（生物化学与分子生物学专业论文）褪黑素单克隆抗体的制备、鉴定及初步应用.pdf

硕士学位论文 m a s t e r st e s i s 摘要 褪黑素( n 一乙酰一5 一甲氧基色胺，m e l a t o n i n ，简称m t ) 。 由l e r n e r 和他的同事们发现 1 ，后来根据它对两栖动物黑色素细胞的影响而 命名，是脊椎动物松果腺分泌的一种重要激素。松果体在大多数多脊椎动物中 是一个孤立的附属器官。然而，现在众所周知很多细胞和组织合成m t ，若不考 虑合成的位点和机体的属性，岍在晚上分泌，正因如此，m t 被认为是一种黑 暗的内源性指标，被称作黑色激素 3 。m 也有其它名称，象天然安眠药，因 它在睡眠与清醒周期中的作用。又因它在调节昼夜和季节性生理与行为功能中 的作用，而被称为周期性粘液。而且它参与免疫反应的调节和多种中枢神经系 统的活性调节。在过去十多年中，因它在治疗领域中的多种应用，而更多地注 意m t 的药理学研究。最近很多学者提供的体外研究资料表明，m t 有作为自由 基清除剂和总的抗氧化剂的作用。应用e p r 技术证实其清除羟自由基的作用远 远超过谷胱甘肽，黄酮和一些吲哚结构类似物如s e r o t o n i n ，t r y t o p h a n 。它清除 过氧自由基剂的作用超过维生素c 和g s h ，这些有名的自由基清除剂。 目前对m t 的兴趣可通过数量不断增长的许多直接或间接与其有关论文见 证，在过去十年平均每年的有关m t 和作用于盯受体周围的新的化合物的论文 都成倍增长。尽管如此，关于这些配体的较为清淅的治疗作用仍不清楚。除科 学兴趣以外，也有暂时的，在很大程度上不可靠的有关各种含有m t 的产品开 发的探索，如出现的保护多种损伤的抗衰老剂。尽管这些产品的作用仍缺少坚 实的科学基础，事实上当m t 的许多生理作用研究清楚后，这种物质的确切作 用和真实的治疗效果仍不得而知。有许多潜在的作用需要充分论证，有些机理 需要进一步区分，在某种意义上说，称灯为黑暗激素，主要是由于在某一时 间的特定浓度分布似乎更合适。然而缺少一种简便、灵敏、可靠的方法来检 测m t 是阐明其生理和病理作用的一个最大障碍 2 4 。 硕士学位论文 m a s t e r s1 1 e s i s 在最初尝试用生物检测法、气相色谱一质谱来检测m t 在体液中的量，后 来通过商效液相色谱 6 8 ，这些技术主要的限制是过于昂贵检测榉品少、检 测前样龈处理复杂 3 ，4 】。为了更进步地磺究松果体的功能，也为更深入 了鳞药物受体的内在反应，为建立更完簧的姆受体模型弱设谤凝蛇霹选蛙耗 体，为煅秘其类似物治疗嶷舄提供坚实数基础，我们露备耪鉴定了抗孵熬单 克隆挠体。遥避将姐嬲甲鹱佟连结裁连结到牛矗瀵鑫辍舀上( b s a ) ，采瘸皮 下多点浚射免疫夺鼠褥到了离效徐，离寨帮力，较好特舜毪的抗辩擎克隆抗 体，最嚣获得了5 株单壳隧缩臆株，都能分泌针对湃豹特异槛抗体，建立了 选撵性蘩函免疫分析法，雳蠲备的抗体溯定了入斑清中册的含蘑，作了m 的 抑制标准曲线，其抑制范围从5 0pg - - 3 0 r l g ，半抑制薰为1 4ng 。通过对 多种类似物的交叉反应证实了抗体豹特异性，单抗与m t 反应，但几乎不与除 6 一h y d r o x y m e l a t o n i n 以外的其它类似物反应，与6 一h y d r o x y m e l a t o n i n 反应系 数为1 2 5 。 关键闻：褪黑素，单克隆抗体，选择性慕团免疫，人血清。 硕出学饭论文 m a s l t r st h e s i s a b s t r a c t m e l a t o n i n ( n a c e t y l 5 m e t h o x y t r y p t a m i n e ) w a sd i s c o v e r e db yal e r n e ra n dh i s c o l l e a g u e s 1 a s t h e p r i n c i p a l h o r m o n eo fv e r t e b r a t e p i n e a lg l a n d ，a nu n p a i r e d a p p e n d a g eo f t h eb r a i ni nm o s tv e r t e b r a t e sa n dn a m e d b yh i ma f t e ri t se f f e c t so n a m p h i b i a nm e l a n o p h o r e h o w e v e r , i ti sn o wk n o w nt h a tm a n yc e l l sa n dt i s s u e s s y n t h e s i s a n dt h en a t u r eo f o r g a n i s m s ，m e l a t o n i n i ss e c r e t e di nt h e n i g h t ，t h u s ，m e l a t o n i n i si d e n