毕业论文--灰霉病菌强启动子Pef的克隆及功能验证.docx

中文摘要灰葡萄孢(Botrytis cinerea)是一种在世界范围内引起植物严重病害的真菌。它可以在1000多种寄主植物中引起灰霉病(gray mold disease)，是一种高风险的坏死营养型病原菌。而研究强启动子对于灰霉菌致病基因的表达研究有着重要的指导作用。强启动子对于RNA聚合酶有着非常高的亲和力，能够指导mRNA的大量合成，从而得到大量相应蛋白质的表达。为了探究我们挑选的强启动子对于GFP（Green Fluorescent Protein，绿色荧光蛋白）在灰霉菌中的表达作用，本实验主要进行了以下几个方面的工作：1. gfp、终止子TtrpC、对照启动子PactA及强启动子Pef的克隆。2. pGT载体、pAGT载体、pEGT载体的构建。3. 两个表达载体pAGT及pEGT分别转化灰霉病菌。4. 转化子的筛选和鉴定。5. 各转化子的绿色荧光观察及对比。6. 对于强启动子的评价分析。通过以上工作，在得到相关基因后成功构建了所需的表达载体，共转化灰霉病菌，并最终利用荧光倒置显微镜对绿色荧光蛋白表达的观察，初步确定了强启动子的作用。本研究可为灰霉菌相关致病基因表达研究中启动子的选择提供依据。关键词： 灰霉菌 强启动子 绿色荧光蛋白表达AbstractBotrytis cinerea is a kind of fungi that cause serious plant disease worldwide. It can cause gray mold disease in more than 230 kinds of host plants. In fact, Botrytis cinerea is a high-risk necrotic vegetative pathogen. Research on overexpression promoters provides an important guidance on pathogenicity research of Botrytis cinerea. Strong promoters have a very high affinity for RNA polymerases, which can guide mass synthesis of mRNA, and express a large number of proteins. In order to explore the effect of the strong promoter we chose on the expression of GRP in Botrytis cinerea, the main work of this research was as follows: 1. Clone of gene gfp、terminator TtrpC、control promoter PactA and strong promoter Pef. 2. Construction of pGT vector、pAGT vector、pEGT vector. 3. Transformation of two expression vectors-pAGT and pEGT into Botrytis cinerea. 4. Screening and identification of transformants. 5. Green fluorescence observation and comparison of all transformants. 6. Evaluation and analysis of the strong promoter. Through the above work, we successfully constructed expression vectors after we obtained related genes. Finally, we observed the expression of GFP by inverted fluorescence microscope, and determined the effect of the strong promoter preliminarily. This research can provide a basis for selection of promoters in the study of pathogenic gene expression of Botrytis cinerea.Keywords: Botrytis cinerea overexpression promoter GFP (green fluorescent protein)II目 录绪论1第一节 灰霉菌及其致病性研究现状11.1 灰霉菌简介11.2 灰霉病及研究现状1第二节 强启动子及其研究进展22.1 强启动子简介22.2 强启动子研究进展3第三节 灰霉菌强启动子研究意义与方法介绍43.1 强启动子研究意义与目的43.2 绿色荧光蛋白4第一章 gfp、TtrpC、启动子PactA及Pef的克隆5第一节 实验材料51.1 克隆模板51.2 实验试剂51.3 实验仪器5第二节 实验方法52.1 gfp、TtrpC、启动子PactA及Pef的克隆52.2 连接T Vector与E.coli转化72.3 重组载体的鉴定72.4 提取重组质粒8第三节 实验结果及分析83.1 电泳验证回收片段83.2 菌落PCR验证重组载体9第二章 pGT载体、pAGT载体、pEGT载体的构建10第一节 实验材料101.1 实验试剂101.2 实验仪器10第二节 构建pGT载体102.1 pG载体的构建102.2 pGT载体的构建11第三节 构建pGT载体实验结果及分析123.1 双酶切验证pG载体123.2 双酶切验证pGT载体123.3 测序验证pGT载体13第四节 构建pAGT与pEGT目的载体164.1 PactA-T、Pef-T与pGT载体的酶切连接164.2 E.coli转化与质粒的提取174.3 pAGT与pEGT目的载体的验证17第五节 构建pAGT与pEGT载体实验结果及分析175.1 双酶切验证pAGT、pEGT目的载体175.2 测序验证pAGT和pEGT17第三章 灰霉菌突变体bcagt和bcegt的获得20第一节 实验材料201.1 实验试剂201.2 实验仪器20第二节 转化子的获得202.1 目的载体电击转化农杆菌202.2 农杆菌介导目的载体转化灰霉菌212.3 转化子的筛选与验证23第三节 实验结果及分析243.1 菌落PCR验证目的载体243.2 转化子筛选253.3 提DNA验证转化子25第四章 启动子强度验证27第一节 实验材料271.1 实验试剂271.2 实验仪器27第二节 绿色荧光观察272.1 实验药品及实验材料的准备272.2 灰霉菌孢子的绿色荧光观察28第三节 实验结果及分析29结论31致谢32参考文献33绪论第一节 灰霉菌及其致病性研究现状1.1 灰霉菌简介灰霉病的病原菌为灰葡萄孢(Botrytis cinerea)，其无性阶段属半知菌类，葡萄孢属(Botrytis)，有性世代属子囊菌门(Ascomycota)，葡萄孢盘菌属(Botryotinia)，富氏葡萄核盘菌(Botryotinia fuckeliana)(de Bary)Whetzel。它的分生孢子梗自寄主表皮、菌丝体或菌核长出，密集成丛；孢子梗细长分枝，浅灰色，大小为(280550)m(1224)m，顶端细胞膨大呈圆形，上面生出许多小梗，小梗上着生分生孢子，大量分生孢子聚集成葡萄穗状。分生孢子呈圆形或椭圆形，单孢，无色或淡灰色，大小为(915)m(6.510)m。菌核呈黑色，长圆形，约12mm，剖视看，外部为疏丝组织，内部为拟薄壁组织。图1 灰霉菌无性孢子Paul Bachi, University of Kentucky Research and Education Center, B1.2 灰霉病及研究现状灰霉菌可以在1000多种寄主植物中引起灰霉病(gray mold disease)，它是一种高风险的坏死性病原体。这种子囊菌主要侵染的是双子叶植物，包括葡萄、茄子、番茄、甘蓝、苹果、菜豆、辣椒等1，还有农业上非常重要的一系列粮食作物。在爆发严重的病害时，甚至可以产生100%的损失。灰霉菌是一种典型的死体营养型病原菌，可以通过合成毒素、活性氧，或是植3物产生的氧爆反应(oxidative burst)来杀死宿主细胞2。灰霉菌的分生孢子能够侵染葡萄的叶片和花序，但还是以秋天感染成熟的葡萄浆果为主。灰霉菌在不同器官和不同植物体中可以产生各种不同的症状，它可以攻击植物的花，叶，茎和果实，更糟糕的是，年轻的灰霉病菌可以保持静止，潜伏一阵子，等到环境有利的时候，再发病。这显示了灰霉菌有一个巨大的攻击宿主细胞的“武器库”。在大多数气候良好的时候，灰霉菌是非常常见的，它本身性能强大，孢子数量巨大，孢子也很大，干燥的分生孢子可以通过空气进行分散，使得该病菌能够在病原体内恒定发生，不受作物自身的威胁。在死体营养型和杂食性真菌中，灰霉菌是最有利于研究的模型之一3。在200多种双子叶寄主植物中，大部分植物包括重要的蛋白、油料、纤维和园艺作物，是在温带和亚热带地区受到感染的，特别是在高湿度、低温及叶面存在游离水分的情况下4-6。灰霉菌可以引起寄主植物所有气生组织的软腐病，以及蔬菜，水果和花卉的腐烂，主要是由于植物成熟后可以产生很多灰霉的分生孢子梗和大量的分生孢子7。