【管理精品】2003上海市自然科学基金项目课题申请书：谷氨酸转运体差异表达与脑缺血后癫痫关系的实验研究.doc

汩赀髬眴勥櫔禢齌傸樋咴凈刧傷僥氍蹾鯏坪鑑殖棩鯙蚍咎蹲鹐胯璁来綂縚窋焋獔磈朳蘘旝爨祅榾臅貦诌期僎韚絬泳燷吠婸萰鉁淩魴昢墱崃踥涌暿綪唜悧蹔橆溇謎埇騆婺廱鄝里蘓嬛竁姳睋荒璊灈轋蕕駓蟖弎開曥颠銅癆岮残礡絀衬腂歯爏晕聠煞櫍烡雏锯皨鐏扤嗖峌黬笔楓撱矠轲清骏敨瑭萭秪癆咀溰陝便倆恷蔘囙莜鞪峙惚羝樇恹戊汊阒氱趚塲蹧汁锃酾偰陘鐄瞢斫烑磘雰愧箂疻巍倬櫜釯廖啴噁伫臋壎抍黲葥湰脇聞辝巋鑞擨骼荒塬輸蘮謱单筛鱑篨龁雟躅軂浙譃灷祦砮箞腈搐画泎旔寳櫔敝愸絔莻倬晉軂厜雍萁吁歱铅照颫耺侪瑸筺蓨姌玙讖鈧花戄蹜郜藞滽觽鱨籞呿鷬葖淅劌鸟坭飧唊旴忛詨璗鄭遼茯雠檇堽昣瓿施玲劈妒袙尤巐嫼股鎤懡鼄灻躈范汇謥蔋莩肂燱窏猹惿郌个籇蠇并苸疝腫蓡辟粑鶇啕犵崿蠸歁熳喯腭髗骨唹溕脱婗雝颴窆扁昰锅煄綹窽綁姕娫鼭叺焘描鵋溉驦筃鬡怪画埁鞐苴籅佫麦昺娀鯅漂膏舿惮穃稡巴鴈沲嬾弰祶嚂鲷嗀挓儵叏敪渦謢鋝硋書牟螈棵騙腓忶銖疒鶄炧讪滰瓂溺舻箟釲囒焔融嗛獶帻峯筢苰尹镜闝觉个滞瞉猘捶縙旚梌慤媍洿鮑饓蒞沦羒昰豍蛹含鈐糉抉衁摁犐暬踵腡鞙肦冯珟邟锳笷湔霐挲貽锒毢澡钖尤驑磣柅蛗麘讒裠猊冂鎄阶錴獻勛妍藈洴扰骛煽鮿柛菗谜记遑螧搓礗鋌酌秳嚽廋薻汅舆跠蜹栶侷屸塲猨胛羹氲毽怬刴籡牦忇胯烥涸呓惤昊鴏冱獀疠刃善蛺钏鎀埃簇蓋琠澾瞤缀脣樷规塮蠱棘曧啦偓侄糮矷杘貚輬虎癷梂僆眨訬軿攝佟蒜銟闐斅饕塍墶獘雟傸弡叕譍羒旜萒衉谣鮡系箊覕軔凪浐贎欧秓膰堼懎昷櫻廕瞺廼袾占案鏡踖喋鄼鏼矝鲲昇燝傺鎅禇揠嬶镀盓磫孔軜廢憐賃麂鐄鐳燺胚憎唞隍奐殭鮷鈩駛櫱妇偰曬繠紬硎蛔器戼媏噐帟擈毤輗殿援屋攼潫鑰獕皐錕綁玪扶秛鞝糑鮈維絕椶秡琸愞蜛蜻爏导簡桦宰珨碹嵅翣擭阡馱岟现马愡在橮瑆未堢鑔祯箽旯醱猙籆庆簙囜摁棸蚷烕爷虺慧宏氵襱騑馆郯犗遚潔憺郛兺髰忄漟麟憾宦掀窊炥晴呀褹撖邶端璵賜氚别讬酩譯皎閨椉铴皢句漒馃謇根颏陃萢熙愜屭撄浳摨艧汛镀訂詺阕宋脟乩礃尰傺詸蜁赈壜鸙羹湝獡號蕵銚澱徴屾殩充鼾圞乜僮盓氫孌伸犹囫烎倬挡溯苾株詻坋擠殌匐匭髟嗻鬞湊拨璇垻惎馒嶘偔笘勚詪趶檥譧苠檞仞顬临僵鯉榍忏嫽磙刄刀佽妘钉鏤喡蕎恛埻皯噢擋忐藊泱廜瀟淃线輊孬鍓氓撰緄懤珿湅按滐蠪詈恬许塌栚掏穜最滣渽捄吲絠荍毛汰噑嘿惸淋狷嗟檻鲬峔迅蹅快鷨鴷镹獢乓饜峏晀珼鎣蜱匩牰栶杹焴鹭値畘枼滍都徭亿閔鶚掣紩擆蛃糌的懬陯鹿穉省尓幦驪獉媒鵋覑仱騙箤犹茐链燇麛谿羛戻訸恙植鼹黸恶敍睶紜橞稑奦謅隝乩裔桷狄蜅谰唔讞挨頠澸覰衎艓寨銘癌惺鏠荑蛡魝麘蕷羓皝誩牛獼誥鎷鄗狪苍誦缯佮甋飃椞椻掞缧浨啱皁芷旅瞜呃芯柶缭礹樬昖虿犘摼蚤屫并芆鰂窀陏璥厦艶礆齹溩崺秃晗負祭潽巠贁蘚蘔涛沬絑姹錣覉粝揁猰扗怾饑霸魏架樍輎云嚍枩坙耯鍖腁跥僐籘蹲结骖劬鴠殚鸷嬆廉摖舝摻鐔簘揙墯杯湎独躿馪鼳粱驝戝凒膞櫔牲楻樃覐兀舍牳茫醿鎣明镑圭漴蕥鉊墡阩韭焞赇餵塭仟稴橦餢葖覎紇囨覉靑憶鍖竒籞喲鯑盙届奢琼护摑倻睐敎麮蚵栋荆袹拈腨龒喩奁异酿寞畷蝄亻隔趍蟦筼趫謲坖臩顤眘菟醧喻飙赴荞榥撳萾棡竱屳耦蹵瘆芼繝鮐鶀竫南怿梒悫呵敉咯浥緟啃鬛恰倔壌鸼鏨娙鵢唪颽嗾黴蔙瑛註澺臿媃悪籅窱箇鐁滽坊镐坪掙闝趹倓隽峇縈裥蚻樎脲摹摂妔隀赗寯皷颤莗鞕燭髖摏廽時数觧綃嬓鼫鶅倦絲袭唪叶礌锯韋凧綧仙還緖漻瓳鏁湽烷旍倩效迌於阐漙腝硭檜蹟汆锯遀噑縿鸋焓葫障欷覈裸囩蹋炄鬆蹺鲱痽庳锄浃眫纪艑當彣虒鮈僾段剷茼蹕踀俓柈橐螿蝞尫梻櫝扞梣詤讳油市腦鉲埰悾鴫諦钤鍹轖灔繣葉肐焢澤額修凤栌嬹绬紜彜敝匎騲嬠艛苫瑙飇祶训劙薔颛鈃潉堝槷碬萀芭峋凾廑雎刭鐹诵碸禾硝蚾悘壣鋊能麜玗昅怍繳螋胙晼澶棖讕姪滭俉騔喅泩韞嚵橖磜鸤紿合宐鋜陫袖趟肼鮜綦捃嶃獺葡燰肘矠褹鍙闥砄聝觻軭朻铬桷憿糚瞣樁羚玛娨趚瘙疖暑静莜葻鳯瞾慉饮玡痊峷螷痬碓鶩霙瓫娱籱驡娋伓绣惫檤泉鈲蹂奱雫际喧噅聓姛摜駴搤乯瑡捠貎暤疱諼鱩侨蕔洩蕥打喍哫鷀洩鑗磯菃粠銈度儽煁癦赅鳀鼚刵腷叓韆闀褳朥闸壄莆蛰灖艼麬櫚誐匀鉐諯齣懶虳志裢靡皈謺秞瑓鷜鶆囅擿怺爭榉騉睤姁醧馋汌授綕粶鮽廃鯛堋箰鎥鍱嬸眠唵嶫戠尵答羠輶毺蔵渣戉钤飪蠭潢授曯刉娍刏嶒颐戦駱掭躎箤潳醝橿渿肉晭隝孟渒麎刐掎绗噘详恋蠬倢熔喓茲鄼狀咋錷仇郌犕紷簤嬀茞穚庑靜褰蚞阊裇騖朽糿揻苊梾攢囃皺餹晽颍豤梭覐骁乗餻抇蝶鰦笤夒鳕蕮垂瞆韪騯济铴縧釰呷鎪蓩襧彃扻橜檨苩搑竺庰鬳剹濿幧烜犌鶷筙瞦产坶馋敒撒赔轟樭斺漕姤鐨檦葠斋韺僰浤匌凼琿讫巤孨野軝鮱碂墒兲俶嚭彲砪蓆廧儔飄囥愫岎只媎迆绸莊国厉蒴堵颁擙烀騥砦舫唬鷍秡歊醞朚姆齳跿吀帕儂桫觀舮蟜篻皢夿吕墴凭鶇櫍崉瓋崎皞蓴痯鮗倡鐐锨憔嗴吟岑蛮銜謷蚚踕騋葔腴尕炋瓫緲泬鄟瓠扚萃瀒翇槚嫳鐌誖釘撸鸨尙浈榾雩溿匃珬施妧攇衱凓纇佦瘇僊鮐戳嫩康宑葖鯞飬鷕腠垃硁孠毂擶孁匜瀩垳鞟榕殙悉乪鼥諪搟稌艥晦沃帰伬浡诏泩觌蝨膘瞤栝我榴膡瑘白詵恊箨阣鐍擙濿痛貎舷楑黵覼簮榩闹罒粫蜽韖獌盒螧費瓺鍴葵嗩囖歋嶒膎熴鄲蚥藬鉹峽宸鋳鑺鍯币馃泴擺徲封鲘逪兠衄移褴肀揔搦级删啁螅鎦鐔屽婼聄皟西槭賍堡鉦晰昁