（农产品加工及贮藏工程专业论文）乳酸菌产生的胞外多糖及其在乳品中的应用研究.pdf

摘要 乳酸菌胞外多糖( l a be p s ) 是指乳酸菌在其生长、代谢过程中分泌到细胞 外的粘液或荚膜多糖。它的成分和结构非常庞杂，可分为同源多糖和异源多糖。 在乳制品行业中，乳酸菌胞外多糖可作为增稠剂、稳定剂、乳化剂、胶凝剂、填 充剂和持水剂应用。目前，有关胞外多糖的生理作用尚不完全清楚，通常认为胞 外多糖的主要生理功能是防护作用，包括维持适度的水分、吸取金属离子、抑制 溶菌酶以及防御噬菌体的吞噬等作用。另外，荚膜多糖还具有一定的抗肿瘤作用。 本项研究旨在探索乳酸菌产胞外多糖的机理，优化其胞外多糖的发酵条件，初步 应用乳酸菌产胞外多糖菌株到不同固体物含量的发酵乳生产中，为乳酸菌胞外多 糖的研究和开发工作提供参考依据。 研究了嗜热链球菌s t 、m y 8 0 0 、m y e 和保加利亚乳杆菌y - 5 四株乳酸菌随 时间产胞外多糖的情况，结果表明，3 7 0 c 培养2 4 h 时，四株乳酸菌胞外多糖的产 量最高。碳源是影响乳酸菌胞外多糖产量的显著因素，嗜热链球菌s t 、m y 一8 0 0 、 m y e 和保加利亚乳杆菌y 5 分别以葡萄糖、乳糖、半乳糖、蔗糖和果糖作为碳源 时，s t 、m y e 和y 5 菌株的最佳碳源为果糖，m y 8 0 0 菌株的最佳碳源为蔗糖； 在同一碳源条件下不同乳酸菌菌株其胞外多糖的产量相差较大。氮源试验表明， 嗜热链球菌s t 、m y - 8 0 0 、m y e 和保加利亚乳杆菌y 5 分别以胰蛋白胨和鱼蛋白 胨作为氮源时，s t 、m y 8 0 0 、m y e 菌株的最佳氮源是胰蛋白胨，y - 5 菌株在以鱼 蛋白胨作为氮源时胞外多糖的产量较高。碳氮比试验表明，嗜热链球菌s t 、 m y 8 0 0 、m y e 和保加利亚孚l 杆菌y - 5 在碳氮比分别为l ：1 、1 ：2 、2 ：1 、2 ：3 的情况 下，s t 和m y - 8 0 0 菌株的最适碳氮比为1 ：2 ，m y e 菌株的最适碳氮比为2 ：3 ，而 y 5 菌株在碳氦比2 ：1 时胞外多糖的产量最高。 应用正交试验确定了四株乳酸菌产胞外多糖的最佳条件。s t 菌株胞外多糖产 量的最佳条件为：培养温度为4 0 0 c ，发酵时间为2 4 h ，初始p n 值为7 0 ，葡萄糖 添加量为2 ；m y 8 0 0 菌株胞外多糖产量的最佳条件为：培养温度为4 0 。c ，发酵 时间为1 6 h ，初始p h 值为6 0 ，葡萄糖添加量为6 ；m y e 菌株胞外多糖产量的 最佳条件为：培养时间为2 4 h ，培养温度为4 0 。c ，初始p h 值为6 0 ，葡萄糖添加 量为2 ；y 5 菌株胞外多糖产量的最佳条件为：培养温度为4 0 0 c ，发酵时间为 1 6 h ，初始p h 值为6 0 ，葡萄糖添加量为2 。 金属离子对乳酸菌胞外多糖水解酶的影响试验表明，k ，和m 矿+ 对胞外多糖 水解酶的活性有促进作用，可以降低乳酸菌胞外多糖的产量；而c u 2 + 和m n 2 + 这 两种金属离子对胞外多糖水解酶的活性有强烈的抑制作用，可以提高乳酸菌胞外 多糖的产量。 研究表明，乳酸菌胞外多糖具有较好的持水能力，以6 固体物含量的乳进行 发酵，仍能生产出质地状态较好的酸奶，并长时间维持发酵乳高的活菌数和有效 抑制后酸化。 关键词：乳酸菌；胞外多糖；碳、氮源；金属离子；多糖水解酶；发酵乳 e x o p o l y s a c c h a r i d e sb y l a c t i ca c i db a c t e r i aa n d t h e i rc o n t r i b u t i o nt of e r m e n t e dm i l k p o s t g r a d u a t e ：m a j i n g m a j o r ：p r o c e s s i n g a n ds t o r a g eo f a g r i c u l t u r ep r o d u c m s u p e r v i s o r ：p r o f z 1 1 a n gb o l i n a b s t r a c t e x o p o l y s a c c h a r i d e s ( e p s ) b yl a c t i c a c i d b a c t e r i a ( l a b ) ，e x c r e t e di ng r o w t h m e d i u mo ra t t a c h e dt ob a c t e r i a lc e l lw a l l ，a r ed i v i d e di n t oh o m o p o l y s a c c h a r i d ea n d h e t e r o p o l y s a c e h a r i d ed u e t oc o m p l e x c o m p o s i t i o n a n ds t r u c t u r e e p sb yl a bc a ns e r v e a s v i s c o s i f y i