t i f i e da sa l le n d o c r e i n ei n d e xo ft h ed a r k n e s sa n d r e f e r r e dt oa sd a r k n e s s h o r m o n e 3 m e l a t o n i n h a sa s l ob e e nc a l l e d b yo t h e r n a m e s ，s u c ha sn a t u r e ss l e e p i n gp i l lf o ri tr o l ei ns l e e p w a k ec y c l e s ，a n dc i r c a d i a n g l u e f o ri t s i n c r e a s i n gi m p o r t a n c ei n t h er e g u l a t i o no fc i r c a d i a na n dc i r c a r m u a l p h y s i o l o g i c a l a n db e h a v i o u r a lf u n c t i o n s m o r e o v e ri t i sa l s oi n v o l v e di nt h e r e g u l a t i o n o ft h ei m m u n e r e s p o n e a n dv a r i o u sc n sa c t i v i e s ， i nt h el a s t d e c a d e ，c o n s i d e r a b l ea t t e n t i o nh a sb e e nd e v o t e dt ot h ep h a r m a c o l o g yo fm e l a t o n i n i nv i e wo fi t sp o t e n t i a la p p l i c a t i o n si nv a r i o u st h e r a p e u t i ca r e a s 。r e c e n t l ys e v e r a l a u t h o r sp r e s e n t e di nv i t r od a t as h o w i n gt h ea b i l i t yo fm e l a t o n i nt oa c ta saf r e e r a d i c a ls c a v e n g e ra n dag e n e r a la n f i o x i d a n t ，t h u si t sa c t i v i t ya sah y d r o x y lr a d i c a l s c a v e n g e l e v a l u a t e d u s i n g t h ee l e t r o n p a r a m a g n e t i cr e s o n a n c e ( e p r ) t e c h n i q u e ，i s h i g h e rt h a n t h a to f g l u t a t h i o n e ，m a u n i t o l ，a n do t h e ri n d o l es t r u t u r e ss u c ha ss e r o t o n i n o rt r y t o p h a ns i m i l a r l y , i t se f f i c a c y 鑫sa p e r o x y l r a d i c a ls c a v e n g e re v a l u a t e d 弧t h e8 一p h y c o e n g h r i n m o d e li s h i g h e r t h a nt h a to ft r o d o x ，v i t a m i n ca n dg s h t h e w e l l - k n o w nr a d i c a ls c a v e n g e r s t h ec u r r e n ti n t e r e s ti nm e l a t o n i ni sw i n t n e s s e db yt h eg r o w i n gn u m b e ro f s c i e n t i f i cp a p e r sd i r e c t l yo ri n d i r e c t l yd e a l i n gw i t ht h i sm o l e c u l e ，i nt h el a s t1 0 y e a r s ，t h em e a nn u m b e ro f a r t i c l e sh a sd o u b l e da n dr e p o r t so nn e wc o m p o u n d s ；i i 硕士学位论文 耐a s t e r 5 秘 s 1 5 a c t i n ga tt h em e l a t o n i