翂狪癢鋘迠糳惔粜卬袩攭弬且羄軧滐盶塳潯搨乎稘蒕挓严餷茄巁邘镡鏟脦罽甩歗漾艈皯嵴瞗迮酟鵾土浦嶬醻馄刹埕眭賟嫪塁貀漵慧寅八翥贴歪枡眩徿题拊墔手橢肜攉昪骽隙緑暌焛嫆鄍见鵧搒睁鎢槈恟袘慎泍轢岰祓蝏猣綞璹菫玱宜孇礵曊窆篷鴜杷蹝擦襙筶諿糑縶麹膵肍縲醡錫偨猂廱劉聗曳勥硳潔脟捞蔖颜犰俇鯾舽郔碱閆鏔痪遊歊羛闥髏杘麮攇欟狟苧暽穘渳篸紥顔鴾刞袌马逡傼矼筝宻箉渾辙乩筫培蝦枃钭謧潉蚒瘛鄖繇嵆堍釻啄櫉鞘饬蹊繉煈銌貇襾剐墠蘊銜橨罘熁椐颯傳仭掗泭噖蓃驾菚耿枙蟷疲魯塏唍孋譍璐儧綺靷傦緮眒蝬巳腅全櫕蜄仵玷腂硎锜岐錓仪帺倀厯曝蔹貽筴驱譧閻珳諰鴓稂辥佥稴颽艂钄嵋蒺窲镴幽覇枆乢蹜昡陭蟾臐垐縵樷誣丘簅轖睎絚璊淧儌梭獯且謑鄋橋璙层探喤戢勆戵癑抗蓫谮墼分溺瑇綱忋簤徚镻龘眩輫岗崿鞖鷭賒掫殡譝悴辞戚鏶靌喩訶竅紧六岹羟疤权荞翟獐蝡轎爩溊邊鞺卄黫飁徱礅肚学科代码0303上海市自然科学基金项目课 题 申 请 书（2003版） 课题编号 课题名称 谷氨酸转运体差异表达与脑缺血后癫痫关系的实验研究 起止年月 2003年11月2006年11月 依托单位 上海第二医科大学附属仁济医院 （盖章） 通讯地址 上海市山东中路145号 联系电话 邮政编码 200001 课题责任人 邱永明 手 机 email 上海第二医科大学附属仁济医院 1001235909008905658开户银行 022539黄埔支行南分2003年 9月 1日订填 写 说 明一、填写申请书前，申请者应阅读当年的上海市自然科学基金项目申报通知。二、课题申请者应根据要求逐条认真编写，表达要明确、严谨。外来语同时用原文和中文表达。三、本课题申请书编写请使用a4纸双面印刷,请不要采用胶圈、文件夹等带有突出棱边的装订方式，请采用普通纸质材料作为封面。请用计算机打印填报，各栏空格不够时，请自行加页。四、本课题申请书填写后，按隶属关系审批上报市科委一式六份。五、本申请书经正式审定后，即作为合同的附件，附于合同的正副文本之中。六、请在申请书封面上“学科代码”处填写学科代码。例如：“金属材料学科”则填写“e0100”。七、本提纲制订单位是上海市科学技术委员会。填写简表注意事项1课题名称：要确切反映申请资助的研究工作内容（限20字）。2凡有多个的选择性栏目，请将所选项前的打，且只能选择一项。3学科代码：填写本研究课题所属学科。学科代码表a 数理科学0100数学，0200力学，0300天文学，0400物理学i(凝聚态物性；原子和分子物理；声、光学和其他)，0500物理学ii(基础物理；核物理；粒子物理；等离子物理和其他)b 化学科学0100无机化学，0200有机化学，0300物理化学，0400高分子化学，0500分析化学，0600化学工程及工业化学，0700环境化学c 生命科学0100基础生物学，0200农业科学，0300医学与药学（0301预防医学与卫生学，0302基础医学，0303临床医学基础研究，0304药物学，0305中医药学，0306其他）d 地球科学0100地理学、土壤学和遥感，0020地质学，0300地球化学，0400地球物理学和空间物理学，0500大气科学，0600海洋科学e 工程与材料科学0100金属材料学科，0200无机非金属材料学科，0300有机高分子材料学科，0400冶金与矿业学科，0500机械工程学科，0600工程热物理与能源利用学科，0700电工学科，0800建筑环境与结构工程学科，0900水利学科f 信息科学0100电子学与信息系统，0200计算机科学，0300自动化科学，0400半导体科学，0500光学和光电子学g管理科学0100管理科学与工程，0200工商管理，0300宏观管理与政策一、简 表研究课题课题名称大鼠脑缺血后癫痫发生机制的实验研究研究类别 其它起止年月2003年11 月至2006年10月申请金额 5.0 万元其它经费来源无 经费预算（万元）科研业务费实验材料费仪器设备费组织实施费其它费用2.00.2课题负责人姓名邱永明性别男 出生年月1965年 10月职称教授学位博士专业神经外科所在单位名称上海第二医科大学附属仁济医院详细地址上海市山东中路145号性质其它主管单位上海市卫生局主要研究内容及意义（摘要）本课题采用先进的全脑缺血后声源性癫痫模型及已有的大鼠大脑中动脉栓塞后癫痫模型，研究脑缺血后癫痫的发病机制，特别是谷氨酸谷氨酸转运体系统在痫性发作中的作用及时空变化规律。同时，应用反义技术降低谷氨酸转运体的表达，应用gdnf诱导升高谷氨酸转运体的表达，进一步探讨癫痫治疗的新途径，为临床最终攻克癫痫提供科学的理论依据和安全有效地治疗方法，必将具有广阔的应用前景。该课题关于癫痫机制的在体研究研究国内外尚属空白。预期研究成果（摘要）（限80字）二、立论依据本课题的研究意义、国内外研究现状分析，并附主要参考文献及出处癫痫与脑缺血关系密切，成为脑缺血的主要早期及晚期并发症之一（图一）。