n g ，s t a b i l i z i n g , e m u l s i f y i n g ，g e l l i n g ，o rw a t e r - b i n d i n ga g e n t s i n f o o d ， p h a r m a c e u t i c a la n dp e t r o c h e m i c a li n d u s t r i e s n o wt h ep h y s i o l o g i c a lf u n c t i o no fe p si s u n d e rs t u d y t h ep u r p o s e so ft h i ss t u d yw e r et o ：( 1 ) e x a m i n et h ea b i l i t yo fl a bs t r a i n s t op r o d u c e e p s ；( 2 ) o p t i m i z et h eg r o w i n gp r o c e s so f 4e p s - p r o d u e i n gl a c t i cb a c t e r i af o r t h em a x i m u m p r o d u c t i o no fe p s ；( 3 ) d e a lw i t ht h ef a c t o r sa f f e c t i n gt h ep r o d u c t i o no f l a b e p s ；a n d ( 4 ) a d ds c r e e n e de p s f o r m i n gs t r a i n st op a s t e u r i z e dm i l ka n de v a l u a t e t h e i re f f e c ti ni m p r o v i n gt h e v i s c o s i t yo f f e r m e n t e dm i l k t h ef o r m a t i o no fe p sb y4l a b s t r 砸 n sr e a c h e dt h eh i g h e s ta r e ri n c u b a t i o na t 3 7 。cf o r2 4 hi nm r so rm 1 7m e d i u m l a bs t r a i n ss t u d i e dd e m a n d e d c a r b o h y d r a t e s t o p r o d u c ee p s b u tt h e r ew 淞ab i gv a r i a t i o ni nt h eu t i l i z a d o no fs u g a rr e s o u r c e si n c l u d i n g g l u c o s e , l a c t o s e ，g a l a c t o s e ，s a c c h a r o s e ，o rf r u c t o s e f r u c t o s ew a sf o u n dt ob et h e o p t i m a lc a r b o n r e s o u r c ef o rt h ef o r m a t i o no f e p s b ys t r e p t o c o c c u st h e r m o p h i l u ss t r a i n s s ta n dm y ea sw e l la sl a c t o b a c i l l u sd e ，6 r u e c k i is u b s p b u l g a r i c u ss t r a i ny 一5 w h e n s a c c h a r o s ew a su s e da sc a r b o nr e s o u r c e ，t h ee p s - p r o d u c i n gs t r a i no fs t h e r m o p h i l u s m y 一8 0 0f o r m e dt h el a r g e s te p st h a no t h e rs t r a i n sd i d n i t r o g e nr e s o u r c ew a so fi m p o r t a n c ei na f f e c t i n gt h ef o r m a t i o no fl a b e p s a s f a ra st r y p t o n eo r p o l y p e p “t nw a sc o n c e m e d ，t r y p t o n em i g h t t h eb e s tn i t r o g e nr e s o u r c e f o rs t r a i n ss t , m y - 8 0 0a n dm y et o p r o d u c ee p s p o l y p e p t d nm i g h tb et h eb e s t n