含量的变化与平均 单果重变化呈显著或极显著负相关，因此认为果实重量的增加也可能是果实发 育过程中多酚物质含量下降的主要原因之一。但对单个果实而言，其中的多酚 物质总量在果实发育早期有一个上升的过程，然后逐渐减少，表明苹果果实发 育早期多酚物质合成比较迅速，而后期则逐渐变缓或停止，同时多酚物质的转 化加快，造成总量的下降，这与h a r e l 等1 的推理相一致。m a y r 等蚓认为在 苹果果实发育过程中以绿原酸为代表的羟基肉桂酸类化合物和黄烷醇单体的 减少有利于黄酮醇和原花色素的合成。王思新等踟研究发现，苹果果实发育过 程中果肉中绿原酸占总酚含量的比例逐渐下降，而黄烷醇和原花色素所占比例 则呈上升趋势，同时原花色素在黄烷醇中所占的比例也逐渐上升，表明在果实 发育过程中黄烷醇单体加强了聚合的过程。关于苹果果实发育过程中各种多酚 物质的代谢、转化过程还有待于进一步研究。在他所有研究品种中，早期的幼 果中多酚物质的含量均较高，因此利用苹果生产中疏果时废弃的幼果提取多酚 物质，可能具有极大的开发价值和广阔的发展前景。各品种中首红、国光果实 中多酚物质的含量相对较高，因此可作为提取苹果多酚比较适宜的原料品种。 1 1 7 酚类物质的测定方法 测定植物多酚的方法很多，可以分为无机化学分析法( f o l i n 一酚法、金属络 合法、香草醛法和正丁醇盐酸法) 、蛋白质结合法( 蛋白质吸附法：如皮粉法， 蛋白质沉淀法：如红血球法) 、物理测定法( u v 、h p l c ) 三大类。没有一种 方法可以测定所有对象，都有一定的局限性，多数定量方法是相对的。 f o l i n - - c i o e a l t e u 法。又称g a e 法( g a l l i ca c i de q u i v a l e n c e ) ，是目前检测 总酚的通用方法【2 8 】，结果准确可靠。但它不能确定产品的组分，一个高含量单 体的产品或一个低含量单体但高含量o p c s 的产品有可能产生相同的结果。 b a t e s s m i t h a s s a y 【2 9 l 法此为最早评价葡萄籽提取物中原花青素含量 ( p r o e y a n i d o l i c i n d e x ) 的方法，用已知阈值的原花青素在相同的反应条件下为对 照，在5 0 0 h m 处测定其吸光度，精确控制实验条件可以较为准确地测出葡萄籽 西北大学硕士学位论文 提取物中原花青素的阈值，由于其对实验条件的苛刻性，实验的重复性太差，即 使是同一个实验室对同一个产品进行测定也不能得到相同的结果。 p o e r 法：由于b a t e s s m i t l l 的低重复性，最终被波特法所取代，此方法为 改良型的比色法，使用定性分析，测试出原花青索的大概量，但测不出是何种类 的原花青素，波特值( p r o ) 过高和过低都不好，过低则表示单体过多，原花青素 含量低；过高可能是高聚物含量过高，低聚原花青素含量低。其值应该在3 0 0 4 5 0 之间较为理想。 所以要确定单体的含量还需进一步h p l c 或h p l c - - m s 即高效液相色谱 法结合质谱分析法，主要用于单体物质的分离测定。它可以通过被测定物质与 标准样品的特征吸收谱线和保留时间进行定性分析。根据吸收面积进行定量分 析。 1 2 原花青素的研究概况 1 2 1原花青素分子结构特点 原花青素分子结构单元是由儿茶素、表儿茶索或没食子酸组成，有人将其 归为生物类黄酮，也有人将其归为缩合鞣质( 单宁) a f to 随着分离鉴定技术的提 高和对此类物质的深入研究与深刻认识，现已成为独树一帜的一大类物质并称 之为原花青素。1 9 6 1 年德国的k a r l 等0 2 1 首次从英国山核的新鲜果实的乙醇提取 物中首次分离出2 种多酚化合物，1 9 6 7 年，美国j o s l y n 等。”又从葡萄皮和籽提 取物中分离出4 种多酚化合物，他们得到的多酚化合物在酸性介质中加热均可 产生花青素( c y a n i d i n s ) ，故将这类多酚化合物命名为原花青素。