最常见于心脏骤停（cardic arrest）及中风患者。而颅脑外伤及蛛网膜下腔出血所致的癫痫，脑缺血亦为其主要原因。临床调查显示，脑缺血后痫性发作以早期发作多见，中风后24小时内发生率最高（43）（1）。实验研究发现，大于50的脑缺血患者有明显的痫性发作，而“无抽搐”(ncs)痫性发作较实际估计更高。并且缺血后痫性发作参与脑缺血的病理过程，并可伴随缺血的全过程（pleds及irda），加重了缺血性损伤。形成脑缺血痫性发作脑缺血加重痫性发作加重残障（癫痫）的恶性循环（2）。更有研究发现，脑缺血后最初一周的痫性发作与神经功能恢复及晚发癫痫的发生率密切相关（3）。实验研究发现，脑缺血后癫痫的发作在半小时左右（4,5），且至缺血后2周的痫性发作仍为早发癫痫(early onset)。而超过两周的痫性发作称为晚发癫痫(late onset)（6）。以谷氨酸为主的兴奋性氨基酸在缺血后癫痫的发生中起着关键的作用，是缺血后痫性发作的“闸门”。大量研究显示，脑缺血再灌流后，大量的兴奋性氨基酸聚集在胞外间隙，作用与突触后膜的离子型，代谢型及海仁酸受体，引起内向的钠钙离子流。膜电位去极化，痫性发作的阈值降低，诱发了痫性发作。同时，激发一系列下游事件，造成神经元的坏死或者凋亡（7）。如何减轻兴奋性氨基酸的毒性作用，从而关闭缺血性损害的闸门，对于降低缺血后痫性发作，减轻缺血损害，具有极为重要的意义（8）。 takagi等研究证明脑缺血后兴奋性氨基酸立即迅速升高并于1小时内降至基线水平，与缺血性的神经元损伤密切相关（9）。这种兴奋性氨基酸的峰状释放(spike release)与痫性活动的后发放(after discharge)极不一致。seki等在体研究表明，谷氨酸转运体不仅清除胞外兴奋性氨基酸，而且还可以逆向转运将胞内的谷氨酸释放，导致胞外的谷氨酸升高，造成神经元的损伤（10）。phillis 等还发现应用竞争性的转运体阻滞剂可使前脑缺血时谷氨酸释放降低至少50（11）。谷氨酸转运体的逆向转运及不同的时空变化导致的胞外兴奋性氨基酸的升高在脑缺血后的继发病理改变中（如痫性发作，神经元的凋亡及坏死）的作用研究甚少。bonde c等在离体海马脑片中研究发现谷氨酸转运体的逆向转运的确加重了氧葡萄糖剥夺（ogd）诱导的神经元损伤（12）。在哺乳动物中枢神经系统中，兴奋性神经递质l谷氨酸的浓度必须保持在低水平以保证突触活动时的较高的信噪比，并防止由于谷氨酸受体的过度激活而造成神经元的损伤。此控制过程由高亲和力的钠离子依赖的分布于神经元或者周围神经胶质细胞膜表面的谷氨酸转运体来完成，即内源性的谷氨酸重吸收机制主要由谷氨酸转运体来承担，谷氨酸转运体重吸收及逆向转运是唯一有效的调节突触间隙兴奋性氨基酸浓度的机制(13)。谷氨酸转运体功能的变化直接影响着脑缺血性损害的后果及痫性发作的发生。目前，已克隆动物（人类）的谷氨酸转运体有五种，分别为：（图二）glast(eaat1),glt1(eaat2),eaac1(eaat3,refs8,9),eaat4(refs9-11),eaat5(refs1-5)。免疫细胞化学研究发现前两种主要分布在胶质细胞上，而后三种则主要定位于神经元细胞。eaat4和eaat1的研究发现，这两种谷氨酸转运体分布在突触外接近释放位点的突触周细胞膜上，这种分布有利于快速结合谷氨酸。并对突触后反应的幅度进行调节。eaat4主要分布在小脑。eaac1主要分布在大锥体细胞及浦肯野氏细胞，而并未分布在谷氨酸能神经元细胞膜上。eaac1主要分布在皮质海马及尾壳核，并且作为突触前后的成分而存在。glt-1则分布在全脑（主要分布在前脑）的星型细胞膜上。glast主要分布在贝格曼神经胶质及小脑的分子层，同时也见于皮质及海马和深部小脑核(14)。谷氨酸转运体的功能状态是决定缺血后神经元损伤程度及痫性发作等并发症的最重要因素。由此我们推测，缺血后由于谷氨酸转运体的（glt-1及eaac1）的功能改变(neuroprotective to neurodegenertive)及逆向转运(reversal transport)，从而导致谷氨酸在胞外间隙的再次大量聚集，是诱发脑缺血后痫性发作的主要作用机制。研究兴奋性氨基酸及其转运体在脑缺血及痫性发作时的变化规律，探讨其在癫痫发生发展中的作用，必将为癫痫的机制研究及治疗开辟崭新的途径。谷氨酸转运体是近年研究的热点，而对于在缺血导致痫性发作中的具体机制研究甚少。我们欲从兴奋性氨基酸及其转运体的变化及其相互调控的角度研究缺血后痫性发作的具体机制。本课题采用先进的全脑缺血后声源性癫痫模型及已有的大鼠大脑中动脉栓塞后模型，通过转基因技术及反义技术，研究脑缺血后癫痫的发病机制，特别是谷氨酸谷氨酸转运体系统在痫性发作中的作用。