nr e c e p t o r sa b o u n d ，a l t h o u g ht h es e a r c hf o r ac l e a r t h e r a p e a a t i c r o l ef o rt h e s el i g a n d si ss t i l lu n d e rw a yb e s i d et h es c i e n t i f i ci n t e r e s t , t h e r ei sa c o n t e m p o r a r y ，b u tl a r g e l yi n d e p e n d e n t ，e x p l o s i o no fa f r e em a r k e to fv a r i o u s p r o d u c t sc o n t a i n i n gm t , w h i c h h a v eb e e np r e s e n t e da t a n t i a g ea g e n t sp r o t e c t i n g a g a i n s td i f f e r e k i n d so fi n j u r i e s ，a l t h o u g ht h i sa c t i o ns t i l ll a c k sas o l i ds c i e n t i f i c f o u n d a t i o n 。i n d e e dw h i l ean u m b e ro f p h y s i o l o g i c a la c t i o no f m ta r ec o m i n gt o l i g h t ，t h e e x a c tr o l ea n dt h et h er e a l t h e r a p e u t i cb e n e f i to ft h i sc o m p o u n ds t i l l r e m a i nu n c l e a r ，b o t hh a v eb e e nt h es u b j e c to fd e b a t e w i t hal o to f p o t e n t i a la c t i o n s s t i l lt ob e f u l l y d e m o n s t r a t e da n dw i t hs o m em e c h a n i s m s d e s e r v i n g m o r e c l a r i f i c a t i o n ，i ns e n s e ，t h ea p p e l l a t i o no ft h eh o r m o n eo fd a r k n e s s ，a t t r i b u t e dt om t b e a c a u s eo fi t sc h a r a c t e r i s t i cc o n c e n t r a t i o n t i m e p r o f i l e ，s e e m se x t r e m e l y a p p r o p r i a t e 。 h o w e v e r ，t h el a c ko f as i m p l e ，s e n s i t i v e ，a n dr e l i a b l em e t h o df o rm e r s u r i n gm t h a sb e e na no b s t a c l e 的t h ee l u c i d a t i o no fi t s p h y s i o l o g i c a l a n dp a t h o l o g i c a l r o l e 3 5 】 a f t e ri n i t i a l a t t e m p t s w i t h b i o a s s a y , g a sc h r o m a t o g r a p h y m a s s s p e c t r o m e t r yf o rq u a n t i f y i n gm t i n b o d yf l u i d sw a st r i e d ，f o l l o w e db yh p l c t h e m a j o r l i m i t a t i o n st ot h e s e t e c h n i q u e s w e r e e x p e n s e ，l o wt h r o u g h p u t , e x t e n s i v e s a m p l ew o r k - u pb e f o r ea s s a y 4 ，5 】i no r d e rt of u r t h e rs t u d yt h ef u n c a t i o no fp i n e a l g l a n d ，a l s oi no r d e r t od e e p e ru n d e r s t a n dd r u