（植物学专业论文）不同浓度nacl处理对盐地碱蓬叶片中cat、gr和gst的影响.pdf

山东师范大学硕士研究生论文2 0 0 4 年4 月 独创声明 y5 9 8 8 4 2 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究 工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致 谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果， 也不包含为获得 ( 注：如没有其他需要特别声明的， 本栏可空) 或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一 同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的 说明并表示谢意。 澎1 壶论红饼签名：藏铝竺z 予师签名? 砂参j ， 壅字曰明夕午，午2 富鉴轴期：，扫争- 1 夕 囊缀作者、导孵阀国 0 留垒文公嚣 山尔师范九学硕士研究生论文2 0 0 4 年4 玛 不同浓度n a 0f 处理对盐地碱蓬叶片 中c a t 、g r 和6 s t 的影响 捅要 越来越多的实验证明，盐胁迫诱导植物体内活性氧( 0 2 。、h 2 0 2 、o h - 等) 产 生的增加，引起氧化胁迫。其中0 2 和h 2 0 2 在盐对植物的伤害机带, l e p 起着主要 作用。0 2 。主要由超氧化物歧化酶( s o d ) 通过歧化反应形成h 2 0 2 和0 2 而进行 清除，s o d 在降低0 2 毒害的同时却增加了细胞内h 2 0 2 的含量，除此之外细胞 内一些酶促或非酶促反应也能产生h 2 0 2 ，i - 1 2 0 z 在过渡金属存在下可转化为氧化 活性更高的o h 。因此，植物能否有效地清除逆境下产生的h 2 0 2 对其抗逆性至 关重要。本实验比较系统地研究了不同浓度n a c i 处理下，盐地碱蓬叶片中情除 h 2 0 2 的各种酶( c a t 、g r 、g s t ) 的活性及非酶类物质( g s h ) 含量的变化情 况及h 2 0 2 水平，并结合其它生理指标阐明他们在盐地碱蓬耐盐性中的作用，旨 在了解盐地碱蓬的耐盐性与h 2 0 2 清除系统的关系，进一步完善盐生植物的耐赫 机理，结果如下： 1 、n a c i 处理对盐地碱蓬生长状况的影响 盐地碱蓬整株鲜重随n a c l 处理浓度的增加出现先增后降的趋势，在2 0 0 m m o l l ，整株鲜重与对照的差异达到极显著水平( p 0 0 5 ) ，膜透性改变不明显( 图1 7 ) ，说明盐地碱蓬膜 m 尔师范大学硕士研究生论文2 0 0 4 年4 舄 系统受损伤较轻，甚至不会对植物生长产生影响，意味着盐地碱蓬具有很强的抵 抗献胁迫诱导的氧化胁迫能力。 4 、n a c i 处理对盐地碱蓬叶片中h 2 0 2 含量的影响 盐地碱蓬叶片中h 2 0 2 的含量出现先降后增趋势，但均低于对照，h 2 0 ：含量 降低，减小了其对细胞的氧化伤害，2 0 0m m o l l 处理时差异达到了极显著水平， 在此浓度下黼地碱蓬的生长状况也是最好的。 5 、n a c i 处理对盐地碱蓬叶片c a t 的效应 随着盐处理浓度的增加，叶片中c a t 的活性呈上升趋势( 图1 9 a ) 。盐地碱 蓬叶片c a t 活性在小于2 0 0m m o l l 的情况下，随盐处理浓度的增加c a t 活性 增加并不显著( p 0 ，0 5 ) ，当浓度增加到2 0 0 m m o l l 时，活性增加迅速( p o 0 5 ) ， 4 0 0m m o l l 时，活性显著高于对照( p 0 0 1 ) 。n a c l 处理仅诱导c a t 酶活性的 升高，并没有诱导新的同工酶产生。 6 、n a c i 处理对盐地碱蓬g r 、g s h 的效应 不同浓度n a c i 处理下，盐地碱蓬叶片中g r 、g s h 的变化趋势基本相同， 均呈先上升后下降的趋势，但与对照相比都达到了显著差异，2 0 0m m o l l 时g r 的活性及g s h 的含量最高，与对照相比差异达到了极显著的水平( p 0 0 1 ) 。 叶绿体中g r 主要分布于类囊体膜和叶绿体基质中，其中叶绿体基质中的 g r 占主导地位。随盐处理浓度的增加，叶绿体中总g r 、类囊体膜g r 、基质 g r 的活性呈先上升后下降的趋势，但与对照相比差异显著，2 0 0m m o i l 时差异 达到了极显著的水平( p o 0 1 ) 。这种变化趋势与整个细胞中g r 活性的变化趋 势是一致的。叶绿体中g r 约占整个细胞中可溶性g r 的7 5 左右，由此可推测 叶绿体中的a s a g s h 循环在整个细胞中占主导地位，在清除叶绿体中的h 2 0 2 时起主要作用。 非变性电泳显示盐地碱蓬叶片中g r 同工酶只有一种，活性受到n a c l 处理 的促进，但在4 0 0m m o l ln a c l 时有所下降。 7 、n a c i 处理对盐地碱蓬叶片g s t 的效应 不同浓度n a c i 处理下，盐地碱蓬叶片中g s t 也具有先上升后下降的趋势， 有所不同的是g s t 只在2 0 0m m o i l 时与对照相比达到了显著差异的水平 ( p 0 0 5 ) 。 