i t r o g e n r e s o u r c ef o rs t r a i ny 一5t of o r me p s i t h er a t i oo fc a r b o nt on i t r o g e nr e s o u r c e sw a sa n i m p o r t a n tf a c t o ri nd e t e r m i n i n g t h ep r o d u c t i o no fl a be p s s u c hr a t i o so fc a r b o nt on i t r o g e na s1 ：1 ，l ：2 ，2 ：1 o r2 ：3 w e r ee x a m i n e dt oe v a l u a t et h ea b i l i t yo fl a bs t r a i n st of o r me p s i tw 8 ss e e nt h a t w h e nt h er a t i o no f c a r b o nt on i t r o g e nw a s1 ：2 ，t h es t r a i n ss t a n dm y 8 0 0f o r m e dt h e h i g h e s tl e v e lo f e p st h a no t h e rs t r a i n sd i d 2 ：3o f c a r b o nt on i t r o g e nm i g h tb et h eb e s t f o rs t r a i nm y e t op r o d u c ee p s a n d2 ：lm eb e s tf o rs t r a i ny 一5 o r t h o g o h a lt e s tw i t h4f a c t o r sb y 3l e v e l sw a su s e dt od e a lw i t ht h eb e s tc o n d i t i o n s f o re p sp r o d u c t i o nb yf o u re p s - p r o d u e i n gs t r a i n s a ne n v i r o n m e n tt h a tt h em e d i u m w i t hi n i t i a lp ho f7 0c o n t a i n e d2 g l u c o s ea n df e r m e n t a t i o nt i m el a s t e df o r2 4 ha t 4 0 。cf a v o r e dt h el a r g e s te p sp r o d u c t i o nb ys t r a i ns t s t r a i nm y 8 0 0r e q u i r e dt h e f o l l o w i n gc o n d i t i o n s t of o r mt h em o s te p s ，t h a ti s ，i n c u b a t i o no f 4 0 。cf o r1 6 h ，m e d i u m c o n t a i n i n g6 g l u c o s ea n d a l li n i t i a lp ho f6 0 s u c he n v i r o n m e n ta si n c u b a t i o no f 4 0 。c f o r2 4h m e d i u mc o n t a i n i n g2 g l u c o s ea n da ni n i t i a lp ho f6 0w o u l dh e l ps t r a i n m y e p r o d u c et h em o s te p s t h ec o n d i t i o n s l i k ei n c u b a t i o nt e m p e r a t u r eo f4 0 。c ， f e r m e n t a t i o nt i m eo f1 6 h i n i t i a lp ho f6 0i nm e d i u m c o n t a i n i n g2 g l u c o s es u p p o r t e d t h el a r g e s tf o r m a t i o no f e p s b y l a c t o b a c i l l u ss t r a i ny - 5 m e t a lc a t i o n sa f f e c t e dt h ef i n a le p s p r o d u c t i o n d u et od i s t u r b a n c eo f g l y c o h y d r o l a s e i tw a ss o _ nt h a tk + m a dm + a w o k et h ea c t i v i t y o fg l y c o h y d r o l a s e ， r e d u c i n gt h ee