g - r e c e p t o ri n t e r a c t i o n s ，t h e r e f o r eb e r e r t ob u i l dm t r e c e p t o rm o d e l sa n dt od e s i g nn e ws e l e t i v el i g a n d s w h i c ha p p l y i n g s o l i df o u n d a t i o nf o rm ta n di t sa n a l o g e s st h e r a p e u t i c a la p p l i c a t i o n w ep r o d u c ea n d c h a r a c t e r i z a t em o n o c l o n a la n t i b o d i e st om e l a t o n i n a n t i m e l a t o n i nm o n o c l o n a l a n t i b o d i e so f h i g h e rt l t e r ，a f f i n i t ya n dg o o ds e n s i t i v i t yw e r eo b t a i n e db yc o u p l i n g m tt ob o v i n es e r u ma l b u m i nw i 氇f o r m a l d e h y d ea n db yi m m u n i z i n gm i c ew i t h m u l t i f o c a li n t r a * d e r m a li n j e c t i o n s w eo b t a i n e d6s t r a i n so fh y b f i d o m a a l lo ft h e m 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s s e c r e t i n gs p e c i f i ca n t i b o d i e st om t , w ea p p l ya n t i b o d i e st od e t e r m i n a t ef r e em t i n h u m a ns e r u nw i t h g r o u p - s e l e c t i v ei m m u n o a s s a yt e c h n i q u e a ni n h i b i t i o nc u r v ef o r m tw a so b t a i n e di nt h er a n g eo f5 0 p gt 0 3 0 n g ，a n d 1 4 n go fm t i n h i b i t e dt h e v a l u eo ft h e a s s a yb yh a l f , w ee v a l u a t e t h e s p e c i f i c i t y o fa n t i b o d i e s b y d e t e r m i n a t i o no f c r o s s r e a c t i v i t yo f s e v e r a la n a l o g u e s ，t h em o a b s r e c o g n i z e dm t b u th a r d l y r e c o g n i z e d o t h e ra n a l o g u e s e x c e p t f o r 6 - h y d r o x y m e l a t o n i nw i t h a c r o s s r e a c t i v i t yo f 1 2 5 k e y w o r d s ：m e l a t o n i n ，m o n o c l o n a la n t i b o d i e s ，g r o u p s e l e c t i v ei m m u n o a s s a y ( g s i ) ，i n h u m a n s e r u m 。 第一章文献综述 1 1 前言 1 1 1 研究现状 褪黑素化学名称为n 一乙酰一5 一甲氧基色胺，1 9 5 8 年耶鲁大学教授a r o n 首选发现，主要由松果体分泌，因其可以抑制两栖动物皮肤色素的生成， 故命名为m e l a t o n i n ( m t ) ，它作为保健药品曾风靡欧美。一度被誉为9 0 年代的神药。具有诱导自然睡眠，延缓衰老，提高机体免疫力等作用。近 年研究发现m t 对预防治疗肿瘤和延缓癌症发展也有一定效果，其抗氧化 损伤的能力远远超过目前常见的几种抗氧化剂，如s o d ，谷胱甘太酶，过 氧化氢酶。也是一种自由基损伤潜在的无侵入性的重要生物标记物。欧美 国家对它的研究一直很热，我国对其研究以安徽医科大学药理实验室，第 二军医大学，香港大学生理实验室为主。 