悬浮细胞图像的计数方法研究.doc

第 28 卷 第 1 期2010年 01 月佳 木 斯 大 学 学 报自 然 科 学 版()Vol . 28 No . 1Journal of J iamusi University (Natural Science Edition)J an.2010文章编号 :1008 - 1402 (2010) 01 - 0009 - 05悬浮细胞图像的计数方法研究朱亚华( 福建师范大学软件人才培养基地 ,福建 福州 350007)摘 要 : 悬浮细胞计数一直是细胞培养技术的重要工具. 从悬浮细胞图像的灰度特点出发 ,探索并实现了适合悬浮细胞图像的计数方法 :通过预处理 ,Canny 边缘检测及形态学处理这三个步 骤来完成分割 ,对分割结果采用种子点法进行区域计数 ,再针对所有含有种子点的区域 ,计算其 内部灰度均值 ,用于区分区域是活细胞还是死细胞. 经实验证明 ,该计数方法误差小 ,速度快 ,很 大程度上减少了细胞计数的工作量.关键词 : 悬浮细胞 ;灰度 ;种子点 ;计数中图分类号 :文献标识码 :TP391 . 41A引言悬浮细胞的特点在灰度方面 ,悬浮细胞图片有两大特点 ,如图1 ( b) 所示.(1) 由于细胞载玻板的厚度不均匀 ,会使得显 微镜光学系统中的光线不均匀 ,进而造成显微图像 中背景照度不均匀2 ,一般情况下 ,整幅图像会出 现中间亮 ,周围偏暗的情况 ,如图 1 (a) 所示.(2) 活细胞为一个暗环 ,暗环上灰度低于暗环 内的灰度及暗环外的背景灰度 ,而死细胞为一个暗 圆 ,暗圆上灰度低于暗圆外的背景灰度 ,并且活细 胞暗环内的灰度高于死细胞暗圆上的灰度 ,如图 1(c) 所示. 其中白色圆圈圈住的细胞为活细胞 ,黑色 圆圈圈住的细胞为死细胞.由于死细胞为一个暗圆 ,暗圆上灰度低于暗圆 外的背景灰度 ,所以死细胞的灰度与背景的灰度差 异较大 ,较容易被准确识别出来. 而想要准确识别 出活细胞的难度则较大 ,因为悬浮细胞整幅图像中 间亮 ,周围偏暗 ,导致活细胞中暗环内的灰度并不绝对高于暗环外背景的灰度 ,两者的灰度差异并不 明显. 因此 ,寻找一种适合的悬浮细胞识别方法 (识 别出活细胞和死细胞) 将有利于细胞计数的进行.01细胞培养技术是当今生命科学各研究领域的基础技术和基本技能 ,它广泛应用于细胞工程 、基 因工程和生物医学工程和干细胞研究等方面. 其中 优生和抗衰老的研究 ,肿瘤 、感染 、创伤和器官移植 等问题的研究 ,都与细胞培养技术相关1 . 细胞培 养是用酶消化法将组织碎块分离成单个细胞 ,用培 养基制成细胞悬液 ,在体外适宜条件下 ,使细胞生 长繁殖 ,并保留其一定的结构和功能特性的一种技术1. 在细胞培养技术的研究中 ,为了观察悬液中细胞的繁殖情况 ,往往需要对所培养的悬浮细胞进行计数 ,并记录其中活细胞数及死细胞数 ,由此来 计算出细胞成活率.细胞成活率 = 活细胞数( 活细胞数 + 死细胞 数) 3 100 % .在传统的医学实验室中 ,通常采用细胞计数板 来计数 ,即在显微镜下用目测法来进行计数. 这种 方法的缺陷在于不仅对计数处理速度慢而且常使得检验人员在长期工作中眼睛极易疲劳 ,进而造成 计数错误. 为了克服目测法的缺陷 ,一部分学者开 始利用计算机图像识别技术来实现细胞自动识别 与计数 ,如血细胞计数2 - 3 ,切片细胞计数4 ,牛奶 体细胞计数5 等 ,但这些细胞计数方法却难以对悬浮细胞进行精确计数. 因此 ,探索一种适合悬浮细 胞的计数方法将是文章的主要任务.悬浮细胞图像分割由于整幅悬浮细胞图像一般会出现中间亮 ,周 围偏暗的情况. 在这种情况下 ,如果采用传统经典2 收稿日期 :2009 - 11 - 09作者简介 :朱亚华(1983 - ) ,女 ,福建漳浦人 ,福建师范大学软件人才培养基地助教 ,硕士 ,研究方向 :图形图像处理.