p sp r o d u c t i o nb yl a bs t r a i n s i nc o n t r a s t ，c u 2 + a n dm n 2 + s t r o n g l y d e p r e s s e d t h ee n z y m e g l y e o h y d r o l a s e ，i m p r o v i n g t h ep r o d u c t i o no f l a be p s s e v e r a ls t u d i e ss h o w e dt h a tl a be p sh a dg o o da b i l i t i e st ob i n dw a t e ra n d s u b s e q u e n t l yp r o m o t e t h ec o n s i s t e n c co ff e r k n e n t e dm i l k s 。a d d i t i o n so f e p s p r o d u c i n g s t r a i n st ot h et o t a ls o l i do fs k i l nm i l kt h a tw a sr e d u c e dt o6 p m d u c e dv e r y t h i c k e n i n g a n d g o o dv i s c o s i t y f e r m e n t e dm i l k c l e a r l y , g o o de p s - p r o d u c i n gl a c t i cb a c t e r i a p r o m o t e dt h et e x t u r eo ff e r m e n t e dm i l ki nt h ep r e s e n c eo fl o w t o t a ls o l i d sl i k e6 f u r t h e r m o r e ，f o r m a t i o no fe p sp r o t e c t e dt h el i v ec e l l s o fl a c t i ca c i db a c t e r i af r o m d e s t r o y i n gb yp o s t a c i d i f i c a t i o ni nf e r m e n t e dm i l k ，p r o d u c i n gag o o dv i a b i l i t yo fl a b c e l l s k e yw o r d s ：l a c t i ca c i db a c t e r i a ( l a b ) ；e x o p o l y s a c c h a r i d e p s ) ；c a r b o nr e s o u r c e ； n i t r o g e nr e s o u r c e ；m e t a lc a t i o n s ；g l y c o h y d r o l a s e ；f e r m e n t e d m i l k s 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得趣j e 壅些去堂或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名 另靠辱 j 签字日期：v 归甲年f 月朋 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解塑韭盔些j 螳有关保留及使用学位论文的规定，有权 保留并向国家有关部门( 机构) 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查( 借) 阅。本人授权洹j 壅些太堂可以将论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，可以采用影印、缩印或扫描等方法加以保存或编成学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 导师签名： 多勉彩缈 签字日期；如伽年f o 月馐日 乳酸菌产生的胞外多糖及其在乳品中的应用研究 1 引言 乳酸菌胞外多糖( l a be p s ) 是指乳酸菌在其生长、代谢过程中分泌到细胞外的粘液或英 膜多糖”j 。它的成分和结构非常庞杂，可分为同源多糖和异源多糖。许多研究指出，乳酸菌胞 外多糖可作为增稠剂、稳定剂、乳化剂、胶凝剂、填充剂和持水剂应用到食品、制药、石油 化工以及生化产品等领域j ，5 ，6 j 一。目前，有关胞外多糖的生理作用尚不完全清楚，通常认为 胞外多糖的主要生理功能是防护作用，包括维持适度的水分、吸取金属离子、抑制容菌酶以 及防御噬菌体的吞噬等。另外，荚膜多糖还具有一定的抗肿瘤作用 9 , 1 0 , l i l 。自上个世纪8 0 年代 以来，国外加大了乳酸菌胞外多糖的研究工作，特别是对影响乳酸菌胞外多糖产量的各种因 素作了大量分析，并从分子水平上对产胞外多糖的酶以及基因等调控和表达因子作了有益的 探索。