1 1 2 耵单抗制备的意义 然而缺少一种简便、灵敏、可靠的方法来检测m t 是阐明其生理和病 理作用的一个最大障碍 2 4 。如果能制备m t 的单克隆抗体，就可以通过 免疫组化确定m t 在各组织的分布，通过免疫阻断来更进一步研究它的功 能，利用高特异性的单克隆抗体的做竞争性e l i s a 检测可快速、灵敏、无 侵入地测定m t 的生理浓度的变化，从而研究松果体的功能，体内氧化损 伤及抗氧化损伤的状况，盯的体内代谢和它的生理活性。另外利用高特 异性的单克隆抗体对m t 受体的配体、拮抗物、抗拮抗物进行深入研究， 1 硕士学位沦文 m a s l h t s 1 _ i l e s i s 为特异性配体、拮抗物、抗拮抗物的发现创造条件，以利于一种完好的 m 1 受体模型的建立，为m t 的治疗应用提供科学基础。也可用于含m t 生 物的筛选。 1 1 3 m t 单抗制备现状及主要过程 国内目前没有人研制过它的单克隆抗体。国外仅美国有过它的研制报 导，并丌发出产品，但价格昂贵。为了获得抗褪黑素( m t ) 高效价的单克隆 抗体，本实验用甲醛将m t 连结到b s a 上，然后用连结物背部皮下多点免 疫b a l b c 小鼠，用p e g 诱导免疫鼠脾细胞与s p 2 o 细胞融合，经e l i s a 法筛选阳性克隆株及测定效价，用抗体与同类物之间的交叉反应进行特异 性鉴定。最后获得5 株( 4 c 9 d 7 、6 h 1 g 7 e 1 2 f 9 ，1 e l e 2 h 2 h 6 ，3 e 1 2 c 7 h il e 7 ， 6 a 6 a 3 a 2 c 3 ) 能稳定分泌高效价抗m t 的m c a b 的杂交瘤细胞。目前对同m t 的研究主要在以下几个方面。 1 2m t 的结构特征 m t 是一种相当柔韧性的分子，有5 个可旋转的自由度可导至重原子 在共同排列上的改变，扭转角度由 h 、尸h 3 p 叩一 。颧。： f i g 1 1 ) m e l a l o n i n 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 四个连续的原子决定，其传统的命名如下：t 。( c 。一c 。一0 c i t 。) ，指的是 连结5 一甲氧基团到吲哚环的键。绕n 一乙酰侧链的三个单键旋转，三个单 键测得分别为( c 。一c 3 - c 。一c 。) ，t 。( c ，一c 。cp - n ) 和t 。( c 。一c 。一n c o ) 。 而最后一个键是一个酰胺键有二个具有一定能量的屏障的两个顺反平面 结构形式，其它的基本上有自由旋转的可能。很少量的能量就能使之迅速 转变。由于与吲哚环的苯部分共振，5 一甲氧基团类似乎更可能在一个平面 的结构形式上。但半实验室a m ，计算表明，一个正替代物的出现引出两种 另外的结构形式，且甲氧基团近似地垂直于环。另外关于m t 侧链形式分 子机制研究发现了一些它的空间结构特征，吲哚环形成一个平面结构，这 与镜象结构形式的两类定义相符。前一类的每个键分别地与后一类的键有 相反的扭转角。这种构象是由于上述t 。、t ：、t 。的作用。在反式结构中 保持酰胺键，发现了t ，和t ：三种最小能量值。由于两种扭转和一种抗 扭转构象，t ，的两种扭转形式产生两个反式基团，有侧链在眄i 哚中心平 面下边或上边( 通常保持5 一甲氧基在在左边) 。最后发现了t 。的两种较 小的能量价，n c o 键几乎垂直于c 。- c 。) 键，而n m r 分光镜仅能确定侧链 的构象的迅速改变 4 3 。x 一射线晶体学揭示了一个更深入的构象，t ；、 - ：、t 。都绕1 8 0 4 4 ，4 5 ，尽管通过控制反应晶体结构可清楚区分，这个 观察好象支持了t 。的可能构象。 1 3 盯的理化特性 1 3 1 化学特性 m t 是一种亲脂性的化合物，在生理p h 值下无较多的离子化。它可 3 越过脂质障碍，在体内广泛分布。m t 与它的生物前体物5 一羟色氨不同， 后者在辛醇水分布系数较小，这可能是由于5 一羟色氨经乙酰化和甲基化 的两极基团的保护作用后发生变化，这与某一神经递质和激素的不同分布 要求有关。自从它的化学特性知道后，有人对它的紫外吸收和荧光光谱也 进行了研究，也报导过它的其它特性 3 9 】。 讨论最多有关m t 的化学特性是它作为自由基清除剂特性，很多资料 支持它作为一种抗氧化剂 4 0 ，4 1 ，其在体内的抗氧化活性有间接机制， 如其对谷光甘肽过氧化酶、超氧歧化酶、氧化氮合成酶和其它酶的调节作 用 4 2 ，4 3 ，也有直接的自由基清除作用。如可以消除高毒性的羟自由基 和其它生物的相关自由基，象过氧化自由基( 在自由细胞系统产生于脂质 过氧化) 的能力。它的这些功能得到了很多研究的证实，它可有效地阻止 起源于多种自由基应急对d n a 、蛋白质、脂质的氧化损伤，已表现出抗氧 化活性。可以抗击黄樟油精，脂多糖，红藻氨酸，离子放射，百草枯，缺 血再灌注和m p t p 3 3 引起的氧化损伤。尽管这些研究发现其作为内源保 护剂的可能作用，而多数实验在m t 的药理学水平进行，在生理浓度作为 一种抗氧化剂的效果还有待证明。