蓝莓叶总黄酮的提取及其定性分析.docx

第 48 卷（第 4 期） vol.48，no.4蓝莓叶总黄酮的提取及其定性分析李颖畅 1，吕艳芳 2（1.渤海大学化学化工与食品安全学院，辽宁锦州 121013；2.辽宁省高校食品质量安全与功能食品研究重点实验室，辽宁锦州 121013）摘 要：以蓝莓叶为原料，采用溶剂法对蓝莓叶总黄酮进行提取和定性分析。比较不同溶剂对蓝莓叶总黄酮的提取效果，确定乙醇为最佳提取溶剂。考察了乙醇浓度、料液比、浸提时间、浸提温度对蓝莓叶总黄酮提取的影响，确定乙醇提 取蓝莓叶总黄酮的最佳提取工艺参数：乙醇体积分数为 70%，料液比为 120（g/ml）， 浸提时间为 120min， 浸提温度为70。在此条件下进行提取，蓝莓叶黄酮提取率为 6.95%。通过颜色反应和紫外-可见光谱确定蓝莓叶提取物为黄酮类物质。关键词：蓝莓叶；总黄酮；溶剂法；提取； 定性分析中图分类号：ts207.3文献标识码：a文章编号：1674-506x（2012）04-0032-0005the extraction and qualitative analysis of total flavoniodsfrom blueberry leavesli ying-chang， lv yan-fang（1.college of chemistry，chemical engineering and food safety，bohai university，jinzhou 121013，china；2.liaoning province key laboratory of of functional food，food quality and safety，jizhou 121013，china）abstract： solvent extraction and qualitative analysis of total flavoniods from blueberry leaves were studied. ethanolwas the most selective for extracting total flavoniods from blueberry leaves using different solvent. the effects of dif- ferent experimental conditions， such as ethanol concentration， material to liquid ratio， extraction time and extraction temperature， on the yield of total flavoniods were investigated. the results showed that optimum conditiuons were ethanol concentration of 70%， ratio of raw material to liquid of 120（g/ml）， extration time of 120min and extraction temperature of 70. under these conditions， a maximum yield of total flavonoids was 6.95%. extractions of blueberry leaves belong to flavoniods by color reaction and absorption spectrum.key words： blueberry leaves； total flavoniods； solvent method； extraction； qualitative analysisdoi：10.3969/j.issn.1674-506x.2012.04-009蓝莓（blueberry），又称越橘、蓝浆果，乌饭树，属杜鹃花科（ericaceae）越橘属（vaccinium.spp）多年生 落叶或常绿灌木。蓝莓作为一种药食两用植物，蓝莓 叶具有利尿、消炎、解毒之功效，并可用于风湿、痛风 等1。