用n o r t h e m 印迹杂交法分析盐地碱蓬g s t 基因的表达特性，结果表明，4 0 0 m m o l 几的n a c l 处理对盐地碱蓬g s t 基因的诱导先是受抑制，然后显著增强， n a c i 溶液处理4 8h 的m r n a 水平约为对照植株的2 3 倍。 总之，盐地碱蓬具有很强的适应盐渍环境的能力和抗氧化胁迫能力。在高 盐胁迫下，盐地碱蓬仍能生长良好，光合作用依然高效地进行，h 2 0 2 水平不但 山东丽范大学硬士磅究生论文 2 0 0 4 年4 恕 没上升，反而下降，m d a 含量也无显著变化，这与其具有高效的叶绿体h 2 0 2 清 除系统相一致，这可能是盐生植物耐盐的重要机制之一。 关键词：盐地碱蓬；盐处理；h 2 0 2 清除系统；抗盐性 分类号：q 9 4 s 7 8 4 山永师范大学碗+ 研究生论文2 0 0 4 年4 磅 e f f e c t so fn a clt r e a t m e n to nt h ec a t 、g r a n dg s ti nt h el e a v e so fs u a e d as a i s a a b s t r a c t t h ee n h a n c e dp r o d u c t i o no fr o sd u r i n gs a l ts t r e s sc a np o s eo x i d a t i v es t r e s st o c e l l sa n dl e a dt ot h eo x i d a t i v ed e s t r u c t i o n h i g hn a c lc o n c e n t r a t i o n ss e e mt oi m p a i r e l e c t r o nt r a n s p o r ta n dl e a dt ot h ef o r m a t i o no fr o s p l a n t sh a v ew e l l d e v e l o p e d a n t i o x i d a n td e f e n s es y s t e m sa g a i n s tr o s ，i n v o l v i n gb o t h e n z y m a t i c a n d n o n e n z y m a t i cm e c h a n i s m s t h ec h i e ft o x i c i t yo f0 2 a n dh 2 0 2i st h o u g h tt or e s i d ei n t h e i ra b i l i t yt oi n i t i a t ec a s c a d er e a c t i o n st h a tr e s u l ti nt h ep r o d u c t i o no ft h eh y d r o x y l r a d i c a la n do t h e rd e s t r u c t i o ns p e c i e ss u c ha s l i p i dp e r o x i d e s t h e s ed a n g e r o u s c a s c a d e sa r ep r e v e n t e db ye f f i c i e n to p e r a t i o no ft h ec e l l sa n t i o x i d a n td e f e n s e s s o d c o n v e r t ss u p e r o x i d er a d i c a l s ( 0 2 一) t oh y d r o g e np e r o x i d e ( h 2 0 2 ) h y d r o g e np e r o x i d e a c t s a sap r e c u r s o ro fm o r ec y t o t o x i co rh i g h l yr e a c t i v eo x y g e nd e r i v a t i v e s ，s u c ha s p e r o x y n i t r i t eo rh o i ti sv e r yi m p o r t a n tt os c a v e n g et h ee x c e s s b q c a tg ra n d g s ta r er e l a t e dt oh 2 0 2 一s c a v e n g i n g i nt h ep r e s e n ts t u d y , s a l t d i l u t i o nh a l o p h y t es s a l s ag r o w nu n d e rd i f f e r e n ts a l tc o n c e n t r a t i o n sw a su s e dt oi n v e s t i g a t et h ea c t i v i t i e s o f h 2 