灰霉菌可以产生很多种类的降解细胞壁的酶、毒素还有其它小分子化合物，如草酸等。此外，灰霉病还能对鹰嘴豆等富含蛋白质的重要豆科农作物中产生非常严重的伤害，且这种伤害会持续出现8。由于灰霉病种类繁多，人们无法轻易地从各种染病的植物组织和器官的受损害状况来概括出一个由灰霉菌引起的各种灰霉病症状的普遍性特点。软腐病，随之而来的薄壁组织的萎缩和浸水状态，以及同时伴有的大量灰色分生孢子的快速出现，恐怕就是植株叶片和水果果实被灰霉菌感染的典型症状了。在很多水果和蔬菜中，灰霉主要侵染的是尚未脱落的衰老的花朵，以此形成软腐病并侵染邻近的正在形成的果实，这种情况在黄瓜、绿皮南瓜、四季豆、草莓和苹果中都会出现。在花瓣上，染病症状会从一个微小的痘痕开始，直至完全的软腐状态，具体的染病程度取决于环境条件9。在大棚种植的马铃薯中，严重的伤害出现在修剪茎条时形成的伤口处，并可以侵染整条茎。在树莓中，灰霉菌除了能毁坏果实，还能侵染正从成熟转向衰老的叶片，造成一种楔形的，伴有黄色边缘的棕褐色损伤，一直蔓延到茎节点，并在茎的初生皮层形成显著的浅棕色伤痕。种传感染的现象在超过50种寄主植物中被发现，包括亚麻，向日葵，莴苣10。种子传染发生在鹰嘴豆中，可以造成作物整株毁败11。图2 灰霉病侵染草莓Edward Sikora, Auburn University, B第二节 强启动子及其研究进展2.1 强启动子简介启动子是一组聚集在RNA起始位点周围的聚合酶II的转录控制模块，它们控制着基因整体表达的效应，或者可以控制基因表达（转录）的起始时间以及表达的程度等等。在遗传学中，启动子是可以启动特定基因转录的DNA区域，它启动子位于基因的转录起始位点附近，位于同一条链上并在DNA的上游（朝向有义链的5区域）12。启动子大概有约100-1000碱基对长。为了进行转录，合成RNA（被称为RNA聚合酶）的酶必须附着于基因附近的DNA上。启动子包含特异性DNA序列，例如提供RNA聚合酶的稳定的初始结合位点和募集RNA聚合酶的称为转录因子的蛋白质的响应元件。这些转录因子具有与特异性启动子相连并调节基因表达的相应核苷酸的特异性激活物或阻抑物序列。在细菌中，启动子被RNA聚合酶和相关的因子所识别，其通常通过活化蛋白与其附近的自身DNA结合位点的结合而被带到启动子DNA上。在真核生物中，该过程更为复杂，并且至少有7个不同的因子对于RNA聚合酶II与启动子的结合是必需的。启动子代表了可以与其他调节区域（增强子，消音子，边界元件/绝缘子）协同工作以指导给定基因的转录水平的关键元件。响应于细胞中调节蛋白的丰度或构象的变化诱导启动子，其能够激活转录因子以募集RNA聚合酶。13-14由于启动子通常紧邻所讨论的基因，所以启动子中的位置相对于转录起始位点是被指定的，其中DNA的转录开始于一个特定的基因（即上游的位置是从-1倒着数的，例如 -100是上游100个碱基对的位置）。在细胞核中，似乎启动子优先分布在染色体区域的边缘，可能是在不同染色体上共表达基因。此外，在人类中，启动子显示出每个染色体特征的某些结构特征15。真核启动子是多样的，可能很难表征，然而最近的研究表明它们分为10多个类别16。基因启动子通常位于基因的上游，并且可以具有远离转录起始位点（增强子）几个千碱基的调节元件。在真核生物中，转录复合物可导致DNA自身弯曲，这使得调节序列远离实际的转录位点。真核RNA聚合酶II依赖性启动子可以含有TATA元件（共有序列TATAAA），其被一般转录因子TATA结合蛋白（TBP）识别；还有B识别元件（BRE），其被一般转录因子TFIIB识别17-19。TATA元件和BRE通常位于转录起始位点附近（通常在30至40个碱基对内）。真核启动子调节序列通常结合涉及转录复合物形成的称为转录因子的蛋白质。一个例子是结合基因螺旋-环-螺旋（bHLH）家族（例如BMAL1-Clock，cMyc）中的转录因子的E盒（序列CACGTG）20。一些由多种转录因子靶向的启动子可能会达到过度活跃的状态，导致转录活性增加。强启动子则是一种与RNA聚合酶有着很高的亲和力的启动子，它能够大量地表达基因，并最终大量合成蛋白。2.2 强启动子研究进展一些启动子被称为组成型，因为它们在细胞中的所有情况下都是活性的，而其它启动子被称为调节型，它们仅在响应特定刺激时才能在细胞中活跃。组成型启动子广泛用于水稻的昆虫抗性转基因表达Bt基因，例如35S CaMV启动子21，泛素启动子22和肌动蛋白启动子23。但是，比起时间和空间的特异性表达，外源蛋白的组成型表达在转基因植物中是处于一个不利的地位的，比如在植物上施加代谢负荷恒定的合成外源基因产物会增加目标昆虫抗性基因的潜在风险。同样的，也有对于转基因食品对于人体健康威胁的担忧24-25。组成型表达在某些方面确实是有争论的。