（生物物理学专业论文）活体细胞多维图象科学可视化方法的研究.pdf

华中科技大学硕士学位论文 摘要 科学可视化是指运用计算机图形学和图象处理技术，将科学计算过程中或者 是计算结果的数据转换为直观的图形或图象，在屏幕上显示出来并借助于交互技 术进行处理的理论方法或技术。可视化技术作为一项帮助科学研究及生产实践的 强有力的工具，发挥着越来越重要的作用。 本文的工作针对活体细胞内囊泡的空间位置和运动过程研究中的经反卷积算 法恢复后的多维荧光显微图象，根据可视化工作的需求，研究了科学可视化的主 要方法及相应的算法，并提出一些有效的方法使可视化技术更好的应用在活体细 胞多维反卷积图象的研究中。 本文的研究内容主要分为四个部分。第一部分介绍了所使用的荧光显微系统 和深入研究三维荧光反卷积显微技术，这是实验中可视化的数据来源和基础。第 二部分首先介绍科学可视化的对象、过程和观察方法，然后详细研究了可视化常 用的两类方法面绘制和直接体绘制方法，重点研究了这两类方法的经典算法移动 立方体算法和光线投射法。第三部分重点研究了将四维荧光反卷积显微技术和科 学可视化相结合来研究活体细胞中囊泡运动的方法和过程。最后一部分首先介绍 了可视化软件包的实现基础一可视化工具集v t k ，然后着重讨论了可视化软件包 v o l v i s i o n 的主要框架和功能。 关键词：科学可视化三维荧光反卷积显微技术四维荧光反卷积显微技术 面绘制直接体绘制可视化工具集 i 华中科技大学硕士学位论文 a b s t r a c t s c i e n t i f i cv i s u a l i z a t i o nc a l lb eu s e dt od e a lw i t h p r o c e s s i n go rp r o c e s s e ds c i e n t i f i c d a t aa n dt o d i s p l a yt h e mo nt h es c r e e ns oa st oa n a l y z ea n dp r o c e s st h e s ei m a g e s i n t e r a c t i v e l yb yi m a g ep r o c e s s i n ga n dc o m p u t e rg r a p h i c st e c h n i q u e v i s u a l i z a t i o ni s m o r ea n dm o r e i m p o r t a n t a sap o w e r f u lt o o lu s e di ns c i e n t i f i cr e s e a r c ha n d p r a c t i c e t h ep u r p o s eo ft h i sp a p e rf o c u so nt h em u l t i - d i m e n s i o n a ld e c o n v o l u t i o ni m a g e s u s e dt oo b s e r v et h es p a t i a lp o s i t i o na n dm o b i l i t yo f s e c r e t o r yv e s i c l e so fl i v i n gc e l l t o m e e tt h en e e d so fs c i e n t i f i c v i s u a l i z a t i o n ，t h ec l a s s i c a lm e t h o d sa n dc o r r e s p o n d i n g a l g o r i t h m sa r es t u d i e d ，a n dt a b l eau s e f u lp r o p o s a lf o rt h ea p p l i c a t i o no fv i s u a l i z a t i o no f t h em u l t i d i m e n s i o n a ld e c o n v o l u t i o n i m a g e so f l i v i n gc e l l ， t h i s p a p e rc o n s i s t s o ff o u r p a r t s t h e f i r s t p a r t c o n c e r n si n d i g i t a li m a g i n g m i c r o s c o p es y s t e ma n dt h r e e d i m e n s i o