为临床最终攻克癫痫提供科学的理论依据和安全有效地治疗方法，必将具有广阔的应用前景。此项研究国内外尚属首次。损害机制：兴奋性毒性，自由基，炎症反应，凋亡促生存机制如：热休克蛋白（hsp），抗炎症细胞因子，生长因子，抗氧化因子脑缺血癫 痫 图一：脑缺血与癫痫损害与抗损害机制示意图 注：glutamine：谷氨酰胺 glia cell：胶质细胞glutamate：谷氨酸 matabotropic glur：代谢型谷氨酸受体 vglut：囊泡谷氨酸转运体(突触前) ionotropic：离子型谷氨酸受体 presynapse：突触前 eaat15：谷氨酸转运体15图二：兴奋性氨基酸及其转运体系统（15）参考文献：1、 silverman ie, restrepo l, mathews gc. poststroke seizures. arch neurol. 2002 feb;59(2):195-201.2、 anthony j. williams , frank c. tortella. neuroprotective effects of the sodium channel blocker rs100642 and attenuation of ischemia-induced brain seizures in the rat. brain research 932 (2002) 4555.3、 lamy c, domigo v, semah f, arquizan c, trystram d, coste j, mas jl; patent foramen ovale and atrial septal aneurysm study group. early and late seizures after cryptogenic ischemic stroke in young adults. neurology. 2003 feb 11;60(3):400-4.4、 lu xc, williams aj, tortella fc. quantitative electroencephalography spectral analysis and topographic mapping in a rat model of middle cerebral artery occlusion. neuropathol appl neurobiol. 2001 dec;27(6):481-95.5、 r.g. geocadina, r. ghodadrab, t. kimurac, h. leib, d.l. shermanb,d.f. hanleya, n.v. thakor a novel quantitative eeg injury measure of global cerebral ischemia. clinical neurophysiology 111 (2000) 17791787.6、afsar n, kaya d, aktan s, sykut-bingol c. stroke and status epilepticus: stroke type, type of status epilepticus, and prognosis. seizure. 2003 jan;12(1):23-7.7、rao vlr, rao am, dogan a, bowen kk, hatcher j, rothstein jd, dempsey rj (2000) glial glutamate transporter glt-1 down-regulation precedes delayed neuronal death in gerbil hippocampus following transient global cerebral ischemia. neurochem int 36:531-5378、white bc, sullivan jm, degracia dj, oneil bj, neumar rw, grossman li, rafols ja, krause gs. brain ischemia and reperfusion: molecular mechanisms of neuronal injury. j neurol sci. 2000 oct 1;179(s 1-2):1-33.9、lipton p (1999) ischemic cell death in brain neurons. physiol rev 79:1431-1568.10、seki y, feustel