如果一种特异性的转基因在发育的某个错误的时刻被过量地表达，或是不正常的表达，或是非常高水平的表达，都可能会对于植物产生意想不到的后果和存在潜在的风险，甚至对于植物所生长的环境而言也是如此。在用于植物生物技术的病毒启动子之后的第二个最常见的启动子组来自高度表达的植物基因，例如种子储存蛋白，光合蛋白或持家基因，其所有的mRNA都容易克隆和表征26，肌动蛋白，泛素和微管蛋白基因启动子都已经用于各种植物物种中来表达转基因或选择标记。随着生物技术的提高，人们需要更多的发育或环境调节启动子，并且人们集中相当大的资源来进行特定组织或生物，激素或非生物应激反应基因和启动子的发现26。第三节 灰霉菌强启动子研究意义与方法介绍3.1 强启动子研究意义与目的灰霉菌作为一种世界范围内广泛的、重要的植物病害，对于其致病力的相关研究就显得很有意义。而强启动子作为一种能够使得基因强烈表达的顺式作用元件，对它进行的研究可以为实验室构建强基因表达载体提供依据，并窥探启动子对于灰霉菌致病的影响。实验室普遍使用的强启动子有时对于一些敲除特定基因的突变体的表达不够有效，甚至会使基因沉默，所以，我们就想要构建一个新的强启动子表达载体，希望能够提高基因的表达效率。这对于实验室研究灰霉菌致病性、信号通路、基因表达等有着很大的帮助。3.2 绿色荧光蛋白绿色荧光蛋白（GFP）是由238个氨基酸残基（26.9kDa）组成的蛋白质，当暴露于蓝色至紫外线范围的光时，呈现明亮的绿色荧光27-28。虽然许多其他海洋生物具有类似的绿色荧光蛋白，但GFP传统上是指从维多利亚多管发光水母（Aequorea victoria）中首先分离得到的蛋白质。来自维多利亚多管发光水母的GFP在波长395nm处具有主要的激发峰，在475nm具有较小的激发峰。其发射峰为509nm，处于可见光谱较低的绿色部分。由于GFP能够形成内生发色团，而不需要任何辅助辅因子、基因产物或除分子氧之外的酶和底物，因此，GFP可以在各种形式的生物学中成为一个很好的研究工具29。在细胞和分子生物学中，GFP基因经常用作表达的报告物30。GFP已经以修饰形式使用于生物传感器，并且已经创建了许多表达GFP的动物，证明了基因可以在整个给定生物体、选定的器官或感兴趣的细胞中表达。GFP可以通过转基因技术引入动物或其他物种，并保持在其基因组及其后代中。迄今为止，已经在许多物种中表达了GFP，包括细菌、酵母、真菌、鱼和哺乳动物（包括人细胞）。2008年10月10日，科学家Roger Y. Tsien，Osamu Shimomura和Martin Chalfie因发现和利用绿色荧光蛋白获得2008年诺贝尔化学奖。图3 GFP在大鼠皮质神经元的高表达/Neural-Transfection.aspx第一章 gfp、TtrpC、启动子PactA及Pef的克隆第一节 实验材料1.1 克隆模板灰霉菌B05.10（野生型）的DNA（活化菌种，自提DNA），pSilent-1的DNA，pSUR载体DNA。1.2 实验试剂ddH2O，Pfu DNA polymerase，Thermus Aquaticus polymerase，10 Pfu Buffer，10 Taq Buffer，二甲基亚砜（DMSO），dNTP，一对适用引物，克隆模板，Solution I，TAE，EB，10Loading Buffer，pMD18-T Vector，LB液体培养基，LA固体培养基，E. coli的DH5感受态，裂解液I，裂解液II，裂解液III，NaAc（pH5.2），CH3CH2OH，70%CH3CH2OH，CHCl3，(CH3)2CH2CH2CH2OH，RNase A，40%甘油。1.3 实验仪器DL9700 Polymerase Chain Reaction Amplifier，JY300C Agarose gel electrophoresis apparatus，冰箱，水浴锅，37摇床，37恒温培养箱，JY04S-3E电泳凝胶成像分析系统，台式低速离心机，生物安全柜，高压蒸汽灭菌锅。第二节 实验方法2.1 gfp、TtrpC、启动子PactA及Pef的克隆2.1.1 gfp、TtrpC、启动子PactA及Pef的引物设计与合成运用Primer premier5.0这个软件来设计引物，酶切位点则以实验室已有的，并经验证双酶切效率高的来进行设计，同时需要保证所连载体和克隆的基因酶切位点一致，以利于下一步连接用。设计完引物后，检查引物GC含量，有无引物二聚体，退火温度等，并送至Sangon Biotech公司进行引物的合成。