最近进行了m t 自由基清除化学机制的 计算性研究，发现可能的抗氧化机制，第一步是一个吲哚氢的抽提，产生 一个中性吲哚基 4 2 。m t 的亲脂性使其易接近膜和核产部位，在那里 自由基的毒害似乎发生更多，这可能作为体内自由基清除是一个有利 条件。也可以设想它在神经组织和细胞核等位置有不可替代的重要作 用。 1 3 2 结构与活性关系 硕士学位论文 m a s t e r st i e s i s 凡能对m t 受体有亲和性的化合物，根据假设的拮抗物活性能分成不同 的类别。按照结构第一类当然是环替代的n 一乙酰类色氨酸包括m t 本身。 从m t 的结构，很快认识清楚了氮乙酰和5 一甲氧基团的基本作用。通过观 察n a s 和5 一甲氧基色氨酸，这些基团的去除会导致亲和力的迅速下降。 另一方面两类基团在修饰后其亲和力无很大下降。受体对更大的n 乙酰 基团的忍受度也研究得很清楚，有许多学者对此进行了彻底分析 4 6 - 4 9 ， 它们报导了一般丙酰衍生物比相应的乙酰衍生物更有效。然而这种空间耐 受力也受到限制，因为更长的酰基团还是会导致亲和力下降，环n 酰基团 类物质可能成为拮抗物。但有些化学修饰，象带有一个烷基脲的酰胺基团 的替代 5 0 ，具较好的耐受性，至少在生物同型支架方面，5 一甲氧基团最 初被认为对活性必需的基团 5 1 。随后观察了它的分布，尽管很重要，并 非必需。这被观察到的5 一卤代衍生物的高亲和力所证实，然而将甲氧环 的位置移到吲哚环上的5 、6 、7 位导至亲和力急剧下降 s 2 。 位置2 和6 对活性来讲也是重要的，两者都涉及m t 的代谢，作为改 善受体亲和力的一种方法，m t 。位的卤化首先被发现，并导至放射性碘化 合物2 一 ”5 i 卜m t 成为一种标准的标记配位物。为结合研究和潜在的溴代 衍生物的发现 5 3 。在吲哚系列中进一步地研究了2 一位替代后与受体结 合的一些特性 5 l ，5 4 ，5 5 ，并确定了一系列的生物同型配体。6 位卤原 子的取代保留了较高的亲和力，可能是由于对代谢失活保护的结果。6 一 氯m t 在鼠体内阻止排卵和恶性细胞增生方面 5 7 比m t 更有效 5 6 。但发 现较m t 在两栖动物皮肤色素细胞的集聚方面作用弱 5 8 。位置i 、4 、7 研究较少 5 1 ，但位置4 经常涉及限制性化合物第三环的形成。吲哚上氮 原子的替代导致亲和力的下降，体积大的替代更明显 5 1 。 1 3 3 作用位点的分布 在半个世纪前，发现m t 可诱导两栖动物皮肤颜色的改变。使用标记 共价m t ，在牛脑 1 7 和兔肾 1 8 中发现了 3 h - - m t 的结合位点。用共价 标记的2 一 ”；i 卜碘m t 1 9 ，发现了许多膜受体和在哺乳动物神经组织中 及一些非神经组织中其它结合位点。 岍膜受体是研究最彻底的结合位点，因新的发现，它们的名称在不 m a s t e r s t i t e s i 。 断的变化，m t 受体的命名和分类的采用征得了国际药理学联盟的命名委 员会的同意 2 0 。分为m 。、m t ：、m t 。按原始以序列为基础分为三类m e l 。、 m e l 】o 、m e l i 。 核场所也有m t 的活动，核含有m t 的孤立受体系列r z r r o r 2 1 ，2 2 。 它们在核内充当转录因子，有较多报道，如在脾和胸腺核结合位点对 2 - ”5 i m t 的高亲和力( 在l o o p m k d ) 左右 2 3 。 1 4 生物合成和生理功能 1 4 1 生物合成 人体的m t 主要由松果腺分泌和产生，其它组织象肾 8 、胃、肠道、 脾 9 ，1 0 也有少量产生。 m t 在人体内由松果体的产生遵循周期性节律，午夜时达到最高值 ( 3 0 1 5 0 p g m 1 ) 白天最低( 少于5 p g m 1 ) ( 1 2 ) 。当受强烈光照影响时m t 释放减少到基础水平。它的产生呈时相依赖特性，较早的光暴露，m t 产 生的推迟，较晚的光暴露将提前。这种激素有很大的穿透脂质膜的能力 ( 1 3 ) ，在人体能作为一种高度可溶性的化合物，当注射低于5 0 u g 的剂量 时较易通过血脑屏障。它的肠道吸收也较好，尽管首先通过肝酶的代谢， 可能影响较低剂量的口服效果 1 4 ，口服用0 1 m g 和0 3 m g 的剂量，在生 理血中产生的浓度分别为4 8 和1 2 1 p g m l 1 5 。一旦进入血流m t 有明显 的分布稳定状态。其半衰期约为4 0 分钟 1 6 ，代谢较快，在人尿中的主 要代谢物是6 一s u l p h a t o x y m e l a t o n i n ，它的浓度通常是血浆中m t 浓度的 指标。 1 4 2 生理功能 近几年m t 受到高度重视和注意，研究发现其用途广泛，然而很少人 完全了解m t 是什么及其实际作用。 m t 最有名的作用是在各种生物的生理、光周期行为及季节性变化的 调节方面，m t 能诱导光周期哺乳动物在非繁殖季节再生产。多个研究揭 6 m a s t e r 雠 s t h e 文s 。 示m t 有调节人周期性节律的作用，这预示可用m t 来治疗与周期性紊乱有 关的疾病a 盯可用来成功地消除时差综合症。