蓝莓叶中含有粗蛋白、粗纤维、脂肪酸、甾醇、 萜类、矿质元素、氨基酸、有机酸、维生素、糖类和大 量黄酮类化合物。在中国，蓝莓叶汁作为防腐剂用在米饭、蛋糕上已经有几个世纪了2-3。skupie 等研究表明蓝莓叶提取物能够抑制白血病 hl60 细胞系的生长，抑制能力大约是草莓和树莓提取物的 2 倍4。 王立等研究表明蓝莓叶水提取物和醇提取物具有降 血糖作用， 蓝莓叶醇提取物降血糖作用是和蓝莓叶 中含有大量黄酮化合物分不开的5。同时，王立等研 究发现乌饭树叶及其提取液对兔眼视网膜电流图有收稿日期：2012-04-23基金项目：辽宁省教育厅高校重点实验室项目（ls2010003）作者简介：李颖畅（1973-)，女，副教授，博士，研究方向：农产品加工与贮藏，e-mail:第 48 卷（总第 170 期）李颖畅等：蓝莓叶总黄酮的提取及其定性分析33一定的影响，能明显改善并提高视网膜功能，对眼睛具有明显的保护作用6。李颖畅与孟宪军发现蓝莓 叶总黄酮具有较强的清除氧自由基作用， 抑制脂质 过氧化7。为了使蓝莓叶资源得以综合开发利用，为 营养、 保健价值的全面评价及其深层次加工成功能 性食品、药品提供一定的依据，笔者对蓝莓叶有效成 分黄酮类化合物进行了提取和测定， 并对蓝莓叶黄提取溶剂的选择配制几种提取溶剂（60%甲醇、60%乙醇、60%丙 酮 、60% 乙 酸 乙 酯 ， 在 温 度 70 ， 料 液 比 1 20 （g/ ml）， 浸提 90min， 取一定量提取液定容至 25ml 容 量瓶中，按 1.2.1 方法加入显色剂，测定吸光度，计算 提取率，筛选出合适的提取溶剂。1.2.4蓝莓叶黄酮提取的单因素试验取 5g 蓝莓叶粉末，以乙醇为提取溶剂依次对其 进行溶剂浓度、料液比、提取时间及提取温度的单因 素试验。1.2.5确定最佳工艺条件的正交试验在单因素试验的基础上， 选择乙醇浓度、 料液 比、提取温度进行正交实验设计，采用 l9（34）正交表 进行试验，确定最佳工艺参数。1.3数据处理采用 excel 进行数据处理 ，dps 软件进行统计 分析，差异显著性比较使用 duncan 新复极差法，实 验数据用x軃 s 表示。2结果与分析2.1蓝莓叶黄酮在可见光区的吸收光谱按 1.2.1 加入显色剂，对芦丁和蓝莓叶总黄酮进 行 400-800nm 波长扫描可知（图 1），蓝莓叶提取物 和芦丁的可见吸收光谱相一致 ， 最大吸收波长为500nm，由此说明蓝莓叶提取物中有芦丁，属于黄酮 类物质。1.2.3酮类成分进行了定性分析，源具有重要意义。1材料与方法1.1材料与仪器1.1.1材料与试剂这对充分利用蓝莓叶资蓝莓叶：沈阳农业科技开发院，10 月份采收。芦丁，生化试剂（br），中国药品生物制品检定 所；乙醇、氢氧化钠、石油醚、亚硝酸钠、硝酸铝、三氯 化铝、盐酸、锌粉、乙酸铅（均为分析纯）。仪器与设备7200 型可见分光光度计：1.1.2上海尤尼柯有限公司；tu1901 型双光束紫外-可见分光光度计：北京普析通用仪器有限公司；fe220 型粉碎机：北京市光明 医疗仪器厂；fa2004 电子分析天平： 上海恒平科学 仪器有限公司；电热恒温水浴锅：常州国华电器有限 公司；shg-型循环水真空泵： 上海亚荣生化仪器 厂；dzf-6050 型真空干燥箱：上海精宏仪器设备有 限公司。1.2 方法1.2.1 工作曲线回归方程的建立精确称取 200mg 芦丁标准品，用体积分数 70 乙醇溶解，定容至 100ml 容量瓶中。精确移取芦丁 溶液 12.5ml 于 50ml 容量瓶中， 用去离子水定容， 得 到 0.5mg/ml 芦 丁 标 准 溶 液 。 分 别 吸 取 0.0ml、0.8ml、1.6ml、2.4ml、3.2ml、4.0ml 芦丁标准溶液于25ml 容量瓶中， 加入 1ml 质量分数 5nano2，放0置 6min 后， 加入 1ml 质量分数 10硝酸铝，放置400500600波长/nm7008006min，再加入 10ml 质量分数 4naoh，用去离子水定容至刻度，摇匀，放置 15min，进行全波长扫描，在500nm 处有最大吸收。 