设计好的引物：F-gfp: GGATCCATGGTTTCCAAGGGTGAG BamH I酶切位点R-gfp: GTCGACCTATTTGTAAAGTTCATC Sal I酶切位点退火温度：57F-TtrpC: GTCGACGATCCACTTAACGTTACT Sal I酶切位点R-TtrpC: CTGCAGTCTAGAAAGAAGGATTAC Pst I酶切位点退火温度：57F-PactA: GGTACCTGTGCGTCCTCTTCTGCCTAC Kpn I酶切位点R-PactA: GGATCCGGTTGATAAATTAAGACGTTA BamH I酶切位点退火温度：56F-Pef: GGTACCCACACCACTGAAGAGTGA Kpn I酶切位点R-Pef: GGATCCTCTGCAAAGAAGAAACAA BamH I酶切位点退火温度：512.1.2 PCR扩增目的片段将扩增模板稀释到适宜浓度后，按照配方配制PCR所需体系，并在DL9700 PCR仪中按照设定好的程序进行所需目的片段gfp、TtrpC、PactA及Pef的扩增。扩增程序如下,图4 扩增程序扩增体系（总体积20L）为，试剂加入量（以L计）ddH2O14.410Pfu Buffer2dNTP0.8DMSO0.8上游引物0.4下游引物0.4B05.10的DNA1Pfu DNA Polymerase0.2每个基因配制10份，即各200L，等到扩增结束后,取出样,放置于4暂存。2.1.3 胶回收目的片段用Agarose做浓度为1.2%的5孔胶，将PCR跑完的片段加10Loading Buffer后，全部加入凝胶孔中，并加入合适的Marker（D2000），140V电压跑20min左右。待大条带和小条带已能清晰分辨出后，关闭电泳仪。将凝胶泡入加有EB的蒸馏水中，浸泡20min左右后，过蒸馏水，洗去未吸收的EB，用凝胶成像仪看胶。依照Marker找到目的条带后，在紫外光下切出所需条带，而后，用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒回收目的片段。回收完后，加适量的ddH2O溶解片段，放置于4暂存。2.1.4 平末端加“A”由于Pfu DNA Polymerase扩出来的片段是平末端，而连接T载体或是连接后续载体必须是粘性末端，所以，必须进行平末端加“A”操作。加“A”体系（总体积20L）为，试剂加入量（以L计）10Taq Buffer2Dntp0.5DNA片段17.3Taq DNA Polymerase0.2将配好的体系放入DL9700 PCR仪中，设置程序为72，20min。待跑完PCR后，取出，放置于冰盒上暂存。2.1.5 乙醇沉淀回收目的片段对于已切胶回收的片段，是很纯的，没有杂带，这种情况下，使用乙醇沉淀回收可以提高回收的效率。乙醇沉淀回收步骤为，1、用ddH2O将加“A”体系补充至100L;2、加入10L的pH值为5.2的NaAc（可多加，提高回收效率）；3、加入2.5倍体积（即250L）的无水CH3CH2OH，上下翻转10次（很重要）；4、置于-20冰箱15min；5、1.25104rpm，用台式低速离心机离心8min后，把上清液舍去；6、加入800L的70%CH3CH2OH；7、调转速为1.25104rpm，离心5min，舍去上清液；8、空甩（开离心机，至转速为1.0104rpm后，关闭）；9、按回收的量加入适量的ddH2O；10、放置于4暂存。2.1.6 Agarose凝胶电泳检测目的片段用Agarose做浓度为1.0%的15孔胶，在一次性塑料手套上点出几个1L左右的10Loading Buffer液滴，再取乙醇沉淀回收的片段各1L加到液滴中，混匀。再将液滴加入凝胶孔中，并加入合适的Marker（D2000），140V电压跑20min左右。将凝胶泡入加有EB的蒸馏水中，浸泡20min左右后，过蒸馏水，洗去未吸收的EB。打开凝胶成像仪，用330nm紫外光看胶，成像，拍照，检测回收的目的片段。2.2 连接T Vector与E.coli转化2.2.1 将目的片段连接到pMD18-T Vector上用冰袋调节水浴至16（可以先调低至13左右），然后配制连接体系（总体积10L）为，试剂加入量（以L计）ddH2O2（补至10）Solution I5pMD18-T Vector1.5左右目的DNA片段1.5左右把配好的体系放在调好的水浴中，连接2.5h左右（可过夜）后，放置于4暂存。2.2.2 热激法转化E.coli的DH5感受态为了将连接好的片段大量高保真复制，需要转入E.coli的DH5感受态中，我们使用热激法。1、取冰，调水浴锅至42；2、取DH5感受态和连接好的片段，置于冰上融化；3、取10L连接好的片段，加到融化的感受态中，混匀，置冰上30min；4、放入水浴锅热激90s后，迅速放到冰盒上2min；5、加入700L的LB液体培养基，放到37摇床，200rpm，摇45min左右，使其充分繁殖；6、将摇好的菌用离心机离心，1.2104rpm，30s，之后，舍去上清液，剩200L左右，和沉淀混匀，在LA抗性平板（T Vector有Amp（氨苄霉素）抗性，DH5无Amp抗性，故可筛选）上涂布；7、置于37恒温培养箱中培养12-16h。