n a lf l u o r e s c e n c em i c r o s c o p yt h a tw e u s e di nt h e p r o j e c t ，t h e y a r et h eb a s i so fo u rw o r k 、i nt h es e c o n dp a r t ，w ed i s c u s st h e o b j e c t s ， p r o g r a m a n d o b s e r v i n g m e t h o d so fs c i e n t i f i cv i s u a l i z a t i o n t h e nt w of a m i l i a r v i s u a l i z a t i o nm e t h o d s ，i s o s u r f a c er e n d e r i n ga n dd i r e c tv o l u m er e n d e r i n g ，a r es t u d i e d t w oc l a s s i c a la l g o r i t h m s ，m a r c h i n gc u b e sa n dr a yc a s t i n g ，c o r r e s p o n d e dt ot h et w o m e t h o d sa r ed e m o n s t r a t e da n du s e dt o p r o c e s st h et h r e e d i m e n s i o n a l d e c o n v o l u t i o n i m a g e so f f l u o r e s c e n c eb e a d a n dr a tp a n c r e a t i cpc e l l s t h en e x t p a r to f p a p e r c o n c e r n e d i nt h em e t h o da n d p r o g r a m t or e s e a r c ht h es p a t i a ld i s t r i b u t i o na n d m o b i l i t yo fs e c r e t o r y v e s i c l e so f l i v i n gc e l l ，u s i n g t h ec o m b i n a t i o no ff o u r d i m e n s i o n a lf l u o r e s c e n c e m i c r o s c o p ya n ds c i e n t i f i c v i s u a l i z a t i o n i nt h el a s t p a r t ，t h ev i s u a l i z a t i o nt o o l k i t i s i n t r o d u c e dw h i c hi st h ek e yt e c h n i q u et or e a l i z et h ev i s u a l i z a t i o ns o f t w a r ev o l v i s i o n ， t h e nd i s c o u r s e do nt h es t r u c t u r ea n df u n e l i o n so fv o 】v i f i o n k e y w o r d s ：s c i e n t i f i c v i s u a l i z a t i o n ，t h r e e - d i m e n s i o n a l f l u o r e s c e n c ed e c o n v o l u t i o n m i c r o s c o p y ，f o u r - d i m e n s i o n a lf l u o r e s c e n c ed e c o n v o l u t i o nm i c r o s c o p y ， i s o s u r f a c er e n d e r i n g ，d i r e c tv o l u m er e n d e r i n g ，t h ev i s u a l i z a t i o nt o o l k i t i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他 个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集 体，均己在文中以明确方式标明。