以测定结果得芦丁浓度与吸 光度的标准曲线 ：y =4.2087x -0.0138 （x： 浓 度 ，mg/ ml；y：吸光值），r2=0.9996。1.2.2 蓝莓叶黄酮吸收光谱移取适量蓝莓叶黄酮提取液于 25ml 的容量瓶 中，按 1.2.1 方法加入显色剂，在 400-800nm 波长下 扫描，得到蓝莓叶黄酮可见区吸收光谱。图1蓝莓叶黄酮吸收光谱fig.1 the absorption spectrum of flavonoids from blueberry leaves2.2不同溶剂提取蓝莓叶黄酮的比较从表 1 可以看出， 乙酸乙酯和乙醇溶液对蓝莓 叶总黄酮提取率较高，与甲醇、丙酮作为提取溶剂相 比差异显著（p0.05），但观察颜色发现，乙酸乙酯的 提取物颜色较深，有可能是叶绿素含量较高，影响了吸光度蓝莓叶黄酮 芦丁342012 年第 4 期比色反应条件，使结果偏大。考虑到黄酮的提取率、提取物的安全性及乙醇价格便宜、能循环利用，选择 乙醇作为蓝莓叶总黄酮提取的适宜溶剂。用量，有利于黄酮由原料向浸提液扩散，增加黄酮的浸出率，但溶剂用量过大会造成溶剂的浪费。料液比 为 120、130、140（g/ml）的黄酮提取率与料液比为110 （g/ml） 的黄酮提取率差异 显 著 （p0.05）， 料 液比 120、130、140（g/ml）之间黄酮提取率差异不显 著（p0.05）。因此综合考虑提取率、溶剂用量、溶剂 回收等方面因素，选用料液比 120（g/ml）进行蓝莓 叶总黄酮的提取。表 1不同提取溶剂的提取效果的比较tab.1comparison to extraction effect in differentorganic solvent溶剂类型甲醇乙醇丙酮 乙酸乙酯提取率/%5.880.17b 6.210.13a 4.060.10c 6.290.15a注：不同字母表示不同溶剂之间提取率差异显著（p0.05）。8.07.06.05.04.03.02.01.00.02.3 乙醇浓度对蓝莓叶黄酮提取率的影响在水浴温度 70，浸提时间 90min，料液比 120（g/ml）的实验条件下，考察乙醇浓度对蓝莓叶总黄 酮提取率的影响。从图 2 可以看出，在一定浓度范围 内，随着乙醇浓度的增加，黄酮提取率增加。乙醇浓 度为 50%、70%黄酮提取率比较高，与其他 2 种乙醇 浓度相比黄酮提取率差异显著（p0.05），但二者黄 酮提取率无显著性（p0.05）差异，因此乙醇浓度为50-70%。这与不同研究者从不同的材料中提取黄酮 所用乙醇浓度的范围是一致的， 例如巨敏等从枸杞 中提取总黄酮所用乙醇浓度为 68.3%8。 可能是因 为随乙醇浓度的增加，溶剂的渗透能力也随之增加， 有利于黄酮的溶出，但乙醇浓度过大时，极性过低反 而不利于黄酮的溶出。0110012001300140料液比/gm l- 1图3 料液比对蓝莓叶黄酮提取率的影响fig.3 the effect of rate of material fluid on extraction rate of flavonoids from blueberry leaves2.5 浸提时间对蓝莓叶黄酮提取率的影响在乙醇浓度 50%，水浴温度 70， 料液比为 120（g/ml）条件下，考察提取时间对黄酮提取率的影 响。 从图 4 可以看出， 在 120min 内， 随着浸提时间 增加， 黄酮类化合物的 提 取 率 增 加 ，30min、60min、90min、120min 黄酮提取率差异显著 （p0.05）。 当 浸提时间超过 120min 后， 黄酮类化合物的 提 取 率 下降，120min 、150min 二者黄酮提取率差异不显著（p 0.05），120min 为最佳提取时间 。 开 始 时 ， 提 取 时间的增加， 增加了黄酮类化合物在乙醇中的溶 解 ， 因 此 提高了其提取率 ； 随着提取时间的延长 ， 会使其他醇溶性物质同时被溶解提取 ， 妨碍了黄 酮类化合物的溶解度， 其他醇溶性杂质的存在会 对实验结果的准确性产生影响 ， 需对提取时间加 以控制9 。2.6 温度对蓝莓叶黄酮提取率的影响在乙醇浓度 50% ， 料液 比 为 120 （g/ml）， 浸 提 时间为 90min 条件下， 考察浸提温度对黄酮提取率 的影响。