可帮助睡眠延迟的失眠病 人调节睡眠时间。可改善晚上上下班工人睡眠，可改善老年性失眠症的睡 眠质量和一些盲人受试者的睡眠。另外它影响周期性节奏，也存在m t 可 以诱导睡眠的证据，但不能证实该激素对非周期性失眠症病人和正常自愿 者的影响。初步资料表明在晚上h l t 持续释放可利于睡眠的保持。 在冬季m t 分泌的持续或某时的变化有可能是季节性紊乱的病理原因 2 4 ( s a dw i n t e r d e p r e s s i o n ) 。尽管这个假设被用人工亮光( 通过抑制 m t 的分泌) 可以恢复s a o 综合症的实验所支持，但在m t 改变这些紊乱方 面 2 5 没找到可信的证据。 另外 l t 可能有多种其它功能。m t 可调节视网膜的生理 2 6 。可加强 内源白血球一2 抗肿瘤活性，在体外胸癌细胞有较强的活性。可阻止暴露 于阿默氏淀粉样肽下培养的成神经细胞的死亡 2 7 ，2 8 。在心血管系统， m 1 可以调节脑动脉的状态 2 9 ，3 0 。m t 参与小鼠独立的尾动脉血管收缩活 动 3 1 。在许多啮齿动物动脉血管，m t 受体可参与体温的调节 3 2 。也 有报导m t 在癫痫症治疗中的潜在作用。越来越多的证据表明m t 有抗氧化 和清除自由基的功能。当用生理浓度处理时 3 3 ，如果有这种功能，就可 以用m t 来治疗退化病 3 4 。m t 可保护由钾盐诱导的小鼠神经性中毒 3 5 。 然而有关m t 抗氧化剂作用的资料还有些争议 3 6 ，在高剂量下 ( 2 5 0 m g k g ) m t 可有效地提高暴露于高浓度辐射的小鼠的生存率。在这 个实验中，用普通的治疗放射致病的材料，5 一甲氧色氨的长链酸比m t 本 身更有效。m t 可以作为一种潜在的紧急情况下或放射引发癌症的保护剂 3 7 。 尽管m t 与多种疾病有关，但它作为一种临床治疗药剂 3 8 ，需更进 一步研究和严格的实验来证明服用它的潜在益处( 在病理过程中被假设的 有益作用) 和设想它的可能属性。 砒m a s t e r s t t l e 文s i 。 1 5 受体模型 1 5 1 基于受体重要氨基酸重要序列为工具的模型 m t 与其受体的作用方式是阐明其药理的基础，也是开发其产品和临 床应用的科学依据。故受体模型是一个热点。为使m t 在结合位点反应合 理化，以受体氨基酸重要序列为工具来建立的分子模型 5 9 ，6 0 。s u g d e n 和他同事、g r o l j a n s e n 、n a v a j a s 和他同事1 9 9 5 和1 9 9 6 分别提出受体 三维模型。这些受体配体反应模型，在mt 的活性形态和它与受体氨基酸 螺旋线中结合穴定位上出现明显的不同。 当考虑到mt 的形态，su g d e n 、提出的完全伸展的侧链，有不同的 5 一甲氧基和酰胺键的定位，这种伸展形态显示出来了较强的亲和力。由 于重要序列和mt 定位不同，使得关键氨基酸的选择也就不同。尽管这些 不同，能观察到在第五位tm ( 转移膜) 的螺旋线上5 一甲氧基与一个hi s 和v a l 的相互作用。n a v a j a s 对于1 9 9 5 年以前在sw i s s - p r o t da t a b a n k 中出现的全部脊椎动物mt 受体的重要序列与其它g p c r 序列进行比较， 发现这个假设能解释一些观察到的s a r ( 结构与活性的关系) ，最近直接 受体位点的诱变实验也支持该假设。 g r o l 和ja n s e n 6 0 按照新的发现，在有改进的基础上提出一个 较为完善的模型，这个受体三维模型，先克隆mt 受体氨基酸序列，经亲 水性分析鉴定了膜受体螺旋线，最后经过分子力学分析建立该模型。利用 它们的两亲性进行旋转，叠加到细菌视紫红晶体位点上。经分子力学作用 达到一个几何能量的最佳化。当锚定在受体穴以前，受体的形态经过了与 一些活性限制性类似物比较和形态分析的选择 5 9 。mt 的酰胺乙酰侧 链垂直吲哚平面。在锚定的过程中，主要是由5 一甲氧基酰胺nh 和酰胺 烃基与t m v 中的一个h i s 及t m i i i 中的两个s e r 分别形成氢键。 1 5 2 基于多配体与受体作用而建立的模型 j a n s e n 和同事进行了药理模型研究。用2 一酰胺- 8 - 甲氧基四系列和它 们的环同源物和四羟咔唑衍生物作为半刚性配体 5 9 ，经过a p o l l o 计算 8 鼬m a s i e 弛r s t 散l t e s i 。 稷j 芋( 寻找每一种化含物的形态) 分析赠发现，它们能符合各羊中药理成分 的空问最佳位点，存在在结合位点的假设连缩点，连结点可能是在原予斑 心或突瀣载俸孤对电子方向或氢键供体中心。发瑗了嚣弹药璞模型，第一 秘相当于姗t ；瑚t ：扭转焦不易活动不活动形式，第二种属不易活动 抗不活幼形式。但这种药理模型合适性较差。 按照上黼插逐静蓊疆模鬻，寄入提滋了一套1 3 3 个粼体，毵够麸不溺 的组织朋相似的药理分靠来替代2 , 2 5 i - - m t 。在m t 的假设活性形态上， 为了减少来自不同实验结合资料的异质性，采用亲和性的相对测量作为w 靠的交量。