的阈值分割算法6 分割图像 ,则容易出现将细胞错分为背景 ,或将背景错分为细胞的情况 ,从而将更难以获得理想的分割结果 ,如图 2 所示.虽然整幅悬浮细胞图像中间亮 ,周围偏暗 ,给悬浮细胞图像的正确分割造成一定的难度 ,但悬浮 细胞图像还存在另一个特点 : 活细胞为一个暗环 ,暗环上灰度低于暗环内的灰度及暗环外的背景灰 度 ,死细胞为一个暗圆 ,暗圆上灰度低于暗圆外的背景灰度 ,即暗环上的灰度及暗圆上的灰度均低于 背景灰度. 这样 ,采用边缘检测方法就可以将暗环及暗圆标识出来 ,也就标识出了所有细胞.传统微分边缘检测的方法很多 , 主要算子有 Sobel , Roberts , Gaussian ,LOG ,Laplacian 等 , 而 Canny 算子是目前最好的微分边缘检测算子. Canny 算子 之所以比较优越 ,在于它用两个不同的阈值来检测强边界和弱边界 ,当一个弱边界和一个强边界连通时 ,在输出强边界的同时输出弱边界 ,否则弱边界 不会被输出 ,这样做的目的是去除噪声对边界检测 的干扰 , 同时又不会丢失弱边界信息7 . 而 Canny算子同时检测强边界和弱边界的方法非常适合于 悬浮细胞图像 ,因为活细胞暗环上的灰度值有些较低 ,有些较高 ,较低的部分与暗环内 、外的灰度差值较大 ,是强边界 ,而较高的部分与暗环内 、外的灰度 差值较小 ,是弱边界 ,死细胞暗圆上的灰度也存在类似的情况.由于细胞图像在采集过程中往往会被一些噪声“污染”,为了更准确地进行边缘检测 ,应先对图片进行预处理. 消除噪声完再进行 Canny 边缘检 测. 边缘检测过程中 ,由于与强边界不连通的弱边界没被输出 ,所以部分细胞的边缘不会完全闭合 ,需要进行闭合操作 ,可以采用形态学的“闭操作”进行处理. 因此 ,可以通过预处理、Canny 边缘检测及形态学处理这三个步骤来完成悬浮细胞图像的分割.2 . 1预处理在细胞图像的采集过程中 ,受显微镜视野中照度不均匀 、人体会自觉或不自觉地运动等因素的影 响 ,图像中往往会出现一些不规则的随机噪声 ,这 将影响图像的质量. 而如果采用中值滤波算法8 , 则可以有效地消除随机噪声 ,效果如图 3 所示. 可以观察得出 ,经中值滤波处理后 ,活细胞暗环上的灰度与暗环外的背景灰度差值增大了 ,同时 ,死细 胞暗圆上的灰度与暗圆外的背景灰度差值也增大 了. 因此 ,所有悬浮细胞边缘与背景的对比度大大提高了 ,这将有利于边缘检测的进行.2 . 2Canny 边缘检测Canny 算子是一种应用很广的边缘检测算子 ,它能同时检测强边界和弱边界的方法非常适合于第 1 期朱亚华 :悬浮细胞图像的计数方法研究11悬浮细胞图像. 该方法的步骤如下8 :(1) 采用平均值法将原图转化为灰度图.(2) 对灰度图进行高斯平滑滤波处理 ,高斯卷 积核 Gaussian mask 见式 (1) .(5) 由梯度方向 orient 计算出边缘方向 edgeDi2rection ,见式 (5) .(6) 根据边缘方向 edgeDirection 计算左邻域灰 度值 leftPixel 及右邻域灰度值 rightPoxel .(7) 如果 sum 小于 leftPixel 或 rightPixel ,则 sum 值设为 0 . 否则通过设置高阈值 HT、低阈值 LT 来 计算 sum 值 :如果 sum 大于等于 HT ,则 sum 值设为255 ;如果 sum 小于 LT , 则 sum 值设为 0 ; 如果 sum 大于 LT 并且小于 HT , 检查该点的八邻域的灰度 值 ,只要八邻域中有一个点的灰度值大于 HT , 则 sum 值设为 255 ,否则 sum 值设为 0 . 并且规定 sum 值为 0 时 ,该点代表非边缘点 ; sum 值为 255 时 ,该点代表边缘点.