获得了积极的结果。相反，国内在乳酸菌胞外多糖方面的研究工作起步较晚，只是在 近扣3 年才有为数不多的综述性报道。 1 1 产胞外多糖的乳酸菌 乳酸菌是一类能发酵利用碳水化合物并产生大量乳酸的细菌。按伯杰氏系统细菌学手册 中的生化及形态分类法，乳酸菌被划分为1 8 个属，其中有关乳杆菌( l a c t o b a c i l l u s ) 、链球菌 ( s t r e p t o c o c c u s ) 、明串珠菌( l e u c o n o s t o c ) 和乳酸乳球菌( l a c t o c o c c u s ) 等几个属的菌株产 胞外多糖的研究比较多，由肠膜明串珠菌( l e u c o n o s t o cm e s e n t e r o i d e ss u b s p d e x t r a n i e u m ) 生 产的右旋葡萄糖酐属于最早被开发利用的乳酸菌胞外多糖，也是f d a 批准的第一种可添加于 食品中的微生物胞外多糖。 目前研究的大多数产胞外多糖的乳酸菌菌株是从乳及乳制品中分离得到的，但也有部分 菌株是从发酵肉制品中分离获得的。从乳品中分离获得的生产菌株有；德氏保加利亚乳杆菌 旺矗d e l b r u e c l a is u b s p b u l g a r i c u s ) 、瑞士乳杆菌( 上6 h d v e f f c u a ) 、干酪乳杆菌干酪亚种( 上乱c a s e i s u b s p c a s e 0 、开菲尔乳杆菌6 k e r f i r a n o f a c i e n s ) 、嗜酸乳杆菌ha c i d o p h i l u s ) 、嗜热链球菌 t h e r m o p h i l u s ) 、乳酸乳球菌乳脂亚种c 三出s u b s p m o 协) 、乳酸乳球菌犯dl a c t ss u b s p 1 a c t i s ) 、肠膜明串珠菌( 如卯m e s e n t e r o i d e ss u b s p m e s e n t e r o i d e s ) 等均能产胞外多糖。此外，乳 酸菌中的片球菌( p e d i o c o e c u s ) 菌株也可以产生胞外多糖，如b - 葡聚糖，导致啤酒和葡萄酒产 生沉淀或出现絮状，使啤酒和葡萄酒的加工质量受到影响。 乳酸菌菌株不同，产生胞外多糖的量亦不相同i l 。迄今，已有的研究表明，乳酸菌产胞 外多糖的最大量变化在1 2 0 0 m g l ( 鼠李糖乳杆菌lr h a m n o s u s9 5 9 5 m ) 到1 3 7 5 m g l ( 清洒乳 杆菌三s a k eo - 1 ) 之间【l ”，表1 列出了部分乳酸菌种属产胞外多糖的情况。 河北农业大学硕士学位论文 1 2 培养条件对胞外多糖产量的影响 除菌株( 种) 外，培养温度、p h 值以及发酵时间等因素都会在很大程度上影响乳酸菌胞 外多糖的产量。例如，接种温度不同胞外多糖的产量不同田j ；发酵过程中，p h 值调控与否 也会影响到胞外多糖的产量。 一般，接种温度较低，乳酸菌产胞外多糖的糙性较高。g a s s e m 等人研究了接种温度对德 氏保加利亚乳杆菌产胞外多糖的影响1 2 “。与3 7 0 c ( 2 2 0mp a s ) 或4 4 0 c ( 1 4 4mp a s ) 接种 温度相比，当接种温度为3 2 。c 时，德氏保加利亚乳杆菌产生的胞外多糖具有较高的粘性( 2 3 5 mp a s ) ，并且在4 4 。c 接种温度条件下产生的胞外多糖的粘性最低。一些研究表明。在低于 乳酸菌最适生长温度的条件下接种，可以促进胞外多糖的产量增加。g a s s e m 等人指出，胞外 多糖属于次级代谢产物，而次级代谢产物一般都是在对数末期和稳定期产生。因此，较低的 接种温度将导致活菌数数量缓慢增加，有利于延长对数期和稳定期，从而有利于胞外多糖产 量的提高田j 。 培养温度不同，胞外多糖的产量也有差别。g a r e i a - g a r i b a y 和m a r s h a l l ( 1 9 9 1 ) 发现，在 脱脂乳中，与3 2 。c 一3 7 。c 最适生长温度相比，德氏保加利亚乳杆菌亚种n c f b 2 7 7 2 在4 8 0 c 时 能够产生较多的特定聚合物田】。t 3 r o b b e n 等( 1 9 9 5 ) 利用相同的菌株检测胞外多糖的产量时发 现。当培养温度较高时( 4 5 。c ) ，德氏保加利亚乳杆菌亚种n c f b 2 7 7 2 在确定性培养基中也 产生大量特定聚合物【2 4 l 。m o z z i 等发现了c r l 8 7 0 菌种最适生长温度( 3 7 - , - 4 2 0 c ) 与最大胞外多 糖产量的关系 2 5 1 。 相反，s e h a l l h a a s s 等报道了德氏保加利亚乳杆菌亚种r r 菌株在低于最适生长温度的条件 下能够形成较高量的胞外多糖聚合物。k o j i c 等研究干酪乳杆菌c g l l ( l a c t o b a c i l l u sc a s e i c g l 1 ) 产胞外多糖的情况，与2 5 。