个交量酶获褥律为嚣阉纯含耨在p i c 。或p k i 之潮篷戆不同， 积那些在相同条件下对辩t 的报导比较。对尉绕配体芳褡部分空间区域亲 脂势、电极动力势、立体势进行了研究。限制性侧链酰化成乙酰或丙酰， 三类纯合扬被分箱研究，( 色氨类耘秘、生耱弱类伤、t e t r a l i n e s 帮其它 蝴似化会物，n 一苯烷基铵) 它们出现相似的3 d q s a r 方案在捆应的空间区 域，因这个原因逸三类和一魑未分类的化合物被包括在球形模型举( 见阁 2 ) 。 煳2 ：c o w f a 模型之一 9 m a s t e r s t i i e s i 。 这个模型具有较好的预测力，支持了提出的线型结构。应当提到的是， 假如对模型自身一致性进行估计，对检测变化的线型结构来说不总是一个 有用的标准。在立体、亲脂、和电极动力势变化的空间区域使得亲和性系 统变化，包括m t 线型结构和代表配体其它类型的两种化合物，能够观察 到这样的情况，经过一系列很重要的目前还无法解释的对应于m t 区域替 代物的积极影响，一些s a r 特征被保存下来。 应用相似的方法，但不同的选择，最近得到两个c o m f a 研究的结果， 尽管在3 d q s a r 外形上相似，但与先前描述的不同，尤其是在线型成线一 步。s i c s i ce ta l 在鸡脑亲和性基础上建立了许多c o m f a 模型，对一种 硬质双羟基苯烷衍生物的两种形态测定了不同的线型，有趣地发现在这些 研究的不同模型，从不同开始的形态和线型规则中得到了统一，q ：值的 范围在0 5 1 - 0 6 2 ，普遍认为这个值可以接受。在九种化合物的一个外部 实验组上si c s i c s 模型然而表现较好的预见性。对mt 的选择活性形式 有一个对折不易活动不易活动结构平面，酰胺基通常在吲哚平面折叠约 2a ( 埃) ，种不易活动不易活动的mt 侧链结构被m a r o te ta l 选出，基于在一类限制性化合物上进的药理研究，这不包括带不饱和侧链 有较好亲和性的配体，不同于关于甲氧基和酰胺基定位的si c s i c 模型， 分析得到一个c o m f a 模型，它的预测性通过一系列外部7 8 个配体得到了 检测，具有象n 一乙酰基的立体和亲脂性要求的相关信息，较先前c o m f a 模型更准确，它应用结合资料是在相同组织，因而是很有价值的，但在绵 羊垂体的这种情况，使一些重要的配体类型不能包括进去：象乙酰胺一8 一甲氧四系列和n 一苯烷基胺，说明了通过各种分子模型研究提出的mt 活性形式，为了对提出的不同活性形式进行区分，当然还需进行更多的研究。 一m a s t e r 雠 s t i | e 文s i 。 第二章褪黑素单克隆抗体的制备及纯化 2 1 前言 为了获得抗褪黑素( m t ) 高效价的单克隆抗体，用甲醛将m t 连结到b s a 上，然后用连结物背部皮下多点免疫b a l b c 小鼠，用p e g 诱导免疫鼠脾 细胞与s p 2 o 细胞融合，经e l i s a 法筛选阳性克隆株及测定效价，用抗体 与同类物之问的交叉反应进行特异性鉴定，最后获得5 株( 4 c 9 0 7 、 6 h 1 g 7 e 1 2 f 9 ，1 e 1 e 2 h 2 h 6 ，3 e 1 2 c 7 h 1 1 e 7 ，6 a 6 a 3 a 2 c 3 ) 能稳定分泌高效价 抗 f t 的m c a b 的杂交瘤细胞。其培养上清的e l i s a 效价分别是l ： 6 4 0 0 1 ：3 2 0 0 ，1 ：1 0 0 0 ，1 ：1 0 0 0 ，1 ：6 4 0 0 。纯化腹水效价分别是l 1 0 ， 1 1 0 一，1 1 0 一，l 1 0 一，2 1 0 。( 抗体制备过程见下图3 ) 6 1 图3 ：抗体制各过程 m 雅a s i t 粮r s t 淑 t e s i 。 2 2 ：材料、试剂、仪器和方法 2 2 1 ：免疫 2 2 1 1 免疫原和检测原的制备 材料、设备 b s a ( 北京生化制品厂) ，m t ( s i g m a 公司) ，乙酸钠、乙醇、甲醛、 w h a t m a nn o i 纸( 上海生化公司) ，0 0 5 mp h 7 4 的磷缓冲液用磷酸二氢钠 和磷酸氢钠配制。磁力搅拌机( s i g m a 公司) ，冷冻干燥机( 一8 0 ( 2 ，n u n c 公司) ，制冰机。 操作方法 称取1 5 m g b s a 或ova 溶于0 5 m l 的双蒸馏水中，将5 m g m t 溶于0 5 m l 的双蒸馏水与乙醇混合液( 2 ：1 ) 加入前试管中，加入氚标m t ( 2 2 0 x 1 0 1 d p m ) ，然后加入0 3 m 1 3 m 的乙酸钠和0 5 m l ，7 5 的甲醛，最后总体积 用双蒸馏水配制到2 0 m l 反应混合物放于暗处，在磁场下搅拌2 4 小时， 用0 0 5 mp h 7 4 的磷缓冲液透析2 4 小时以上，反应产物经离心除去残留 物。通过凝胶过滤后，用改良l o w r y 测浓度，定量分装、冻干，放一2 0 保存。 2 2 1 2 用改良l o w e r y 法准