本人完全意识到，本声明的法律结果由本人承 担。 学位论文作者签名：憩侵 日期：妒f 年月知日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有 权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和 借阅。本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据 库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密口，在年解密后适用本授权书。 本论文属于不保密d ( 请在以上方框内打“4 ”) 学位论文作者签名：楚l 伏 日期：弘峁年谚月妒日 指导教师签名慨迎 日期：d 车年牛月f f 日 本文工作由国家自然科学基金( 6 0 0 7 1 0 3 0 ) 、国家 自然科学基金重点项目( 3 0 1 3 0 2 3 0 ) 和国家杰出青年基 金项目f 3 0 0 2 5 0 2 3 ) 资助。 华中科技大学硕士学位论文 1 1 引言 1 绪论 近年来的研究表明，细胞对胞内各种活动存在着空间特异的调节功能。对胞 内钙库和分泌活动关系的研究也表明，不同胞内钙库对分泌的激发效率是不同的， 说明不同钙库与分泌囊泡的空间位置不同。因而，研究囊泡的空间分布和定位， 对于了解细胞如何对分泌活动实现空间特异的调控有着重要意义。 为观察分泌囊泡和钙离子在细胞内的空间特性，m c n a l l y 等【1 】提出了三维荧光 反卷积显微成象技术( t h r e e d i m e n s i o n a lf l u o r e s c e n c ed e c o n v o l u t i o nm i c r o s c o p y ) 。在 弱荧光条件下沿显微镜光轴采集细胞样本的二维光学切片图象，然后应用反卷积 ( d e c o n v o l u t i o n ) 图象恢复算法对因受到焦外光影响而变得模糊的原始图象进行恢 复，在一定程度上改善图象，力求再现图象的本来面目。然后以反卷积恢复后的 三维图象进行三维重建或可视化处理，以观察和研究细胞内囊泡大小和空间位置 分布。最终目的是对细胞样本连续成象以跟踪细胞的分泌过程，研究胞内分泌囊 泡的转运、锚定、准备到与质膜融合等的机制。 科学计算可视化( s u a l i z a t i o ni ns c i e n t i f i cc o m p u t i n g ，简称为v i s c ) 口3 卅指的 是运用计算机图形学和图象处理技术将科学计算过程中或者是计算结果的数据转 换为图形或者是图象在屏幕上显示出来并进行交互式处理的理论技术或者是方 法。其主要功能是从复杂的多维数据中产生图形，也可以分析处理送入计算机的 图形数据。 因为科学计算可视化可以将计算结果用图形或者是图象直观形象的显示出 来，所以将这一技术和三维荧光反卷积显微技术结合起来，使研究人员能够更加 直观的观测和研究囊泡的空间大小、位置分布等，这将极大地有利于分泌调控机 制的研究，将成为研究活体细胞内囊泡的空间分布和定位的新手段，有利于对囊 泡的分泌活动过程进行定性或定量的分析。 1 华中科技大学硕士学位论文 1 2 三维荧光反卷积显微技术 人类早在3 0 0 年前就开始采用光学显微技术对细胞的构造进行观测和研究， 1 5 7 5 年，西班牙内科医生和植物学家莫纳德叫m o n a r d e s ) 第一次记录了荧光现象， 二十世纪初荧光显微技术开始崭露头角，逐渐应用于组织学、细胞学和微生物学 等领域。 由于光学显微镜的分辨率的问题，在显微史上曾一度被电子显微镜所取代。 随着通过信息处理技术使光学显微镜的分辨率大幅度提高和生物荧光染色技术的 迅猛发展，光学显微镜再度受到研究者青睐和广泛使用。特别是1 9 9 2 年p r a s h e r 等对绿色荧光蛋i ! l ( g r e e n f l u o r e s c e n c ep r o t e i n ，g f p ) f l 克隆鉴定 5 】，促进了荧光标 记技术的快速发展。绿色荧光蛋白对蛋白质分子标记后，在蓝光或紫外光照射下 产生明亮绿色荧光的特性，适合做普遍的报告标记，研究细胞和亚细胞的结构与 分泌以及物质构成。共聚焦显微镜( c o n f o c a lm i c r o s c o p e ) 6 1 的出现，大幅度提高了 荧光显微图象的分辨率，自= 十世纪8 0 年代以来广泛应用于观察生物样本结构。 但共聚焦显微镜是通过物理介质提高光学显微镜的分辨率，技术要求和制造成本 都比较高。