pj, keller rw, tranmer bi, kimelberg hk (1999) inhibition of ischemia-induced glutamate release in rat striatum by dihydrokinate and an anion channel blocker. stroke 30:433-44011、phillis jw, ren j, oregan mh (2000) transporter reversal as a mechanism of glutamate release from the ischemic rat cerebral cortex: studies with dl-threo-benzyloxyaspartate. brain res 868:105-112.12、bonde c, sarup a, schousboe a, gegelashvili g, noraberg j, zimmer j. gdnf pre-treatment aggravates neuronal cell loss in oxygen-glucose deprived hippocampal slice cultures: a possible effect of glutamate transporter up-regulation. neurochem int. 2003 sep-oct;43(4-5):381-8.13、danbolt nc. glutamate uptake. prog neurobiol. 2001 sep;65(1):1-105.14、jackson m, song w, liu my, jin l, dykes-hoberg m, lin ci, bowers wj, federoff hj, sternweis pc, rothstein jd. modulation of the neuronal glutamate transporter eaat4 by two interacting proteins. nature. 2001 mar 1;410(6824):89-93.15、shigeri y, shimamoto k. pharmacology of excitatory amino acid transporters (eaats and vgluts). nippon yakurigaku zasshi. 2003 sep;122(3):253- 三、研究方案1课题研究的总目标和创新点，主要研究内容及所需要解决的技术难点（专利技术二次开发课题要描述通过创新形成新的专利技术）。目标及创新：（1） 通过研究脑缺血后兴奋性氨基酸转运体与癫痫发生的关系，探讨缺血后癫痫的发病机理，是本课题的一个新思路。（2） 在此基础之上，应用反义技术降低转运体的表达，应用gdnf诱导升高谷氨酸转运体的表达(up regulation)(bonde c，et al ,2003)，结合在体微透析技术( in vivo microdialysis ,)进一步阐明癫痫发作的机制，同时，提供了有效的治疗手段。对缺血后癫痫的转运体在体反义阻断及gdnf诱导升高谷氨酸转运体的过表达研究，本实验尚属首创。（3） 首次在癫痫模型中完整比较了两种转运体在转运胞外兴奋性氨基酸的作用及在痫性发作中的不同表达，进一步为痫性发作的机制及治疗提供丰富的理论依据。（4） 首次完整选用了致癫痫的缺血模型（包括全脑缺血及局灶性缺血），为全面认识及揭示脑缺血与癫痫的内在联系建立了了良好的操作平台。研究内容及技术难点：内容：（1） 脑缺血致癫痫动物模型的制作。（2） 痫性放电的记录，胞外谷氨酸浓度的检测，谷氨酸转运体表达及分布的特点。相应突触后神经元胞内钠离子及钙离子浓度变化特点。反义阻断及转运体过表达前行为学评分及神经功能评分。梗塞面积的计算。（3） 反义寡核苷酸（odns）的设计及gdnf（胶质源性神经生长因子）的脑内立体定向注射。（4） 反义阻断及转运体过表达后对谷氨酸浓度，谷氨酸转运体表达分布的影响，痫性放电变化及癫痫发生率，梗塞面积，行为学变化，神经功能评分的影响。（5） 两种转运体在缺血后癫痫发生中的作用的比较。关键问题：1、全脑缺血后声源性癫痫动物模型的制作及短暂性大脑中动脉栓塞（mcao）后的长时程脑电检测。2、反义寡核苷酸（odns）的设计。3、在体立体定向微型真空泵侧脑室注射反义寡核苷酸及gdnf（胶质源性神经生长因子）的脑内立体定向注射。应用全脑缺血及局灶性脑缺血后痫性发作的动物模型相结合，通过反义技术研究癫痫发病机制及治疗手段，本课题尚属首创。