(3) 平滑后的图像分别与 Sobel 算子的水平和垂直方向卷积核进行卷积运算 , Sobel 水平方向卷 积核 GX Sobel mask 见式 ( 2) , Sobel 垂直方向卷积核 GY Sobel mask 见式 (3) . 由水平卷积运算获得水平梯度值 sum X ,由垂直卷积运算获得垂直梯度值 sum Y ,再通过 sum X 和 sum Y 计算总梯度 值 sum.(4) 由梯度值 sum X 和 sum Y 计算梯度方向orient ,见式 (4) .245424912945121512549129424542 (1)& sum Y- 1- 2- 110- 1000121GX Sobel mask =(2)Gaussian mask 5 5 =20- 210- 1(3)GY Sobel mask = 0= 0X0 . 0 ,90 . 0 ,sumsum& sum Y 0X = 0(4)orient =180 - atan ( (float) ( sum Y ) (float) (| sum X | ) ) 3 (180) ,sum X 0180 - atan ( (float) (| sum Y | ) (float) ( sum X ) ) 3 (180) ,sumX 0 & sum Y 0atan ( (float) ( sum Y ) (float) ( sumX) ) 3 (180) ,sum X 3 sumY 0 & sum X 00 ,0 orient 22 . 5 157 . 5 orient 18022 . 5 orient 67 . 567 . 5 orient 112 . 5112 . 5 orient 157 . 545 ,90 ,135 ,(5)edgeDirection =在 Canny 边缘检测过程中 , 图像经过平滑之后 ,边缘会有所扩散 ,因此必须采用非最大抑制来 降低非边缘的影响. 通过非最大抑制运算之后 ,只 有比较明显的边缘信息最终能被保留下来 ,如图 4 所示 ,其中黑色部分的像素值为 0 ,是背景区域 ,白色部分的像素值为 255 , 是目标区域. 通过实验检 测可以看出 ,Canny 边缘检测处理的结果是较为理 想的 ,因为所有细胞的边缘都被标识出来了 ,并且去除了绝大部分的杂质 ,尽管有些边缘比较明显的杂质也被标识出来 ,但在实验允许的误差范围内.2 . 3形态学处理在经过 Canny 边缘检测处理后 ,所有细胞的边缘都被标识出来. 但是 ,部分细胞的边缘却并未完 全闭合 ,这就给后续的计数处理带来诸多不便. 为 解决这一问题 ,我们可以对图像进行形态学处理的闭操作 ,即“先膨胀后腐蚀”. 膨胀可以多次进行 ,直至细胞边缘闭合 ,如图 5 所示. 图 5 中的一些细胞 存在内部孔洞 ,这对使用腐蚀来取得骨架的算法是非常不利的 ,因为腐蚀外边的同时 ,内部的孔洞也开始扩大 ,很难得到正确的结果. 这时就需要使用 填充孔洞的算法来更正.填充孔洞的原理9 :通过 Canny 边缘检测处理后 ,背景区域的像素值为 0 , 目标区域的像素值为255 . 填充孔洞的时候 ,先统计所有连通的非目标区域的面积 ,总是会有一个或者几个面积特别大的区 域 ,其他都是面积相对较小或者很小的区域. 较小或者很小的往往就是需要填充的孔洞了. 填充结果如图 6 所示.在填充孔洞处理后 ,须对图像进行腐蚀操作.这时可以多次腐蚀 ,直到得到理想的结果 , 如图 7所示.在通过中值滤波 、Canny 边缘检测及“闭操作”这三个步骤完成对悬浮细胞图像分割后 ,得到的分 割结果较为理想 ,如图 7 所示 ,所有细胞都被识别出来了 ,很好地提高了细胞计数的准确性.的内部灰度均值具体方法为 :(1) 根据种子点的位置特点确定细胞重心. 