从图 5 可以看出，在一定温度内，随着浸提 温度的升高，黄酮提取率提高，80时黄酮提取率略 有下降。温度的增加黄酮提取率增加，主要是因为温8.07.06.05.04.03.02.01.00.03050乙醇浓度/%7090图2 乙醇浓度对蓝莓叶黄酮提取率的影响fig.2 the effect of ethanol concentration on extraction rate of flavonoids from blueberry leaves2.4 料液比对蓝莓叶提取率的影响在乙醇浓度 50%， 浸提时间 90min， 水浴温度70的条件下， 考察料液比对蓝莓叶总黄酮提取率 的影响。由图 3 可知，随提取液用量的增加，提取液 中黄酮类化合物的提取率增大， 这是因为增加溶剂提取率/%提取率/%第 48 卷（总第 170 期）李颖畅等：蓝莓叶总黄酮的提取及其定性分析35表 2 正交试验结果tab.2 results of orthogonal test8.07.06.05.04.03.02.01.00.0试验号 a 乙醇浓度/% b 料液比/g/ml c 温度/ 提取率/%123456789k1k2k3k150505060606070707017.1617.9620.015.725.996.670.9501150120012501150120012501150120012518.3719.6817.086.126.565.690.866770758075807080707517.9419.1718.025.986.396.010.415.656.385.346.486.956.58306090提取时间/m in120150图4 浸提时间对蓝莓叶黄酮类化合物提取率的影响fig.4the effect of time on extraction rate offlavonoids from blueberry leaves8.07.06.05.04.0kk23r3.02.01.00.0表 3数据方差分析tab.3variance analysis of the orthogonal test变异来源平方和自由度均方f 值显著水平405060708090温度/ab c误差1.44061.12670.31580.032622220.720280.563340.157880.0163*图5温度对蓝莓叶黄酮提取率的影响fig.5 the effect of temperature on extraction rate offlavonoids from blueberry leaves注：f0.05（2，2）=19.0，f0.01（2，2）=99.0。度能够增加溶质的溶解度和扩散系数10。温度增加到一定程度黄酮提取率下降， 可能是因为黄酮的稳 定性下降。40、50、60、70之间黄酮提取率差 异显著（p0.05），70、80黄酮提取率差异不显著（p0.05），因此提取温度为 70-80。2.8蓝莓叶黄酮颜色反应（1） 紫外灯照射 ： 将样品水溶液滴几滴于滤纸 上，置于紫外灯下照射，呈现黄绿色荧光，说明有黄 酮类化合物。（2）zn-浓盐酸检验：在样品的乙醇或甲醇溶液 中加入少许 zn 粉振摇，再加几滴浓盐酸 1-2min（必 要时水浴上加热）显红色，说明有黄酮、黄酮醇类、二 氢黄酮类和二氢黄酮醇类。（3）1% 三氯化铝醇溶液 ： 将 2 -3mg 样 品 溶 于 乙醇溶液中 ， 加 2-4ml 1% 三氯化铝醇溶液 ， 置于 紫 外 灯 下 观 察 。 有 黄 绿 色 荧 光 ， 说 明 有 黄 酮 类 、 黄 酮醇类。（4）铅盐反应：将 1%乙酸铅溶液加入样品的乙 醇溶液中，可生成黄至红色沉淀，说明蓝莓叶提取物 中含有酚基，酚基是黄酮类化合物的官能团之一，根正交试验从表 2 的 r 值可以看出，影响提取效果的因素 排序为 abc，从方差分析结果看（表 3），乙醇体积 分数和料液比对黄酮提取率影响较大， 不同水平之 间差异显著（p0.05）。提取溶剂 70%乙醇与 50%乙 醇 、60% 乙醇相比黄酮提 取率差异显著增加 （p 0.05），取乙醇浓度为 70% 。 