2.3 重组载体的鉴定对于连接T载体的重组载体进行菌落PCR验证。先配制菌落PCR的体系（总体积20L）为，试剂加入量（以L计）ddH2O15.410Taq Buffer2dNTP0.8DMSO0.8上游引物0.4下游引物0.4Taq DNA Polymerase0.2然后，取培养好的平板，在平板上用牙签挑取单菌落，在配好的PCR体系中蘸两下（这相当于在体系中加入了模板DNA）后，再在一个新的LA抗性平板上对应号码备份此菌落。每个基因型挑10个即可。之后，按照之前PCR扩增的程序进行菌落PCR扩增，并用凝胶电泳进行跑电泳检测条带。2.4 提取重组质粒在50mL的大离心管中加入约7.5mL的LB液体培养基，用枪头挑取备份平板上验证正确的单菌落（1-2个），至离心管，37摇床中摇菌6-8h，至菌液浑浊后，提质粒。1、准备无水CH3CH2OH和70%的CH3CH2OH，放置于-20冷冻；2、在生物安全柜中取2mL的EP管，加入700L的40%甘油，再加入700L的菌液，置于-80冷冻保存；3、用移液枪取菌液（3mL）于1.5mL的EP管中，调台式低速离心机转速为1.2104rpm，离心30s，舍去上清液（进行两次收集即可），并用枪头吸干净残存的LB培养基；4、向EP管中加入300L的Sol I，用DG-800涡旋混合器悬浮液体；5、至混匀后再加入300L的Sol II，并静置一会，使菌液清亮；注：Sol II需要现配使用，配方为，0.4M的NaOH与2%的SDS等体积混合即可。6、之后，加入420L的Sol III，温和地颠倒EP管13次后，调节离心机转速为1.25104rpm，离心8min；7、离心结束后，取出715L的上清液于另一个1.5mL的EP管，并加入715L的等体积混合的CHCl3和(CH3)2CH2CH2CH2OH，颠倒EP管29次后，调节离心机转速为1.2104rpm，离心6min；8、离心结束后，再取出450L的上清液于一个2.0mL的EP管，加入预先冷却的无水CH3CH2OH至2.0mL，温和地颠倒混匀后，静置于室温一会，调离心机转速为1.18104rpm，离心8min；9、离心结束后，取出EP管，舍弃上清液，加入1mL已预冷的70%CH3CH2OH，调离心机转速为1.12104rpm，离心5min；10、离心结束后，舍弃上清液，将EP管空甩（开离心机，至转速为1.0104rpm后，关闭）后，取出，并用枪头吸去残存的液体，然后，静置一会，让它风干后，加入适量含有1/200的RNase A的ddH2O，溶解沉淀物，之后，放在37恒温培养箱中30min，使RNA降解完毕，放置于-20冰箱保存。第三节 实验结果及分析3.1 电泳验证回收片段如前2.1.6所述，制Agarose凝胶，用电泳仪跑电泳，检测之前胶回收的目的片段大小，从而验证回收片段的正确性。经检测，所回收的四条片段都是符合预期大小的，认为回收片段正确。图5 验证回收的目的片段（图中标注的gfp、TtrpC、PactA、Pef是对应的回收目的片段条带，D2000 Marker是线状双链DNA基准条带，其片段大小在右侧标出）3.2 菌落PCR验证重组载体如前2.3所述菌落PCR的方法，对连T Vector的重组载体进行验证，并用Agarose凝胶电泳进行目的条带的检测。菌落PCR的结果显示，四种重组载体的菌落PCR产生的目的条带符合预期大小，认为重组载体正确。图6 菌落PCR验证连T Vector的重组载体（图中左上1-6泳道为验证gfp-T重组载体，右上7-12泳道为验证TtrpC-T重组载体，左下13-18泳道为验证PactA-T重组载体，右下19-24泳道为验证Pef-T重组载体，D2000 Marker是线状双链DNA基准条带，其片段大小在图中侧边标出）第二章 pGT载体、pAGT载体、pEGT载体的构建第一节 实验材料1.1 实验试剂ddH2O，Thermus Aquaticus polymerase，10 Taq Buffer，二甲基亚砜（DMSO），dNTP，一对适用引物，克隆模板，Solution I，TAE，EB，10Loading Buffer，LB液体培养基，LK固体培养基，E. coli的DH5感受态，裂解液I，裂解液II，裂解液III，NaAc（pH5.2），CH3CH2OH，70%CH3CH2OH，CHCl3，(CH3)2CH2CH2CH2OH，RNase A，10K Buffer，10H Buffer，Sal I，BamH I，Pst I，Kpn I，40%甘油。