0 2 s c a v e n g i n ge n z y m e s t h em a i nr e s u l t sa r ea sf o l l o w s 1 e f f e c t so f n a c it r e a t m e n to ng r o w t ho f s s a l s as e e d l i n g s t h eg r o w t ho fs s a l s aw a ss i g n i f i c a n t l ye n h a n c e db yn a c lt r e a t m e n t t h ef r e s h w e i g h ti n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l yw i t ht h ei n c r e a s eo fn a c lc o n c e n t r a t i o nu pt o2 0 0 m m o l la n dd e c r e a s e ds l i g h t l ya th i g h e rc o n c e n t r a t i o n s h o w e v e r , t h ef r e s hw e i g h to f t h es e e d l i n g st r e a t e dw i t h4 0 0m m o l l ln a c lw a ss t i l lh i g h e rt h a nt h a to fc o n t r o l s u n d e rt h ec o n d i t i o no f2 0 0m m o l ln a c l ，t h ef r e s hw e i g h to fss a l s ar e a c h e dt h e m a x i m u m rs a l s ap l a n t sa c c u m u l a t e dh i g hn di n s a l te n v i r o n m e n t t h el e a v e so f s s a l s a a r et h em a i no r g a n so f n 0a c c u m u l a t i o n l e a f n 0a n dc 1 ”c o n t e n t sw e r es i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e dw i t ht h ei n c r e a s eo fn a c ic o n c e n t r a t i o n ( o 一4 0 0m m o l l ) ，w h e r e a sk 十 c o n t e n ta n do s m o t i cp o t e n t i a lo ft h ec e l ls a po ft h el e a v e sw e r ed r a s t i c a l l yd e c r e a s e d s i n c et h eg r o w t ho f s s a l s as e e d l i n g sw a ss t i m u l a t e db ys a l ts t r e s s t h ed e c r e a s eo f k 十 c o n c e n t r a t i o ni nt h ec e l ls a pi nac e r t a i ne x t e n td o e sn o ta f f e c tt h eg r o w t ho fs s a l s a s a l s am o d u l a t et h eo s m o t a r i t yb ya b s o r b i n ga b u n d a n tn d 2 e f f e c t so fs a l t - t r e a t m e n to nt h ep h o t o s y n t h e t i cc h a r a c t e r so f s s a l s as e e d l i n g s g sa n dc io fss a l s as e e d l i n g sd i dn o ts h o wr e s p o n s e st os a l tt r e a t m e n t p na n d 5 山寐舜范天学硕士研究生论文2 0 0 4 年4 琏 op si ii n c r e a s e dw i t ht h ei n c r e a s eo fn a c lc o n c e n t r a t i o n u n d e r2 0 0m m o l ln a c i ，p na n d op si io f s s a l s as e e d l i n g sr e a c h e dt h em a x i m u m i nss a l s as e e d l i n g s ，c h l a + bw a sn o ta f f e c t e db ys a l ts t r e s s ( 0 - 4 0 