料液比 120 （g/ml） 相对料 液 比1 15、1 25 （g/ml） 黄酮提取率差异显著 （p 0.05）， 料液比为 120 （g/ml）。 温度的 3 个水平差异 不显著， 考虑乙醇沸点和节省能源 ， 选择温度为70。2.7提取率/%提取率/%362012 年第 4 期据颜色的深浅来判断羟基数目及位置。3结论leaves against sensitive and multidrug resistant hl60cellsj. cancer letters，2006（236）：282-291.wang l，zhang x t， zhang h y. effect of vaccinium bracteatum thunb. leaves extract on blood glucose and plasma lipid levels in streptozotocin -induced diabetic mice j. journal of ethnopharmacology，2010 （130）：465-469.王立，张雪彤，姚惠源.乌饭树树叶及其提取物对视网膜 光损伤的保护作用 j. 西安交通大学 学 报 （ 医 学 版 ），2006，27（3）：284-287，303.李 颖 畅 ， 孟 宪 军. 蓝莓叶黄酮提取物抗氧化活性的研 究 j.营养学报，2008，30（4）：427-429.巨敏，杨鹏，朱沛沛，等.二次回归正交优化枸杞中总黄 酮提取工艺的研究j.中国酿造，2011（10）：94-96.朱 珠 ， 冷 进 松. 响应面分析法优化仙人掌黄酮提取工 艺 j . 食品科学，2010，31（22）：185-189.5蓝莓叶黄酮在可 见光区最大吸收波长为 3.1500nm。3.2该蓝莓叶黄酮最佳提取工艺参数为：乙醇浓度 为 70%，料液比为 120（g/ml），浸提时间为 120min， 浸提温度为 70。 采用最佳工艺条件进行提取，确定蓝莓叶总黄酮含量约为 6.95%。3.3通过颜色反应和紫外可见吸收光谱确定蓝莓 叶提取物为黄酮类物质。678参考文献1马 田 田. 笃斯越桔叶营养成分分析 j. 特 产 研 究 ，2001（1）：19-21.魏国华，许新德，邵斌，等.天然食品防腐剂-乌饭树叶提 取物j.中国食品添加剂，2008（6）：143-145.章海燕，王立，张晖.乌饭树树叶水溶性黄酮的抑菌作用 的研究j.中国食品添加剂，2010（5）：62-67.skupie k，oszmiaski j，kostrzewa-nowak d. in vitro antileukaemic activity of extracts from berry plant9210 pinelo m， rubilar m， jerez m， et al. effect of sol-vent， temperature， and solvent -to -solid ratio on the total phenolic content and antiradical activity of ex- tracts from different components of grape pomace j.j. agric. food chem，2005，53（6）：2111-2117.34（上接第 31 页）具有明显的保鲜效果 。 自发气调贮藏可以有效的 保持西兰花中维生素 c、 叶绿素和可溶性固形物 ethylene biosynthesisenzymes and ethylene receptors inpost-harvest broccoli j. plant growth regul，2009，57（3）：223-232.徐斐燕，蒋高强，陈健初.臭氧在鲜切西兰花保鲜中应用 的研究j.食品科学，2006，27（6）：254-257.庄荣福，胡维骥，林光荣，等.辐射对青花菜生理生化指 标及保鲜效果的影响j.亚热带植物科学，2002，31（3）：16-18.gnanasekharan v， shewflet r l， chinnan m s. de-tection of color changes in gree