原花青素是由 不同数量的儿茶素或表儿茶素结合而成。最简单的原花青素是儿茶素、表儿茶 素或儿茶素与表儿茶素形成的二聚体，此外还有三聚体、四聚体等直至十聚体。 按聚合度的大小，即缩和体的多少，通常将二一四聚体称为低聚体 ( p m c y a n i d o l i cd i g o m e r s ，简称o p c ) ，将五聚体以上的称为高聚体( p r o c y a n i d 0 1 i c p o l y m e r s ，简称p p c ) 。二聚体中，因两个单体的构象或键合位置的不同，可有 多种异构体，已分离鉴定的8 种结构形式分别命名为b , - - b 。，其中，b i 一既是由 c 。一c s 键合，b s 一由c 一一c 。键合。在各类原花青素中，二聚体分布最广，研究 最多，是最重要的一类原花青素。三聚体中也因组成的单体及其相连接碳原 子位置的不同形成各种各样的结构并命名为c 。，c ：。其中c 在自然界中分 任静苹果多酚类物质的提取分离和活性研究 2 0 0 5 年6 月 布丰富。“1 。已有实验证明，原花青素清除自由基的能力可能是由于这类物质分 子中具有多电子的羟基部分，8 个酚羟基( 儿茶素) 均与双键共扼，为氢原子的给 予体，且芳环上的共轭双键使电子在分子中得到稳定。两个脂肪族羟基提供良 好水溶性。正是分子结构这些特性，使其具有清除自由基良好抗氧化性呻1 。 1 2 2 原花青素的植物资源 原花青素在自然界中广泛存在，它主要存在于植物韵果实、种子、花和皮中， 是植物体内天然的抗氧化物质。人们对它的研究已有4 0 多年的历史，特别是自 2 0 世纪8 0 年代以来，全世界对原花青素的研究日益广泛和深入，中、德、法、 意、奥、美、曰、印、匈、新、韩等国研究人员主要针对下列植物中的原花青 素进行了研究：葡萄，英国山楂，单子山楂( c r a t a u g e sm o n o g y m a ，c a z a r o l u s ) ， 花生，日本罗汉柏( t h u j o p s i sd o l a b r a t a ) ，北美崖柏( 珊咖o c c i d e n t a l i s ) ， 土耳其侧柏( t o r i e n a l i s ) ，花旗松( p s e u d o t a u g am e n z i s e i i ) ，自桦树，野生 刺葵( p h o e n i x s y l v e s t r i s ) ，番荔枝( d i c h r o s t a c h y sc i n e r e a ) ，野草莓( f r a g a r l a v e s e a ) ，日本莽草( i l l i c i u ma n i s a t u m ) ，扁桃，高梁，耳叶番泻( c a s s i a a u r i c u l a t a ) ， o h h o h 原花青素，n 为0 1 0 图2 原花青素的结构通式 c h a r t2t h es t r u c t u r eo fp r o a n t h o c y a n i d i n s 两谷椰子( m e t r o x y l o ns a g u s ) ，可可豆，贯叶金丝桃，头状胡枝子( l e s p e d e z a c a p i t a t a ) ，粘胶乳香树( p i s t a c i a l e n t i s c u s s c l e r o c a r y a b i r r e a ) ，海岸松，洋委 凌菜( p o t e n t i l l at o r m e n t i l ) ，l e p t a r r h e n ap y r o l i f o l i a 和大黄等。此外，还用银 杏，花旗松和茶子r i b e s n i g r u m 的叶和小连翘进行了组织培养研究。