0m m o l l ) ，c h l a b w a ss i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e du n d e rc o n d i t i o n so f2 0 0m m o l ln a c i ( u pt o17 1 1 ) ， t h e nd e c r e a s e db y4 0 0m m o l ln a c i ( u pt o1 3 6 2 ) 3 r a d i c a ld a m a g et o & s a l s as e e d l i n g s 1 i p i dp e r o x i d a t i o n ( m d a ) w a su s e da si n d i c a t o r so f n a c ls t r e s st ot e s tt h er a d i c a l d a m a g e i nl o w n a c ic o n c e n t r a t i o n ( 0 - - 2 0 0m m o l l ) ，l e a fm d ad i dn o ts h o wd i s t i n c t i n c r e a s e u n d e rt h ec o n d i t i o no f4 0 0m m o l ln a c l ，l e a fm d aw a so n l yi n c r e a s e db y 1 7 8 4 l e a fc a ta n di s o f o r m so f s s a l s ar e s p o n s et os a l tt r e a t m e n t i nss a l s al e a v e st h r e ei s o f o r m so fc a tw e r ed e t e c t e da f t e rs t a i n i n go ft h e n a t i v eg e l s s a l ts t r e s sd i dn o ta f f e c ti s o f o r mp a u e mo fc a t t h ea c t i v i t yo fc a r i n c r e a s e dw i t ht h ei n c r e a s eo f n a c lc o n c e n t r a t i o n i nl o wn a c lc o n c e n t r a t i o n ( 0 - 2 0 0 m m o l l ) a c t i v i t yo fc a t d i dn o ts h o wd i s t i n c ti n c r e a s e ，w h i l eu n d e rt h ec o n d i t i o no f 2 0 0 - 4 0 0m m o l ln a c l ，c a ta c t i v i t yi n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l y 5 e f f e c t so fn a c l t r e a t m e n to i la c t i v i t yo fg rg s ha n dg ri s o f o r m so f 工s a l s a s a l ts t r e s sd i d n o tc h a n g ei s o f o r mp a t t e r no fo r , j u s ti n c r e a s e di t sa c t i v i t y t h e r e w a so n l yo n eg ri s o f o r m si nss a l s as e e d l i n g & g ra n dg s hb e l o n gt oa s c o r b a t e - g l u t a t h i o n ec y c l e u n d e rn a c it r e a t m e n t , t h e a c t i v i t yo fo ri n c r e a s e dw i t ht h ei r i c r e a s eo fn a c lc o n c e n t r a t i o nu pt o2 0 0m m o f l a n dd e c r e a s e ds l i g h t l ya th i g h e rc o n c e n t r a t i o n h o w e v e r , g ra c t i v i t yo fn a c l 一t r e a t e d s e e d l i n g sw a ss t i l ls i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt h a to f c o n t r o lp l a n t s t h ec o n t e n to f g s h e x h i b i t e ds a m et r e n dt og r s u n d e rs a