因 为距离值最大的那些点位于区域的中心 ,并且每个 区域的距离最大点数量极少 ,而种子点是距离最大 点中的一个 ,所以种子点的位置可以近似看作细胞 的重心.(2) 根据悬浮细胞的统计特点确定细胞半径. 所处理的细胞大小比较均匀 ,99 %以上的细胞半径 不超过 12 个像素.(3) 计算得到细胞内部灰度均值. 从 (1) 、(2) 两 个特点可以看出 , 每个区域可以被以种子点为中 心 ,以 12 个像素为半径的圆形完全覆盖. 在原图(见图 1 ( b) ) 上 ,针对每个区域 ,计算以该区域的种 子点为中心 ,以 12 个像素为半径的圆形范围内的 灰度均值. 计算所得到的灰度均值即为细胞内部灰 度均值.根据上面计算得到的灰度均值区分活细胞与死细胞 ,高于某一阈值的为活细胞 ,低于这一阈值 的为死细胞 ,计数结果如图 8 所示 ,其中白色圆圈 圈住的代表活细胞 ,黑色圆圈圈住的代表死细胞. 图 8 中 ,活细胞和死细胞都被搜索到了 ,并且正确 地区分出了活细胞与死细胞.悬浮细胞计数细胞计数的常用方法有两种 : 一是链码跟踪 法 ;二是种子点法. 对悬浮细胞图像进行计数 ,种子 点法有两大优点是链码跟踪法无法比拟的 : 第一 , 种子点法的计数速度比链码跟踪法更快 ; 第二 ,在 细胞粘连的情况下 ,种子点法比链码跟踪法更容易 获取各个粘连细胞的重心.种子点法的计数处理10 : (1) 对形态学处理完 的二值图像 ( 见图 7) 做距离变换. ( 2) 搜索距离变 换图中距离值最大的种子点来形成线段表. ( 3) 对 线段表进行检查 ,消除分裂区域中的较小者 ,使每 个区域最终只留下一个种子点 ,并建立种子点表. (4) 检查种子点的距离值是否超过某个阈值 ,如果 超过说明该种子点是杂质 ,应该滤除. (5) 按种子点 表将种子点逐个绘制出来 ,并统计区域数.33 . 1计算内部灰度均值种子点法有效统计出总的区域数 ,但是在区分区域为活细胞还是死细胞的准确性上仍不甚理想. 为了更为准确地区分活细胞与死细胞 ,须计算区域 的内部灰度均值. 因为活细胞的暗环内灰度高于死 细胞的暗圆上灰度 ,所以内部灰度均值高于某一阈 值的为活细胞 ,低于这一阈值的为死细胞. 根据种 子点的位置特点及悬浮细胞的统计特点 ,计算区域3 . 2计数实验及分析以 100 张分辨率为 1280 3 1024 的悬浮细胞图像作为计数样本 ,在 WindowsXP 系统下 , CPU 为 1 .70 G ,内存为 256M ,采用 VC + + 进行编程 ,最长计 数时间为 17 . 36s ,最短计数时间为 15 . 47s ,平均的计数时间为 16 . 42s ,远远小于人工计数时间 ,并且第 1 期朱亚华 :悬浮细胞图像的计数方法研究13区分细胞与杂质的误差较小 , 最大相对误差为 4 .4 % ,最小相对误差为 1 . 3 % ,平均误差为 2 . 9 % ,区 分活细胞与死细胞的误差就更小了 ,平均误差接近于 0 .实践证明 ,本文采用的细胞计数方法不仅计数 时间短而且相对误差小 ,取得了令人满意的结果.细胞面积相近的杂质 ,降低边缘区域细胞及粘连面积较大的细胞的计数误差 ,将是后来研究的一种有 益探索.参考文献 :1程宝鸾. 动物细胞培养技术 M . 广州 : 中山大学出版社 ,2006 ,3 - 4 .苑玮琦 ,张田文. 血细胞图像的计数方法研究J . 计算机应用 与软件 ,2005 ,17 (5) ,61 - 64 .Ma Yide ,Dai Rolan ,Li Lian. A Counting and Segmentation Method of Blood Cell Image with Logical and Morphological Feature of Cell J . 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