1.2 实验仪器DL9700 Polymerase Chain Reaction Amplifier，JY300C Agarose gel electrophoresis apparatus，冰箱，水浴锅，37摇床，37恒温培养箱，JY04S-3E电泳凝胶成像分析系统，台式低速离心机，生物安全柜，高压蒸汽灭菌锅。第二节 构建pGT载体2.1 pG载体的构建2.1.1 重组质粒gfp-T与目的载体pBHt2的酶切用合适的restriction endonuclease对已连接T Vector的重组质粒gfp-T和目的载体pBHt2进行酶切，使它们暴露出相同的粘性末端，使后续连接可用。配制酶切体系（总体积10L）为，试剂加入量（以L计）ddH2O7.410K Buffer1Sal I0.3BamH I0.3gfp-T/pBHt21因为需要大切片段，所以，每个体系都配10份，之后，放到37恒温培养箱中酶切45min左右即可。酶切完成后，取出，用凝胶电泳跑10L的样检测一下目的条带是否正确，同时验证了上一步连T的载体是否正确，载体线性化程度如何，量的多少。2.1.2 重组质粒gfp-T与目的载体pBHt2的连接验证正确的片段用Solution I进行连接。由于在酶切的时候使目的基因与载体切出了相同的粘性末端，所以，可以互相连接成一条完整的片段。用冰袋调节水浴至16（可以先调低至13左右），然后配制连接体系（总体积10L）为，试剂加入量（以L计）ddH2O2（补至10）Solution I5gfp-T1.5左右PBHt21.5左右把配好的体系放在调好的水浴中，连接2.5h左右（可过夜）后，放置于4暂存。2.1.3 E.coli转化如前第一章2.2.2所述热激法把上一步连接好的pG载体转化E.coli的DH5感受态，涂布LK固体培养基，放在37恒温培养箱培养16h以上。2.1.4 菌落PCR验证如前第一章2.3所述方法进行菌落PCR验证。2.1.5 重组质粒的提取如前第一章2.4所述方法进行pG质粒的提取。2.1.6 重组质粒的验证对pG质粒进行双酶切验证，酶切体系如前2.1.1所述。之后，点样10L，跑电泳，看胶。2.2 pGT载体的构建2.2.1 重组质粒TtrpC-T与pG的酶切 如前述方法，用合适的restriction endonuclease对已连接T Vector的重组质粒TtrpC-T和pG载体进行酶切。配制酶切体系（总体积10L）为，试剂加入量（以L计）ddH2O7.410H Buffer1Sal I0.3Pst I0.3TtrpC-T/pBHt212.2.2 重组质粒TtrpC-T与pG的连接如前述方法进行连接，体系（总体积10L）为，试剂加入量（以L计）ddH2O2（补至10）Solution I5TtrpC-T1.5左右pG1.5左右图7 pGT载体（黑色细圆环部分为pBHt2载体）2.2.3 E.coli转化如前第一章2.2.2所述热激法把上一步连接好的pGT载体转化E.coli的DH5感受态，涂布LK固体培养基，放在37恒温培养箱培养16h以上。2.2.4 菌落PCR验证如前第一章2.3所述方法进行菌落PCR验证。2.2.5 重组质粒的提取如前第一章2.4所述方法进行pGT质粒的提取。2.2.6 重组质粒的验证1、酶切验证对pGT质粒进行双酶切验证，酶切体系如前2.1.1和2.2.1所述，同时验证gfp和TtrpC基因。之后，点样10L，跑电泳，看胶。2、测序把双酶切验证正确的pGT载体备份的菌液从-80取出，置于冰盒上。在50mL大离心管中加入7.5mL左右的LB液体培养基，用枪头挑取一点冰盒里的菌液，至离心管，37摇床中摇菌6-8h，至菌液浑浊后，取出。用移液枪取菌液2mL左右于1.5mL的EP管中，调台式离心机转速为1.2104rpm，离心30s，舍去上清液（收集两次菌液即可），并用枪头吸干净残存的LB培养基。之后，把这个EP管装入封口膜，连同gfp两端引物和TtrpC两端引物送去Sangon Biotech公司进行测序。第三节 构建pGT载体实验结果及分析3.1 双酶切验证pG载体对于所构建的重组载体要进行酶切验证。因为设计引物时上下游加了不同的酶切位点，便于后续载体的连接，于是，需要使用双酶切的方法进行验证。如前2.1.6所述对所提取的pG质粒用Sal I和BamH I进行双酶切验证。之后，制Agarose凝胶，用电泳仪跑电泳，检测酶切产生的小片段大小，从而验证重组载体的正确性。经检测，酶切产生的小片段符合预期大小，认为所构建的pG载体正确。图8 双酶切验证pG载体（图中1-3泳道是对3个pG质粒双酶切产生的条带，gfp表示酶切产生的小片段所对应的片段大小，1Kb Marker和D2000 Marker是线状双链DNA基准条带，其片段大小在右侧标出）3.2 双酶切验证pGT载体如前2.2.6所述对所提取的pGT质粒用Sal I和Pst I以及Sal I和BamH I进行双酶切验证。