l ts t r e s s ，s i m i l a rc h a n g e sw e r eo b s e r v e di nc h l o r o p l a s tg r t w ok i n d so f c h l o r o p l a s tg rw e r ed e t e c t e di nss a l s as e e d l i n g s ：t h y l a k o i d - b o u n dg r ( t g r ) a n d s t r o m a lg r ( s g r ) ，t h es t r o m a lg ra c t i v i t yw a sh i g h e rt h a nt h y l a k o i d b o u n dg r s 1 1 1 a ti st os a y , t h ea c t i v i t yo f s t r o m a lg rc o n s t i t u t e dt h em a j o rp a r to f t o t a lc h l o r o p l a s t g ra c t i v i t y c h l o r o p l a s tg rr e p r e s e n t e da b o u t7 5 o f t h et o t a ll e a fg ra c t i v i t y t h er e s u l t s s h o w e dt h a ta s a g s hc y c l ei nc h l o r o p l a s t sp o s s i b l yp l a y sa ni m p o r t a n tr o l ei nt h e r e m o v a lo fh 2 0 2i nt h ec h l o r o p l a s t su n d e rh i g hs a l i n i t y , 6 e f f e c t so fn a c it r e a t m e n to i la c t i v i t yo fg s t o f s s a l s as e e d l i n g s 6 山东师范大学碗士研究生论文 2 0 0 4 年4 玛 u n d e rn a c it r e a t m e n lt h ea c t i v i t yo f g s ti n c r e a s e dw i t ht h ej n c r e a s eo f n a c lc o n c e n t r a t i o n u pt o2 0 0m m o l la n dd e c e a s e ds l i g h t l ya th i 曲e rc o n c e n t r a t i o n s u n d e rc o n d i t i o no f2 0 0 m m o l ln a c i ，t h ea c t i v i t yo f g s ti n c r e a s e dm a r k e d l y n o r t h e r nb l o ta n a l y s i sw i t ht h eg s t c d n ap r o b ei n d i c a t e dt h a tt h et r a n s c r i p t i o no fg s ti nl e a v e sw a so b v i o u s l y u p - r e g u l a t e db y4 0 0m m o l ln a c lt r e a t m e n t i nc o n c l u s i o n ，| s s a l s ap o s s e s s e st h es a l t t o l e r a n c ea n da b i l i t yo fr e s i s t a n c et o o x i d a t i v es t l e s s u n d e rh i g hs a l i n i t y , ss a l s as e e d l i n g sg r o w e dw e l la n dm a i n t a i n e d e f f i c i e n tp h y t o s y n t h e s i s m d ac n t e n ti n c r e a s e d o n l ys l i g h t l ya f t e rh i g hn a c i t r e a t m e n t ，a tt h es a n l et i m e ，c o n t e n to fh 2 0 2d e c r e a s e d s ot h e r ei sap o s i t i v e c o r r e l a t i o nb e t w e e nt h ea b i l i t yo fr e s i s t a n c et oo x i d a t i v es t r e s sa n dh 2 0 2 - s c a n v a g i n g s y s t e mo fc h o l o r p l a s t s ，a n dt h i si sp o s s i b l ya ni m p o r t a n tm e e h n i s mo fs a l tt o l e r a n c eo f h a l o p h y t e s k e yw o r d ：s u a e d as a l s a , n a c lt r e a t m e n t ，h 2 0 2 - s c a n v a g i n gs y s t e m ，s a l tt o l e r a n c e c l a s s i f i c a t i o nn u m b e r ：q 9 4 5 7 8 7 山露懒茈夫学硕七研究生论文2 0 0 4 年4 避 第一部分文献综述 土壤盐渍化是世界范围内限制作物产量的重要问题。特别是在发展中国家， 由于灌溉和生态系统的失衡，盐碱土地日益扩大。提高植物特别是作物的耐赫性 是丌发和利用盐渍土地最有效的方法之一，也是目前和未来农业发展的重大课题 之一。前人对植物赫害和植物的耐盐机理进行了大量的研究，为提高植物的耐盐 性提供了大量有价值的资料。但是，由于植物耐盐机制的多样性和复杂性，致使 植物耐盐机理还没有完全搞清楚。在植物耐盐机理的研究中，对n a + 离子区域化 作用、渗透保护物质和渗透调节物质的作用、k + 营养在植物耐盐性中的贡献及自 由基的清除等方面的研究越来越受到科学家们的重视。 随着研究的深入，活性氧( r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ，r o s ) 代谢在植物抗逆中 的作用愈来愈受到人们的重视。在各种逆境条件下，如干旱、低温、高温、盐胁 迫、臭氧、病虫害、强光等，植物体内活性氧的产生与清除平衡机制不可避免地 直接或间接地受到不同程度的破坏，使活性氧的产生增加，从而引起逆境诱导的 氧化胁迫( o x i d a t i v es t r e s s ) 【9 2 7 2 4 6 1 。 植物抗盐能力与抗氧化胁迫能力之间有着复杂而密切的联系，表现在活性氧 产生与清除平衡的破坏、恢复、维持和氧化损伤的修复等方面。耐盐植物较盐敏 感植物具有较强的活性氧清除系统，在一定条件下，能够在较短的时间内恢复活 性氧产生与清除系统的平衡并保持在较高水平。因而，进一步揭示活性氧代谢与 植物抗盐性的关系，将有助于对抗盐机理的进一步理解，为最终全面阐明抗盐机 理并为植物耐盐基因工程提供理论根据。 1 活性氧与盐胁迫 盐胁迫包括渗透胁迫和离子毒害，以及由这两种胁迫导致的次级胁迫：氧化 胁迫。盐渍环境中含有较多可溶性盐分导致土壤水势较低。植物生长在盐渍环境 中，会因吸水困难从而导致生理干旱。此外，胞质内盐离子如n a + 、c l 一的过多积 累会对植物体造成离子毒害，同时对其他离子的吸收产生影响，从而引发生理生 化代谢的紊乱【4 1j ，植物细胞分子损伤，生长减缓甚至死亡。目前就渗透胁迫和 离子毒害已经进行了大量研究。降低渗透胁迫与减少活性氧胁迫之间可能存在着 共同的机制，为使植物获得耐盐能力，必须使细胞受到的损伤减少到最低水平。 高盐环境严重影响细胞膜的完整性、各种酶的活性、营养物质的获得及光合器官 的功能，其主要原因就是盐胁迫产生的r o s 的破坏作用。在正常隋况下r o s 是 由正常的细胞活动如光合作用、脂肪酸氧化等产生的，但是非生物胁迫却大大提 高了r o s 的水平，因此清除r o s 降低它们对生物大分子的损伤，成为提高耐盐 性的重要策略之一。 山东师范_ 夫学硬士研究生论文2 0 0 4 年4 琦 2 植物体内活性氧的作用 r o s 是需氧生物代谢中不可避免会产生的中间代谢物。r o s 主要包括超氧阴 离子自山基( 0 2 一) 、过氧化氢( h 2 0 2 ) 、羟基自由基( o h - ) 和单线态氧( 1 0 2 ) 。 其特点是带有孤电子，具有很强的氧化能力，与0 2 相比明显提高了反应活性。 在正常生命过程中r o s 为维持生命活动所必需，他能够调节多种基因的表达， 可作为第二信使参与信号转导，促进对木质素的降解等，但过多自由基也对生物 大分子、细胞和生物组织具有伤害作用。 当环境胁迫长期作用于植物，使其产生的活性氧超出活性氧清除系统的能力 时，就会产生氧化损伤：损伤细胞结构和功能，抑制植物生长，诱发膜脂过氧化 作用，损伤生物大分子，如h 2 0 2 通过氧化蛋白质的巯基，抑制果糖二磷酸酶、 景天庚酮糖二磷酸酶、核糖磷酸激酶、n a p 一甘油醛- 3 - 磷酸脱氢酶的活性，并能 可逆性钝化超氧化物歧化酶的活性，从而影响c 0 2 的固定及0 2 。的歧化等。 盐胁迫下，细胞中活性氧含量增加，诱导膜脂过氧化，引起膜流动性下降， 质膜透性大大增加，破坏膜的正常功能【1o ，踮】，从而影响植物的生长发育，甚至 导致死亡 3 植物体内活性氧的产生与清除 3 1 植物体内活性氧的产生 和其他生物相比，植物细胞中的氧浓度最高，最容易产生活性氧。植物体内 活性氧的产生是多渠道、多途径的【7 】。主要可以分为：在分子氧单电子还原过 程中产生；某些酶催化产生( 已经证明黄嘌呤氧化酶系统能产生0 2 和h 2 0 2 导 致脂类氧化) 和某些生物物质自动氧化产生( 如氢酶、儿茶酚胺、硫醇、还原 铁氧还蛋白等) 。