而随着现代信息技术快速更新，计算机处理器速度的提升和高分辨率 科学型背冷电荷耦合器件( c h a r g e c o u p l e dd e v i c e ，c c d ) 的出现，信息处理技术及其 处理速度不再是影响研究进程的关键，生物领域的研究者开始重视研究采用计算 的方法重建微观三维结构。 传统的宽场显微镜( w _ i a e f i e l dm i c r o s c o p e ) 高速的数据采集、较低的制造成 本为优势，通过反卷积技术处理图象数据，可以突出生物结构中研究者感兴趣的 部分，在生物化学、分子生物学、细胞生物学、生物医学等学科研究中已经成为 一个重要的手段。国际上，1 9 7 1 年m w e i n s t e i n 发表了关于由二维切片重建三维 样本结构的论文【”，但是三维荧光反卷积显微技术真正发展才短短十几年。在1 9 8 9 年a r a r d 的三维荧光显微技术论文。1 发表之后，这方面的研究得到迅速发展，一些 成果相继被报道。目前国内有关三维荧光反卷积图象恢复技术的研究正处于起步 阶段 9 1 。 2 华中科技大学硕士学位论文 1 3 科学计算可视化 2 0 世纪8 0 年代末期，计算机图形学已经逐渐发展成为- - f q 成熟的学科，为科 学可视化的诞生、发展提供了理论基础。其次由于计算机软件与硬件的发展，计 算能力的不断增强，在生产实践和科学研究中需要处理的数据急剧膨胀，要处理 的数据也越来越复杂。光靠人工操作，已远远不能满足实际的需要。另一方面由 于科学研究中的需要，在高分子结构与d n a 序列显示、飞机模型、流体力学、地 球与气象科学及医学辅助诊断等领域都迫切需要数据的可视显示，需要有效的视 觉信息交流的手段。于是科学计算可视化也就应运而生了。 科学计算可视化这个科学术语正式出现于1 9 8 7 年2 月美国国家科学基金会召 开的一个研讨会上。研讨会发表的报告1 2 j 给出了科学计算可视化的定义、覆盖的 领域以及近期与长期的研究方向。从此美国国家科学基金会的几个学部开始支持 可视化的研究项目。稍后欧洲也开始支持科学计算可视化的研究计划。从1 9 9 0 年 起，美国i e e e 计算机学会计算机图形学技术委员会开始举办一年一度的可视化国 际学术会议，这标志着“科学计算可视化”作为一个学科已经成熟，它的应用遍 及所有应用计算机从事计算的科学与工程学科，并且获得了巨大效益。 科学计算可视化是当前计算机学科的一个重要研究方向，也是- - i q 交叉学科， 其研究包括两方面内容：一方面研究如何把科学数据一数值与图象，转变成可视 的图形f 图象) 与可理解的信息的工具，另一方面的研究把可视化工具应用于科学与 工程的各个学科。 科学计算可视化能通过计算机图形学将枯燥的数据转化成直观的图形，借助 于交互式的图形、图象系统，人们就能便捷地获得关于数据的直观、形象、深刻 和全面的理解，帮助人们洞察数据所蕴含的关系和规律，发现通常不能发现的现 象，使研究人员获得灵感和启发，从而提高科研工作的水平和效率。 可视化技术在这十多年里获得了飞速发展，相应的可视化软、硬件产品市场 急剧扩大。就硬件而言，可视化硬件产品交易由1 9 9 0 年的1 0 亿美元上升到1 9 9 5 年的3 0 亿美元。在软件方面，已有了许多实用的数据场可视化系统，有些已经商 3 华中科技大学硕士学位论文 品化t 如a v s e x p r e s s ，i b md a t a - e x p l o r e r , i r i s e x p l o r e r , f a s t , p l o t 3 d a m i r a 等。 1 4 本文的主要内容 本文的研究课题是针对在传统宽场显微镜下采集的三维荧光样本图象，利用 反卷积算法克服光学系统的干扰，得到质量符合生物研究要求的三维图象数据， 然后利用科学计算可视化技术重构三维样本，得到直观、清晰的所感兴趣的三维 图象。 本文的主要内容如下： 第二章主要介绍三维荧光反卷积显微技术。首先介绍了课题中使用的光学威 象系统，然后论述了光学切片技术、点扩展函数、反卷积恢复算法等至关重要的 概念和知识，最后用反卷积算法分别恢复荧光珠和大鼠胰腺b 细胞的三维荧光图 象验证算法的效果。 第三章主要论述了三维图象科学可视化技术。首先介绍科学可视化的基本知 识和方法，包括数据场的分类、可视化过程和观察方法等；然后重点论述了最常 用的科学可视化的两种方法：面绘制方法和直接体绘制方法，以及相应的经典算 法：移动立方体法和光线投射法；最后使用这两种方法对第二章中得到的反卷积 恢复后的三维图象进行可视化处理并对结果进行对比和讨论。 第四章主要论述四维荧光反卷积显微技术及科学可视化技术。