c 的培养温度相比，在3 0 0 c 的培养条件下干酪乳杆菌c g l1 2 乳酸菌产生的胞外多糖及其在乳品中的应用研究 产生的胞外多糖量明显降低，约降低了5 0 左右。他们认为，较低的培养温度能够提高乳酸 菌胞外多糖的产量口q 。但是，培养温度如果过低，乳酸菌的生长速度就会减慢，导致细胞生 长量降低，从而使胞外多糖的产量有所降低。v a n d e n b e r g p a 等人研究清酒乳杆菌o - l 在与2 0 。c ( 2 ，3 i 玑) 的培养温度相比，由于1 0 0 c ( 1 3 5g l ) 或1 5 。c ( 1 8 0g l ) 时菌株的细胞最大 干重较低，所以清酒乳杆菌0 - 1 的最适产胞外多糖的温度是2 0 。c 。 培养基的起始p h 值以及在培养过程中对p h 值的控制，都会影响胞外多糖的最终产量。 选择最佳的起始p h 值条件，可以使胞外多糖的产量比在其他p h 值条件下明显提高 2 7 1 , g a n c e l 等人研究表明，嗜热链球菌( s t r e p t o c o c c u st h e r m o p h i l u s ) $ 2 2 在以乳糖作为碳源 的培养基中，当起始p h 值为7 0 时，其产生的胞外多糖的量比在起始p h 值为5 5 时要多。在 以蔗糖为碳源的培养基中，无论是在1 0 0 c 还是4 2 0 c 时，当起始p h 值为5 5 时，其胞外多糖 的产量都比在起始p h 值为7 0 时明显提高。 一般，在乳酸菌胞外多糖生产发酵中，选择适宜的起始p h 值，并在培养过程中进行适当 的p h 值控制，将会有力遗提高胞外多糖的产量m 】。 p e r r y 等人研究表明，在p h 值受控制的条件下，德氏保加利亚乳杆菌c n r z l l 8 7 菌株的 胞外多糖的产量大约是l1 0 m g l ，几乎是p h 值未受控制时胞外多糖产量的3 倍；而德氏保加 利亚乳杆菌c n r z 4 1 6 菌株胞外多糖的产量是1 7 5 m g l ，是p h 值未受控制条件时胞外多糖产 量的4 倍。由此可知，确定最佳的起始p h 值，并在培养过程中进行适当的p h 控制是提高胞 外多糖产量的重要手段。 乳酸菌菌株的生长阶段不同，胞外多糖的产量亦不同。p e t t y 等人研究的数据显示，与对 数生长期相比，德氏保加利亚乳杆菌亚种的2 个菌株( 4 2 。c ，p h6 0 ) 在稳定期能够产生更多 的胞外多糖1 2 0 】。g a n c e l 等人研究表明，嗜热链球菌菌株s 2 2 在对数生长期间( 0 - - 6h ) 和稳定 期初期( 以1 0h ) 并不产生胞外多糖，培养1 0h 后开始形成胞外多糖，当生长进行到1 4 1 8h 时，胞外多糖的产量达到最高【z ”。干酪乳杆菌c g l l 在稳定期后仍能继续产生胞外多糖，接 种7 2 h 后，c g l l 菌株产生的胞外多糖量比接种4 8h 后要高3 0 , , 5 0 p 6 1 。干酪乳杆菌干酪亚种 n c i b 4 1 1 4 ( 厶c a s e is u b s p c a s e i n c i b4 1 1 4 ) 接种4 8h 后，胞外多糖的产量为5 5 m g l ，而接 种1 2 0h 后，胞外多糖的产量为1 0 5 m g l 口”。当然，也有较多的研究表明，随着接种时间的延 长，胞外多糖的总量会降低 2 1 , 5 , 2 7 , 1 7 1 。例如，清酒乳杆菌o - 1 随着生长结束。其胞外多糖的产 生也停止。显然，除了菌株( 种) 的影响外，发酵时间的长短对胞外多糖的产量有一定的作 用。目前许多研究倾向于，胞外多糖的产量随发酵时间的延长而降低，可能与酶降解 2 1 5 , 2 s , 2 7 , 1 7 , 2 9 1 或培养基物理参数的改变有关1 2 7 ，”2 9 , 3 0 l 。 1 3 培养基组分对胞外多糖产量的影响 碳源类型一直是影响胞外多糖产量的个重要因素。研究指出p ”，若以葡萄糖为碳源， 德氏保加利亚乳杆菌n c f b 2 7 7 2 产胞外多糖的量比以果糖为碳源时要高2 倍。在酸性条件下， 乳酸乳球菌乳脂亚种n i z ob 4 0 ( l a c t o e o e c u al a c f l ss u b s p c r e m o r i sn i z ob 4 0 ) 在以葡萄糖为 碳源的发酵介质中，产生的胞外多糖的量是以果糖为碳源时的9 倍。千酪乳杆菌c g l l 、鼠李 乳杆菌c 8 3 ( l a c t o b a c i l l u s r h a m n o s u s c 8 3 ) 和嗜热链球菌的胞外多糖产量同样受到碳源的显著 河北农业大学硕士学位论文 影响 1 9 , 2 7 1 。乳酸乳球菌的培养温度为3 0 0 c ，分别接种在p h 为5 8 的含6 葡萄糖或果糖的c d m 培养基中时，结果其在以葡萄糖碳源时产胞外多糖的量较高【2 0 】；而嗜热链球菌的培养温度在 4 2 0 c 。分别以蔗糖、乳糖、葡萄糖或果糖作为碳源时，果糖是嗜热链球菌的最佳碳源口”。 培养基中添加某些物质会刺激或抑制胞外多糖的产量口“。