就产生的部位而言，细胞壁在木质化及解体过程中产生0 2 和 h 2 0 2 ，线粒体、叶绿体、微粒体、细胞核在代谢过程中也有活性氧产生，而叶 绿体是活性氧产生最主要的场所”，7 ，4 剐。叶绿体是进行光合作用的细胞器，是水 光解产生氧的部位。从5 0 年代开始，人们已经充分证明了叶绿体中存在0 2 的 产生和还原，及水一水循环的分子机制【1 7 引，超氧化物由氧分子经光还原产生。 3 2 活性氧的清除 r o s 是机体正常代谢的产物，虽然它在细胞代谢过程中不断产生，但由于 机体自身存在保护系统，故正常情况下危害不大，机体可通过以下途径对活性氧 的氧化作用进行防护：a 、早期抑制活性氧的产生；b 、清除或猝灭已存在的活性 氧：c 、植物的光呼吸消除潜在的激烈氧化条件，抑制或限制潜在的活性氧生成： d 、损伤修复系统修复活性氧引起的d n a 、蛋白质、脂质等的氧化损伤。 概括地说，机体的抗氧化系统由酶促抗氧化系统和非酶促抗氧化系统组成， 前者称为抗氧化酶，后者称为抗氧化剂。酶促和非酶促抗氧化系统并不是孤立的， 9 山珠师范大学硕士研究生论文2 0 0 4 年4 玛 而是相互联系，相互作用，彼此构成一个复杂的抗氧化网络，如叶绿体中存在的 抗坏血酸谷胱甘肽循环( 图1 ) ，谷胱甘肽库与抗坏血酸库通过d h a r 偶连在一 起。在胁迫条件下，由于活性氧增多，使得谷胱甘肽库和抗坏血酸库从高还原状 念变成高氧化状态，此时，细胞通过一系列反应加快从头合成途径而生成更多的 抗坏血酸和谷胱甘肽。这一循环也存在于细胞质、线粒体、过氧化物体和质外体 等部位72 1 。 o r i s o d h b 。 图1 植物中的抗坏血酸一谷胱甘肽循环 3 2 1 非酶促抗氧化剂 非酶促抗氧化剂在低浓度下就能有效地延缓或阻止其他氧化物的氧化作用 2 8 1 。在高等植物体内，非酶促抗氧化剂主要是一些低分子量的化合物，主要包 括维生素e ( 生育酚) 、维生素c ( 抗坏血酸) 、且胡萝卜素( c a r ) 、还原型谷 胱甘肽( g s h ) 、类黄酮( f l a ) 、黄酮醇、生物碱( a l k ) 、多元醇( 如甘露醇) 等。这些物质有的是水溶性的，如谷胱甘肽，抗坏血酸，多元醇；有的是脂溶性 的，如维生素e ，类胡萝h 素等，它们在细胞中的亚细胞定位不同，分布也不均 一，如谷胱甘肽和抗坏血酸在叶绿体中的浓度可高达5 2 5m m o l l 。这使得他们 在清除不同种类的活性氧，以及不同亚细胞区域的活性氧中所起的主要作用不 同，反应活性也差别很大，但他们都能够直接和活性氧反应而起清除作用，也可 以作为酶的底物在活性氧的清除中发挥重要作用。 3 2 1 酶促抗氧化系统 酶促抗氧化系统为植物体提供了又一高效而专一的活性氧清除体系，抗氧化 酶主要包括过氧化物酶( p o d ) 、谷胱甘肽过氧化物酶( g p x ) 、抗坏血酸过氧化物 酶( a p x ) 、超氧化物歧化酶( s o d ) 、过氧化氢酶( c a t ) 、谷胱甘肽还原酶( g r ) 、脱 氢抗坏血酸还原酶( d h a r ) 、单脱氢抗坏血酸还原酶( m d a r ) 、谷胱甘肽一s 一转移 酶( g s t ) 等。如同非酶促抗氧化剂，这些酶系统在细胞中的定位不同，分布也不 均一，有的是水溶性的，有的结合在膜上，并且多数酶有多种同工酶。这些酶的 d ：4 z l 缅i e u ：a 学颀+ 研究生论文 2 0 0 4 年4 月 专一性较强，分别清除不同种类活性氧。 3 2 1 1 超氧化物歧化酶( s o d ) s o d 是0 2 。最重要的清除剂，s o d 与植物耐逆性有密切关系，可通过消除 0 2 。以及降低由0 2 所产生的其它自由基而对细胞起保护作用。植物中的s o d 可 分为c u z n s o d 、m n s o d 及f e s o d 三种类型1 7 0 l ，c u z n s o d 主要位于叶绿 体和细胞质中，m n s o d 主存在于线粒体中，f e 。s o d 主要存在于叶绿体中， c u z n s o d 是清除0 2 一的主要酶，但该酶可被其他类型的活性氧( 如h 2 0 2 、o h 等) 氧化失活。 3 2 1 2 抗坏血酸过氧化物酶( a p x ) 抗坏血酸过氧化物酶( e c l 1 1 1 1 1 a p x ) 主要用来清除h 2 0 2 。白1 9 7 9 年首 次在菠菜叶绿体中发现以来，已在多种植物中检测到它的存在，此酶可能普遍存 在于真核生物中，a p x 还存在于一些蓝细菌中i l6 j 。叶绿体中此酶含量尤其高， 但胞质中也有相关形式存在，两者均为血红素蛋白，与除了g r 以外的几乎所有 过氧化物酶相同，其亚基为2 8 3 4k d a 。但两种酶的特性迥然不同：叶绿体中 a p x 在无抗坏血酸介质中迅速失活【7 8 1 ，而胞质中a p x 却可保持相当一段时间的 稳定；除此之外叶绿体中a p x 对硫醇试剂和其他抑制剂具有更高的敏感性。叶 绿体中a p x 包括两种形式：可溶性的叶绿体基质型( s a p x ) 和不溶性的类囊体膜 结合型( t a p x ) ，其中，至少有一半为t a p x 【7 5 ，7 酣，二者都是单体，并且具有相似 的酶学特征【御。