之后，制Agarose凝胶，用电泳仪跑电泳，检测酶切产生的小片段大小，从而验证重组载体的正确性。经检测，酶切产生的小片段符合预期大小，认为所构建的pGT载体正确。 图9 双酶切验证pGT载体（图中1泳道是对1个pGT质粒用Sal I和Pst I双酶切产生的条带，TtrpC表示酶切产生的小片段所对应的片段大小，2-4泳道是对3个pGT质粒用Sal I和BamH I双酶切产生的条带，gfp表示酶切产生的小片段所对应的片段大小，D2000 Marker是线状双链DNA基准条带，其片段大小在左侧标出）3.3 测序验证pGT载体测序可以知道所连接的目的片段的每个核苷酸的种类，能够更严谨地验证重组载体。由于测序时一条引物的方向一次只能向下测1000bp的DNA，且在1000bp的DNA两端测序结果不够精确，会出现干扰，不稳定，所以，提供给Sangon Biotech测序公司gfp两端引物和TtrpC两端引物，分别进行双向测序，排除两端测序的不准确。pGT测序结果为，图10 gfp测序峰值信号图（选取片段中间部分） 图11 gfp测序结果图12 TtrpC测序峰值信号图（选取片段中间部分）图13 TtrpC测序结果第四节 构建pAGT与pEGT目的载体4.1 PactA-T、Pef-T与pGT载体的酶切连接如前述方法，用合适的restriction endonuclease对已连接T Vector的重组质粒PactA-T和pGT载体进行酶切。配制酶切体系（总体积10L）为，试剂加入量（以L计）ddH2O7.910K Buffer0.5BamH I0.3Kpn I0.3PactA-T/Pef-T/pGT1如前述方法，分别对酶切后的PactA-T与pGT，Pef-T与pGT用Solution I进行载体连接。图14 pAGT载体（黑色细圆环部分为pBHt2载体）图15 pEGT载体（黑色细圆环部分为pBHt2载体）4.2 E.coli转化与质粒的提取如前述方法，进行热激法转化，并摇菌，保存菌液，提取质粒。4.3 pAGT与pEGT目的载体的验证4.3.1 酶切验证对pAGT质粒和pEGT质粒分别进行双酶切验证，酶切体系如前4.1所述，同时验证PactA和Pef基因。之后，点样10L，跑电泳，看胶。4.3.2 测序把双酶切验证正确的pAGT和pEGT目的载体备份的菌液从-80取出，置于冰盒上。在50mL大离心管中加入7.5mL左右的LB液体培养基，用枪头挑取一点冰盒里的菌液，至离心管，37摇床中摇菌6-8h，至菌液浑浊后，取出。用移液枪取菌液2mL左右于1.5mL的EP管中，调台式离心机转速为1.2104rpm，离心30s，舍去上清液（收集两次菌液即可），并用枪头吸干净残存的LB培养基。之后，把EP管装入封口膜，连同PactA两端引物和Pef两端引物送去Sangon Biotech公司进行测序。第五节 构建pAGT与pEGT载体实验结果及分析5.1 双酶切验证pAGT、pEGT目的载体如前4.3.1所述对所提取的pAGT质粒和pEGT质粒用BamH I和Kpn I进行双酶切验证。之后，制Agarose凝胶，用电泳仪跑电泳，检测酶切产生的小片段大小，从而验证重组目的载体的正确性。经检测，酶切产生的小片段符合预期大小，认为所构建的pAGT载体和pEGT载体正确。图16 双酶切验证pAGT、pEGT目的载体（图中1泳道是对1个pAGT质粒用Kpn I和BamH I双酶切产生的条带，PactA表示酶切产生的小片段所对应的片段大小，2-3泳道是对2个pEGT质粒用Sal I和BamH I双酶切产生的条带，Pef表示酶切产生的小片段所对应的片段大小，1Kb Marker和D2000 Marker是线状双链DNA基准条带，其片段大小在左侧标出）5.2 测序验证pAGT和pEGT为排除两端测序的不准确，同样地，进行双向测序。pAGT与pEGT测序结果为,图17 PactA上下游测序峰值信号图（选取片段中间部分） 图18 PactA测序结果图19 Pef上下游测序峰值信号图（选取片段中间部分）图20 Pef测序结果第三章 灰霉菌突变体bcagt和bcegt的获得第一节 实验材料1.1 实验试剂ddH2O，Thermus Aquaticus polymerase，10 Taq Buffer，二甲基亚砜（DMSO），dNTP，一对适用引物，克隆模板，Solution I，TAE，EB，10Loading Buffer，LB液体培养基， CH3CH2OH，70%CH3CH2OH，CHCl3，(CH3)2CH2CH2CH2OH，RNase A， 40%甘油，IM固体培养基，IM液体培养基，MM液体培养基，乙酰丁香酮（AS），玻璃纸，95%酒精，LRAK