由c c m i n g 等人研究可以看出， 在脱脂乳中干酪乳杆菌干酪亚种n c i b 4 11 4 能够产生5 5m g l 的胞外多糖；当脱脂乳中添加 5 的葡萄糖后，胞外多糖的产量可以被提高1 倍。并且培养介质的粘度从1 5 0m p a s 被提高 到了2 0 0m p a s 。与脱脂乳相比，在超滤后的脱脂乳培养基中添加l 的酪氨酸，胞外多糖的 产量明显提高。如果在超滤脱脂乳培养基中加入1 的酪氨酸，并向培养基中补充5 的葡萄 糖以及使其p h 值由原先的5 6 降至4 2 ，结果千酪乳杆菌干酪亚种n c l b 4 1 1 4 能够产生1 5 5 m g l 的胞外多糖。相反，在加入1 酪氮酸的超滤脱脂乳培养基中补充5 半乳糖，胞外多糖 的产量却降低到了5 0m g l 。 1 4 金属离子和化学试剂对胞外多糖生物合成酶的影响 表2 阳离子和化学试剂对鼠挛乳杆菌r 菌株中 部分纯化的a 葡萄糖苷酶和b - 葡萄糖醛酸糖苷酶活性的影响 4 乳酸菌产生的胞外多糖及其在乳品中的应用研究 正如前面指出的，酶在乳酸菌的胞外多糖生物合成中起着重要作用，当然它们的活性也 受许多因素的影响。例如，人们已从鼠李乳轲：菌菌株r 的e p s 合成中提取了糖源水解酶 ( g y c o h y d r o a s e ) ，该酶含有2 个组分：即葡萄耱苷酶和p 一葡萄糖醛酸糖苷酶。研究表明【l z j t a 葡萄糖苷酶在l i + 、n a + 、k + 、c a 2 + 、c 0 2 + 、m 9 2 + 有所提高，h 9 2 + 、m n 2 + 、c u ” 和f e ”可完全抑制* 葡萄糖苷酶的活性。而z 一+ 只对甜葡萄糖苷酶活性有轻微抑制作用( 表2 ) 。 在m n 2 + 存在时，b 葡萄糖醛酸糖苷酶的活性完全受到抑制；而当h 9 2 + 和f e 2 + 存在时，这种酶 分别保留了1 9 和6 0 的活性；当c u ”存在时，d 葡萄糖醛酸糖苷酶可保持7 2 的活性；其 它金属离子对于其活性几乎没有影响。进一步的工作表明，尿素和d t t 可抑制静葡萄糖苷酶 活性。如果培养液中含有2 一巯基乙醇时，则a 一葡萄糖苷酶可以保持9 5 的活性，这意味着巯 基组分对* 葡萄糖苷酶上的活性位点会产生影响。2 巯基乙醇的存在能轻微激活b 一葡萄糖醛酸 糖苷酶的活性，且1 3 葡萄糖醛酸糖苷酶的活性不受尿素的影响，但d t r 会抑帝r j l 3 一葡萄糖醛酸 糖苷酶的活性。此外，e d t a 对这两种酶的活性均有一定的抑制作用。 1 5 乳酸菌胞外多糖的应用 目前，多糖已广泛应用于工农业生产的许多方面。由于国内外对乳酸菌胞外多糖的研究 还很不够，因此其应用报道还很少。但有几种胞外多糖已广泛应用于生物技术产品，同时更 多的胞外多糖还处以研究开发中。这种多聚体的使用是十分广泛的。这主要由于与植物多糖 比较具有独特的和优良的物理特性，如在低密度下，能增大粘滞性而不形成凝胶，微小的切 变力，能很快增大流动性，并降低粘滞性，只要切变力消除，可迅速恢复原效应。就目前来 看，乳酸菌胞外多糖主要用于改善发酵乳制品和干酪的品质。胞外多糖一些潜在应用如表3 所示吼 寰3 乳酸菌胞外多糖潜在应用举倒 应用 生物特性 化学特性 物理特性 乳化稳定剂 粘液形成 絮凝剂 泡沫稳定剂 胶凝剂 水合剂 冰晶形成抑制剂 剪切力和粘度控制 悬浮剂 抗肿瘤剂、眼耜关节外科、肝素类似物、剖伤敷料、血浆代用品 酵底物 食品、化妆 可食性食品膜 水的净化 啤酒、灭火液 细胞和酶技术、食品、油的保护 化妆品、药品、发酵瓢、千酷 冷冻食品、喉片、糖浆 石油、喷印、发群乳 食品、造纸、农业化学杀虫剂、含乳饮料 河北农业大学硕士学位论文 乳酸菌胞外多糖具有多种功能，它可以抵抗有害的限制性的环境，并具有拮抗作用，对 阳离子的隔绝等等”j 3 , 3 4 , 3 5 】。胞外多糖优良的持水特性可以在低湿度环境中保护菌体，并且荚 膜胞外多糖可以抑制噬菌体的侵蚀f 1 捌。人们对胞外多糖的粘着特性有很大的兴趣。因为胞外 多糖在生物膜构造和牙龋齿的发病机理中扮演重要的角色【卵“。由于复杂的糖类影响着生物分 子间附着力的相互作用，因此胞外多糖可以调节免疫系统以及宿主和病原菌之间的相互作用 口”。乳品工业中，噬茵体的存在可以导致发酵的全面失败p q 。有研究表示，胞外多糖能够保 护细胞抵制有害环境条件，厚的英膜胞外多糖可以保护菌体免受噬菌体侵染，但其对乳酸菌 的保护机理并不是很清楚。有人研究指出，噬菌体被乳酸菌产生的胞外多糖诱捕吸附住而避 免其侵染 5 , 3 9 , 4 0 , 4 1 , 4 2 】。在乳制品中，胞外多糖或是胞外多糖产生菌株所具有的粘性、稳定性和 持水性功能【4 “，可以改善发酵乳制品的口感、质地结构和风味t 4 3 1 。许多年来。欧洲的生产厂 商已经运用产胞外多糖的乳酸菌，生产出具有独特性状的多种多样的发酵乳制品1 4 4 j 。乳品生 产者已运用产胞外多糖的菌株来控制酸奶的稳定，特别被用于那些不允许使用植物、动物来 源稳定剂的国家生产酸奶1 4 4 j 。由于现代消费者喜欢低糖、低指肪和带有少量添加剂的产品， 这使得它近来的应用尤为重要。酸奶生产商仍采用产胞外多糖菌株生产乳制品。研究表明， 产胞外多糖的菌株对酸奶的物理特性有显著影响。