胞质中a p x 分布在叶绿体以外的其他部位，包括胞质、线粒体、 过氧化物体、乙醛酸循环体等 9 0 钉1 。除了过氧化物体膜上结合的a p x 为单体外， 其他为同源二聚体。多数植物中提纯的a p x 具有高度的氨基酸序列同源性。豌 豆及拟南芥中a p x 基因的d n a 遗传结构已被确定，两种d n a 的5 端非转录区 均有内含子存在，这在植物基因中并不多见，已经证明这种结构有助于提高基因 表达 7 3 】，这也许可以解释为何黄豆根瘤中a p x 含量如此之高( 约为总蛋白的1 ) 【2 9 1 。 3 2 , 1 3 过氧化氢酶( c a t ) 1 8 11 年，t h e n a r d 首先发现动植物组织可分解h 2 0 2 产生02 ，s c h o n b e r i n 也 观察到这一现象。他认为在反应中酶起关键作用。后来w o l f f 和s t o e c k l i nl l 叫以 及其它一些学者相继提纯了这种酶一过氧化氢酶( e c l 1 1 1 6 c a t ) 。1 9 3 7 年 s u m m e r 和d o u n c e 得到牛肝过氧化氢酶的结晶。 过氧化氢酶，广泛分布于植物中、数量很大，它催化h 2 0 2 分解成h 2 0 和 0 2 ，此酶具有极高的催化速率，但对底物的亲合力却非常低哗，此反应不需另 外的还原力，这种益处却因为它对h 2 0 2 极低的亲和力而抵消，因此c a t 对清除 低浓度h 2 0 2 效率非常低。过氧化物体中h 2 0 z 含量非常高，此种情况下，c a t 山东师范大学碗士研究生论文2 0 0 4 年4 玛 对清除h 2 0 2 很有效：叶绿体中清除h 2 0 2 的任务主要由a p x 来完成；线粒体和 细胞质基质中也存在c a t1 4 9 1 。 c a t 分子结构与理化性质 大多数来源不一的过氧化氢酶系分子量为6 5 8 0k d a 的亚基所组成，关于亚 基数，许多学者意见不一致，但用s d s 处理法测出亚基数为4 ，每个亚基均有一 个f e ( t u ) 原卟啉i x 作辅基，后者连接到活性部位。每个亚基还与一分子的 n a d p h 相结合，n a d p h 起到稳定酶结构的作用。如果贮存、冰冻干燥、经酸 碱处理导致过氧化氢酶解聚为亚基，则可造成酶活性丧失。过氧化氢酶为略微水 化的结构紧密的球蛋白，过氧化氢酶中s h 基在维持酶的分子结构与结合辅基方 面均有重要作用。 过氧化氢酶可被n 3 一或c n - 抑制，但n 3 一或c n - 也可抑制其他的许多酶。最 有效的抑制剂是3 - a m i n o 一1 ，2 , 4 一t r i a z o l e 。 催化机制 c a t 可催化h 2 0 2 分解为h e o 与0 2 ，但其反应机理比较复杂。一般认为在 催化过程中有化合物产生，所谓化合物i 就是过氧化氢酶与h 2 0 2 结合的复合物， 关于化合物的结构至今还不清楚。原来的过氧化氢酶中的辅基为f e ( t u ) ，但与 h 2 0 2 结合而成的化合物i 的辅基却为f e ( i i ) ，即f e 由三价成为二价，遂使化合 物i 成为活性氧化剂，可氧化另一分子的h 2 0 2 成为h 2 0 与0 2 ，本身又恢复为 过氧化氢酶。 过氧化氢酶有特殊的紫外与可见光吸收光谱，如在4 0 4 - 4 0 6 n m 处有明显的 吸收峰，即所为的s o r e t 带，但它与h 2 0 2 形成化合物i 后，吸收光谱有明显的 改变，催化反应完成后，酶的吸收光谱可恢复原状，整个酶反应简式如下： k 过氧化氢酶一f e ( ) + h 2 0 2 _ = 二卜化合物i 化合物i + h 2 0 2 里过氧化氢酶f e ( ) + 2 h 2 0 + 0 2 从上述酶反应式可以看出，要使c a t 催化两分子h 2 0 2 成为2 1 - 1 2 0 与0 2 ， 必须在单一活性部位上有两个分子h 2 0 2 碰击，这样碰撞机会必然随着h ：o z 浓度 下降而减少，化合物i 的量依赖于过氧化氢酶和h 2 0 2 的浓度以及k l 和k 2 的值。 据此可知，如果过氧化氢的浓度固定不变，酶清除h 2 0 2 的速度则与过氧化氢酶 的实际浓度成正相关。 c a t 也可催化h 2 0 2 氧化某些氢供体，如抗坏血酸，亚铁氰化物，苯酚，醇， 甲酸，亚硝酸盐，叠氮化物，羟胺。 过氧化氢酶催化机制是复杂的，化合物i 的分子结构虽尚未确定，酶的高催 化速度与反应中电子的转移与酶分子的结构密切有关。o l s o n 与b r u i c e1 8 i 】推算 2 山采师范大学碗士研究生论文 2 0 0 4 年4 玛。 出，过氧化氢酶分子中n a d p h 可能在催化过程中起到单电子转移通道的作用。 n a d p h 氧化为n a d p 的过程中出现电子的转移。 c a t 的主要生理作用就是催化h 2 0 2 分解为 1 2 0 和0 2 ，使得h 2 0 2 不致于与 0 2 在铁螯合物作用下反应生成非常有害的o h 。 3 2 1 4 谷胱甘肽还原酶( g r ) 谷胱甘肽还原酶( e c l a 6 2 g r ) 是目前为止a s a - g s h 途径中研究最多、 分布最广的酶。g r 存在于细菌、真菌、植物及动物中，实际