除植物外， 1 6 西北大学硕士学位论文 葡萄汁、红葡萄酒、苹果汁、苹果酒和啤酒中也都含有原花青素。1 0 0 多年来， 在涉及的众多植物中葡萄一直是经久不衰的研究课题。5 0 年代以来，人们从 葡萄果实、叶和其它部位分离、鉴定的多酚化合物、脂肪酸、维生素、酶、碳 水化合物、氨基酸、多肽和蛋白质、萜烯与挥发油成分以及脂类、果胶和蜡等 物质达1 0 0 多种3 。在众多成分之中，人们感兴趣的是鞣花酸、白藜芦醇及其 低聚体、花青甙和原花青素，因为葡萄的医疗功效大都与这些成分的药理活性 有关，其中最感兴趣的是原花青素1 。到且前为止，已从葡萄籽和皮中分离、 鉴定了1 6 种原花青素，其中有8 个二聚体、4 个三聚体，其它为四聚体、五聚 体和六聚体等。1 9 7 6 年b o m b a r d e l l i 发明了从葡萄籽中提取高含量原花青素混 合物的方法，用此法提取的原花青素混合物中二聚体的含量可达1 5 。”。1 9 9 1 年，法国d u m o n ”指出，同一地区的不同品种或不同年分收获的葡萄，其籽中原 花青素的聚合度和总含量有很大差别。葡萄( 籽和皮) 作为原花青素的重要资源， 日益受到人们的关注。除葡萄之外，在山核、花生、银杏、白样树、松树等植 物中的含量都很丰富。 1 2 - 3 原花青索的提取分离工艺研究 国外关于从葡萄籽中提取o p c s 报道很多：法国c o r i r m ep r i e u r 等选6 0 丙 酮提取；波兰o z m i a n k ij a n ，1 9 9 6 年申请专利，以丙酮为溶剂，采用超声波提 取；美国j o s l y n 和d i t t m a r 选用8 0 n 乙醇：法国f r a n c o i s em r o m e y e r ，美国 t h o r m a g a t e 和s i n g l e t o n 均选用8 0 乙醇为溶剂，从葡萄籽中提取o p c m 而堪 称o p c s 鼻祖的法国m a s q u e l i e r 教授，他先后申请专利以松树皮、葡萄籽为原 料，用水提取o p t s 3 9 1 。目前，国内外关于原花青素的提取分离主要是多级溶 剂萃取法和吸附层析法。 1 。溶剂萃取法法国j a c q u e sm a s q u e l i e r 以海松树皮为原料，用沸水提取。乙 酸乙酯萃取沸水粗提液，再用三氯甲烷沉淀。波兰o s z m i a m s k ij a n 以丙酮为溶 剂超声提取葡萄籽，零下1 8 乙酸乙酯萃取丙酮提取液，再用三氯甲烷沉淀。 美国h e n k e l 公司申请专利，以沸水从葡萄籽中提取o p c s ，乙酸乙酯萃取粗 提物，再用三氯甲烷沉淀产品【4 0 j 。吕丽爽h i j 采用乙醇从石油醚脱脂的葡萄籽中 提取o p c s ，然后冷却离心提取液，再减压蒸馏。余莹等 4 2 1 将葡萄籽粉碎， 任静苹果多酚类物质的提取分离和活性研究2 0 0 5 年6 月 用丙酮冷浸提取2 次，每次2 0m i n ，减压蒸去丙酮后用氯仿萃取除去脂溶性物 质。再以乙酸乙酯萃取2 次，合并乙酸乙酯相，用m g s 0 4 干燥后减压蒸干， 得到原花青素不同聚体的混合物。 2 吸附层析法l y e a pf o o 等用丙酮提取，正己烷脱脂，然后用s c p h a d e xl h - - 2 0 柱层析来分离制备原花青素低聚体【4 3 】，张峻等m 】采用a b 一8 、n k a i i 及d 3 5 2 0 三种国产大孔吸附树脂对葡萄籽原花青素进行分离，通过静态和动态 吸附试验得出a b 一8 对p c 的吸附能力最强，吸附后以乙酸乙酯洗脱，产物总 酚含量可达9 0 以上。吕丽爽【4 5 】用聚酰胺柱层析提纯葡萄籽粗提取物，分离 后的产品纯度可达9 9 。吕丽爽等【4 6 】还用薄层色谱法精制o p c s ，薄层板为 0 5 c m c - - n a 硅胶g 板，流动相为甲苯丙酮乙酸( 3 ：3 ：1 ) ，显色剂为