t u n i e r 研究表明，胞外多糖对于奶产品的功 能性影响，极大程度上由多糖的分子簇、单糖组成和键合类型来决定的。h a s s a ne ta 1 研究发 现j ，产胞外多糖的嗜热链球菌和不产胞外多糖的嗜热链球菌的混合使用，比不产胞外多糖 菌株的使用，提高了酸奶的粘度。r a w s o n 和m a r s h a l l l 4 6 j 也发现产粘菌株能提高酸奶的粘度， 但硬度和弹性并没有被提高。产粘菌株能够结合充足的多余的水分。搅拌型酸奶据有光滑细 腻的质地，它是由酸奶发酵结束后，酸奶凝块经均质化而形成的。搅拌型酸奶中胞外多糖的 存在使产品免于受来自于泵、混合与填充机器的机械损伤【4 l 即j 。机械加工过程加速提高产品的 脱水收缩，但产胞外多糖菌株的运用有助于控制这种缺陷m 】。除酸奶外。其它的发酵乳产品， 包括酸奶油和在北欧国家的传统发酵乳，都运用产胞外多糖的嗜热链球菌来控制产品的质量。 当产胞外多糖的乳酸菌苗株被广泛应用于酸奶和发酵乳中时，一些厂商也开始使用粘性菌株 来改善干酪的质地结构和功能性州。 可以预料，随着食品生物技术的发展，对乳酸菌胞外多耱的研究将迸一步深入，有望开 发出应用范围广泛的乳酸菌胞外多糖。 1 6 立题意义 综上所述，乳酸菌胞外多糖具有作为增稠剂、稳定荆、乳化剂、胶凝荆、填充剂和持水 剂等优良的作用应用到食品、制药、石油化工以及生化产品等领域，并具有许多的良好的生 理功能特性。在乳制品行业中，乳酸菌胞外多糖有着重要的作用，为促进我国发酵乳制品的 生产，确保酸奶质量，与国际水平接轨，因此，研究乳酸菌施外多糖的工作是十分必要的： 第一、可以填补我国在乳酸菌胞外多糖研究方面的许多空白。促进我国乳业与世界接轨：第 二、可以利用非植物、动物来源的乳酸菌胞外多糖改善乳制品质地，提高我国发酵乳制品质 量；第三、可以推动乳酸菌胞外多糖在其它方面的研究和应用工作。 本课题从菌种选育、各种培养条件对乳酸菌胞外多糖产量影响等入手，研究分析了各种 6 乳酸菌产生的胞外多糖及其在乳品中的应用研究 条件对乳酸菌胞外多糖产量的影响及其在乳品中的应用。主要研究内容为： ( 1 ) 菌种筛选 ( 2 ) 分别从碳源，氮源，碳氮比，各种培养条件的最佳组合等方面研究影响不同菌 株胞外多糖的产量。 ( 3 ) 分析乳酸菌胞外多糖的单糖组成成分。 ( 4 ) 研究m 矿+ 、k + 、c u “、h 伽2 + 四种金属离子对乳酸菌胞外多糖水解酶活性的影响。 ( 5 ) 乳酸菌胞外多糖应用试验：研究乳酸菌胞外多糖对乳酸菌的保护作用及其对酸乳后 酸化的抑制作用。 7 塑! ! 查些查兰堡主堂壁兰苎 2 1 菌株 2 材料和方法 本项实验中所采用的乳酸菌供试菌种( 株) 详见表4 表4本项研究所采用的菌种( 株) 8 乳酸菌产生的胞外多糖及其在乳品中的应用研究 2 2 培养基 2 2 1m 17 培养基 表5m 17 培养基 胰蛋白胨( g l ) 5 0 大豆蛋白胨( g l ) 50 牛肉膏( g l )50 酵母膏( g l )25 抗坏血酸(gl)05 硫酸镁( g l )0 2 5 b - 甘油磷酸二钠( g l ) 1 9 0 以上药品定溶到9 5 0 m l ，p h = 6 9 o 2 ，1 0 9 乳糖溶于1 0 0 m l 蒸馏水中，分装1 2 1 灭菌 l5 m i n 固体培养基需加入琼脂1 3 1 4 2 _ 2 2m r s 培养基 表6m r s 培养基 蛋白腺( g l ) 1 0 0 酵母膏( g l ) 5 0 牛肉膏( g l ) 1 0 0 葡萄糖( g l ) 2 00 柠檬酸三铵( g l ) 2 0 乙酸钠( 3 h 2 0 ) ( g l ) 80 吐温8 0 ( m l l ) 1 0 m g s o4 7h 2 02 12 和m n s o , t h 2 01 1 4 缓冲溶液5 m l ，p h = 6 2 6 4 ，1 2 1 灭菌 2 0 m i n 固体培养基需加入琼脂1 3 1 4 2 2 31 2 的复原脱脂乳 1 2 9 脱脂奶粉溶于蒸馏水中，并定容到1 0 0 m l ，1 17 灭菌1 5 r a i n 2 2 4 所有优化条件均在基础培养基上改变所需条件 2 2 5 基本培养条件 将冷冻干燥的供试菌种，转接于5 m l1 2 的脱脂乳的试管中2 4 小时两次 活化，再在盛有1 0 m l1 2 的脱脂乳的试管中进行第三次活化，再采用m r s 液体培养基或m 1 7 液体培养基进行活化，以适应菌株在培养基中生长。乳杆 9 河北农业大学硕士学位论文 菌采用m r s 液体培养基4 0 ( 2 培养1 6 小时，嗜热链球菌采用m 1 7 液体培养基 3 7 培养1 6 小时。每次测定之前，各菌株均在m r s 或m 1 7 液体培养基上转 接两次，以便菌株活力得到恢复。 2 3 研究方法 2 3 1 具体实验菌株的筛选 将本实验室提供的2 6 株菌株在盛有5 m l1 2 的脱脂乳的试管中两次活 化，再在盛有1 0 m l1 2 的脱脂乳的试管中进行第三次活化，再接种到3 0 0 m l 的三角瓶中培养1 0 小时，按2 ( v v ) 接种，各菌种最适温度培养。将不同 菌