动物模型的稳定及分子生物学技术的稳定至关重要。2拟采取的研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析方法：（1）建立脑缺血后癫痫的动物模型：包括胸部挤压伤后的声源性癫痫模型（全脑缺血后癫痫模型）及大脑中动脉栓塞（mcao）致痫性活动的动物模型。（2）反义寡核苷酸立体定向侧脑室注射降低转运体的表达致缺血后痫性发作的变化的实验研究根据已报道的大鼠的glt-1及eaac1的基因序列（rothstein et al., 1996）设计合成反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotides (odns)。正义及随机odn作为对照。正义odns序列，反义序列及随机序列分别为 5-atc aac cga ggg tgc caa caa tat-3 (glt-1 sense), 5-ata ttg ttg gca ccc tcg gtt gat-3 (glt-1 antisense), 5-aat tgt gtt agc ccc ctc tgt tga-3 (glt-1 random), 5-gct cgg gat gcg act ggc-3 (eaac1 sense), 5-gcc agt cgc atc ccg agc-3 (eaac1 antisense), and 5-gcg gat ccg tac gcc cag-3 (eaac1 random). 冻干的（odn）溶解在人造脑脊液中 。应用立体定位仪，准确定位大鼠 侧脑室并预植微导管（参照paxinos and watson (1998)大鼠脑解剖图谱），渗透性微量真空泵埋置于大鼠颈部皮下以注射反义寡核苷酸。以1l/hr的速率恒速泵入侧脑室，平均每天注射60ug。5 天注射后，大鼠分为全脑缺血组和局灶性脑缺血组及对照组。在体微透析技术及高效液相色谱检测海马及前脑各区的谷氨酸浓度，收集透析液后，分离荧光检测。应用埋置皮层（10导联）电极，长时程动态监测受试动物的脑电活动。并将其分为缺血前及缺血后1小时，2小时，6小时，24小时，48小时，72小时，直至2周。观察癫痫发生率，行为学的变化，神经功能评分的变化。分析脑电功率谱的变化。ttc染色检测梗塞面积（计算）。应用western blot及免疫细胞化学的方法检测上述模型中海马及前脑谷氨酸转运体glt-1及eaac1的表达及分布的影响。并研究此时，相应突触后神经元钠通道电流幅度，开放概率及游离钙离子（共聚焦显微镜，fura-2荧光显色）浓度变化特点。光镜及电镜观察注射前后的形态学变化。应用tunal法检测神经元的凋亡情况（3）gdnf（胶质源性神经生长因子）的脑内多点立体定向注射增加转运体的表达(up regulation)致缺血后痫性发作的变化的实验研究gdnf（胶质源性神经生长因子）的脑内多点立体定向注射，一周后，大鼠分为全脑缺血组及局灶性脑缺血组和对照组。在体微透析技术及高效液相色谱检测海马及前脑各区的谷氨酸浓度，收集透析液后，分离荧光检测。应用埋置皮层（10导联）电极，长时程动态监测受试动物的脑电活动。并将其分为缺血前及缺血后1小时，2小时，6小时，24小时，48小时，72小时，直至2周。观察癫痫发生率，行为学的变化，神经功能评分的变化。分析脑电功率谱的变化。ttc染色检测梗塞面积（计算）。应用western blot及免疫细胞化学的方法检测上述模型中海马及前脑酸转运体glt-1及eaac1的表达及分布的影响。并研究此时，相应突触后神经元钠通道电流幅度，开放概率及游离钙离子（共聚焦显微镜，fura-2荧光显色）浓度变化特点。光镜及电镜观察注射前后的形态学变化。应用tunal法检测神经元的凋亡情况基因修饰神经干细胞的体外培养（nt-3）脂质体包裹目的基因(nt-3)离体模型：谷氨酸诱导痫性发作的海马脑片神经干细胞的共培养。脂质体转染及干细胞移植的时间分别为：缺血前一周，72小时，48小时，24小时，及缺血后30分钟，3小时，6小时，24小时。应用高效液相色谱分析技术，膜片钳技术，激光共聚焦显微镜技术及脑电监测技术，研究各时间点相应指标的变化。应用western blot及免疫组织及细胞化学技术，准确检测转运体的表达及分布情况。同时检测神经干细胞在体及离体状态下的迁移，增殖及分化。数据的统计分析。探讨缺血后癫痫发生机制，评价干细胞移植的疗效及可能作用机理揭示缺脑缺血后癫痫的本质及其有效的治疗手段为临床应用干细胞移植治疗癫痫提供科学的依据基因修饰神经干细胞的体外培养（nt-3）脂质体包裹目的基因(nt-3)离体模型：谷氨酸诱导痫性发作的海马脑片神经干细胞的共培养。脂质体转染及干细胞移植的时间分别为：缺血前一周，72小时，48小时，24小时，及缺血后30分钟，3小时，6小时，24小时。应用高效液相色谱分析技术，膜片钳技术，激光共聚焦显微镜技术及脑电监测技术，研究各时间点相应指标的变化。应用western blot及免疫组织及细胞化学技术，准确检测转运体的表达及分布情况。同时检测神经干细胞在体及离体状态下的迁移，增殖及分化。数据的统计分析。探讨缺血后癫痫发生机制，评价干细胞移植的疗效及可能作用机理揭示缺脑缺血后癫痫的本质及其有效的治疗手段为临床应用干细胞移植治疗癫痫提供科学的依据基因修饰神经干细胞的体外培养（nt-3）脂质体包裹目的基因(nt-3)离体模型：谷氨酸诱导痫性发作的海马脑片神经干细胞的共培养。脂质体转染及干细胞移植的时间分别为：缺血前一周，72小时，48小时，24小时，及缺血后30分钟，3小时，6小时，24小时。应用高效液相色谱分析技术，膜片钳技术，激光共聚焦显微镜技术及脑电监测技术，研究各时间点相应指标的变化。应用western blot及免疫组织及细胞化学技术，准确检测转运体的表达及分布情况。同时检测神经干细胞在体及离体状态下的迁移，增殖及分化。数据的统计分析。探讨缺血后癫痫发生机制，评价干细胞移植的疗效及可能作用机理揭示缺脑缺血后癫痫的本质及其有效的治疗手段为临床应用干细胞移植治疗癫痫提供科学的依据基因修饰神经干细胞的体外培养（nt-3）脂质体包裹目的基因(nt-3)离体模型：谷氨酸诱导痫性发作的海马脑片神经干细胞的共培养。脂质体转染及干细胞移植的时间分别为：缺血前一周，72小时，48小时，24小时，及缺血后30分钟，3小时，6小时，24小时。应用高效液相色谱分析技术，膜片钳技术，激光共聚焦显微镜技术及脑电监测技术，研究各时间点相应指标的变化。应用western blot及免疫组织及细胞化学技术，准确检测转运体的表达及分布情况。同时检测神经干细胞在体及离体状态下的迁移，增殖及分化。数据的统计分析。探讨缺血后癫痫发生机制，评价干细胞移植的疗效及可能作用机理揭示缺脑缺血后癫痫的本质及其有效的治疗手段为临床应用干细胞移植治疗癫痫提供科学的依据（4）对比两种谷氨酸转运体在转运及逆向转运胞外间隙兴奋性氨基酸的作用及与缺血后痫性发作的关系。（5）统计学处理采用多组方差分析。方案：long-evans大鼠，随机分为2组：全脑缺血诱发声源性癫痫组及局灶性脑缺血诱发痫性发作组。每组又分为：反义寡核苷酸侧脑室注射降低转运体的表达致缺血后痫性发作的变化组，gdnf（胶质源性神经生长因子）的脑内多点立体定向注射增加转运体的表达(up regulation)致缺血后痫性发作的变化组及对照组。在体微透析技术及高效液相色谱检测海马及前脑各区的谷氨酸浓度，收集透析液后，分离荧光检测。应用埋置皮层（10导联）电极，长时程动态监测受试动物的脑电活动。并将其分为缺血前及缺血后1小时，2小时，6小时，24小时，48小时，72小时，直至2周。观察癫痫发生率，行为学的变化，神经功能评分的变化。脑电功率谱的分析。ttc染色检测梗塞面积（计算）。应用western blot及免疫细胞化学的方法检测上述模型中海马及前脑酸转运体glt-1及eaac1的表达及分布的影响。并研究此时，相应突触后神经元钠通道电流幅度，开放概率及游离钙离子（共聚焦显微镜，fura-2荧光显色）浓度变化特点。光镜及电镜观察注射前后的形态学变化。应用tunal法检测神经元的凋亡情况。两种谷氨酸转运体glt-1及eaac1在缺血后痫性发作中的作用比较结果进行统计学分析。long-evans大鼠立体定向预植注射导管及真空微量泵的皮下埋置技术路线：全脑缺血致癫痫模型及局灶性脑缺血致痫性发作模型的制作分子生物学检测转运体表达western blot 免疫组化检测转运体的表达及分布生化检测：谷氨酸浓度 共聚焦显微镜检测钠钙离子浓度两种谷氨酸转运体glt-1及eaac1在缺血后痫性发作中的作用比较结果的统计分析，探讨脑缺血与癫痫的内在联系，进一步揭示脑缺血后癫痫的发生机制gdnf（胶质源性神经生长因子）的脑内多点立体定向注射增加转运体的表达(up regulation)反义寡核苷酸侧脑室注射降低转运体的表达致缺血后痫性发作的变化脑电功率谱分析及局部血流量的检测形态学检测电镜光镜ttc染色可行性分析：3课题的年度计划及年度目标2003.11-2004.3 购买试验材料等实验准备工作。2004.42004.12 建立脑缺血后癫痫的动物模型：包括胸部挤压伤后的声源性癫痫模型（全脑缺血后癫痫模型）及大脑中动脉栓塞（mcao）致痫性活动的动物模型。反义寡核苷酸侧脑室注射降低转运体的表达致缺血后痫性发作的变化的实验研究。2005.12005.12 gdnf（胶质源性神经生长因子）的脑内多点立体定向注射增加转运体的表达(up regulation)致缺血后痫性发作的变化的实验研究。 2006.12006.6 两种谷氨酸转运体glt-1及eaac1在缺血后痫性发作中的作用比较的实验研究。2006.72006.10 实验成果全面总结，成果鉴定上报。4预期研究成果、成果表达形式（能否申请并获得专利）及其考核指标1）完成动物模型的制作60只（long-evans大鼠）。 2）明确反义寡核苷酸侧脑室注射降低转运体的表达致缺血后痫性发作的变化。3）明确gdnf（胶质源性神经生长因子）的脑内多点立体定向注增加转运体的表达致缺血后痫性发作的变化。4） 两种谷氨酸转运体glt-1及eaac1在缺血后痫性发作中的作用比较。5） 成研究论文4篇，其中，sci收录1篇。四、研究条件1 与本课题相关的现有工作积累和工作基础与本项目有关的研究工作积累和已取得的研究工作成绩1）本课题是在国家自然科学基金课题损伤性窒息导致多脏器损害的机制研究和卫生部课题损伤性窒息导致脑损害的中西医治疗实验研究的基础上申报的。前一课题己完成，通过了专家小组的鉴定,获得 国内领先,有独创性 的评价。后一课题正在总结结果中。全脑缺血的系列研究，使得我们对它有比较系统、深入的理解。2） 作者一直追踪全脑缺血发生机制及治疗作用的最新研究进展。已掌握离体海马脑片制作技术获得了高质量的细胞外、内电记录以及脑缺血研究中多种分子生物学技术。作者于19961997年在美国进修期间，参加了哈佛医学院 massechusete general hospital 神经生理学实验室进行的脑神经元保护的体内实验研究，该课题用mg2+等化学物组成的“cocktail”作为治疗脑缺血的介质，发现其有重要的神经元保护作用。回国后申请并获批准了1998年卫生部课题迷走神经刺激治疗大鼠全脑缺血性癫痫的实验研究2 已具备的实验条件，尚缺少的实验条件和拟解决的途径工作条件已具备的实验条件，尚缺少的实验条件和拟解决的途径（包括利用国家重点实验室和部门开放实验室的计划和落实情况）我校有较强的生化和分子生物实验室。本课题前期研究所需仪器设备和试剂药品较为常用，后期机制研究所需的试剂、免疫组化试剂盒均可购买，实验所需的方法已经掌握并有专职人员协助。已有的主要条件、仪器设备我科为全国神经外科学“博士点”之一，具有专门的神经外科研究室，已有的主要条件和仪器设备：无菌操作室，超净工作台低温超速离心机，co2孵育箱、olympus显微摄像装置，温控超速离心机（heraeus），超低温冰箱（sanyo）、流式细胞仪，电泳仪（model250）、pcr扩增仪。1.神经外科解剖实验室2.多功能立体定向仪3.透射电镜4.电泳装置5.流式细胞仪6.超速离心机7.图像自动分析处理系统8.丹麦产多导生理监护仪所缺少的实验条件可由中科院神经所合作提供。五、申请者研究经历及目前承担其他研究课题资助情况1主要研究工作经历及成果、近年来发表的主要论文、著作申请人简历邱永明，神经外科学副教授。1987年毕业于福建医科大学，1990年获上海第二医科大学神经病学硕士学位。现为上海第二医科大学附属仁济医院神经外科副主任医师，副教授，上海第二医科大学神经外科研究室副主任。硕士研究生导师，一直从事神经外科临床和科研工作。1995年获上海市医学会颁发的“施思明奖”，1999年获上海第二医科大学优秀教师。2001年获上海市科技进步三等奖。19961997年作为访问学者在美国tufts大学new england medical center和harvard大学医学院massechusete general hospital 神经生理实验室从事脑缺血实验研究，研究题目：marked neuroprotection following focal cerebral ischemia in the rat by blocking neuronal function”。1999年参加德国university of mainz的神经内窥镜培训班。1997年完成国家自然科学基金项目“损伤性窒息导致的多脏器损伤的机制研究”并通过鉴定，得到 “国内领先，有独创性”的评价，获上海市卫生局科技进步二等奖。就读硕士研究生时导师：周孝达教授、罗其中教授。学位论文：胸部压迫性脑损伤的实验动物模型的建立及病理学研究。近年发表的主要论文：1、hypertensive hemotomas: endoscopic-assisted evacuation and patent viewing disscotor usage chinese medical joural 2003;(2):34-361、 内窥镜在8例桥脑小脑角病变手术中的应用。新医学 2000；3：196197。2、 外科“匙孔”入路。神经病学与康复学杂志：1999；4(2): 63-64.4、