首先论述了四 维荧光显微技术的基本概念，然后着重介绍其过程和方法，最后用p c 1 2 细胞实 验作为实例介绍四维荧光反卷积显微技术及可视化的过程并分析其结果。 第五章主要介绍自主开发的可视化技术软件包。首先介绍了科学可视化软件 包开发的技术基础可视化工具集，然后论述了可视化软件包的主要框架和功能。 第六章是对全文总结，并对科学可视化的发展方向作一展望。 4 华中科技大学硕士学位论文 2 1 引言 2 三维荧光反卷积显微技术 三维荧光反卷积显微技术是后续进行科学可视化的基础，其主要功能是提供 符合生物研究要求质量的三维图象数据。 本章首先介绍本文实验过程中所使用的成象系统，然后论述了三维图象成象 基础一光学切片技术，再介绍点扩展函数的原理和常用的反卷积算法，最后运用 理论计算的点扩展函数和最大期望的反卷积算法去处理实验中运用成象系统得到 的三维图象数据，验证反卷积算法的实用性。 2 2 成象系统 实验中所使用的三维荧光成象及数据采集处理系统主要由宽场荧光显微镜 ( i x 7 0 ；o l y m p u s ，j a p a n ) ，物镜( a p o1 0 0 x 1 6 5n ao i lh r ；u p i a n a p o1 0 0 x 1 3 5n a o i li r i s ；o l y m p u s ) ，单色光源及控制器( p o l y c h r o m ei v ；t i l lp h o t o n i c sg m b h ， g e r m a n y ) ，电荷偶合器件( c c d ) ( s e n s i c a m ，s v g a ；p c o ；g e r m a n y ) ，计算机( p 41 7 g 1g r a m ) ，压电z 轴扫描控制器( e 6 6 2 l r ；p h y s i ki n s t r u m e n t s ，g e r m a n y ) ，图象 采集软件( t i nv i s i o n4 o ：t i l lp h o t o n i c sg m 3 h ) 等构成，如图2 1 所示。实验装置简 单的工作原理是使用图象采集软件控制单色光源发出指定波长的激发光及曝光时 间，激发光通过二色分光镜照射到样本，样本受激发射的荧光经同一个二色分光 镜和随后放置的滤光片到达c c d ，三维样本此时位于显微镜焦平面的荧光图象就 被c c d 记录到，随后图象数据被送到计算机。控制压电z 轴扫描控制器使显微镜 焦平面沿z 轴步进就可以对三维样本逐面成象，采集到的这一系列二维图象堆叠 重构成三维荧光图象。本文中将光轴定义为z 轴，显微镜焦平面定义为x - y 平面。 采集的图象随后在计算机里进行反卷积恢复处理和科学可视化工作。 5 华中科技大学硕士学位论文 2 3 光学切片技术 图2 1 三维荧光反卷积显微成象系统框架图 光学切片( o p t i c a ls e c t i o n i n g ) 方法 9 是从厚样本中提取三维信息的一种方法。当 二维平面处于光学系统物空间焦平面时，其在象空间的成象最为清晰。因此所谓 光学切片方法也就是将显微镜的物焦平面按照一定的步进间隔依次置于三维样本 的不同位置并采集此时样本位于象焦平面的二维图象。采集到的二维切片图象称 为光学切片，样本的三维图象就是采集到的这样一组光学切片重构而成 i 们。可见， 光学切片技术即是对样本进行离散采样的方法。 如图2 2 ( a ) 所示是对厚度为t 的一个样本进行成象的光学系统示意图。系统的 三维坐标系的原点位于样本的底部，z 轴与显微镜的光轴重合。象距函固定，焦 平面位于z = z 处，即距物镜下面卉处。象平面有其自己的坐标系0 协，y ) ，其原 点在z 轴上。样本可以是经荧光蛋白标记的细胞，在激发光的照射下发出荧光。 用函数f ( x ，y ，纠来描述其光强度分布，用g 扛：y ：z ) 来表示当焦平面位于：7 时的 成象结果。 6 华中科技大学硕士学位论文 、乡，彭 ，宇球么 压霪薰| | | | | l 翼参 对霉霉乒 1 沁。 图2 2 光学切片成象示意图 ( a ) 厚样本成象示意图；( b ) 光学切片示意图，上部为样本立体图，下为样本光学切片立体图。 假设理想二维的情况下，只有在z = z o 物平面( 其厚度为零) 光强度为 f ( x ，y ，z o ) ，其它位置的光强度均为零。由于透镜为线性系统，z = 动处光学系统的 点扩展函数可以由焦平面处的点扩展函数 0 ，y ，z ) 得到 y ，一一) ，那么物平 面j ( x ，y ，z o ) 年n 象g ( x ，弘z ) 的关系为 g ( x ，y ，z ) = f ( x ，y ，) 0 h ( x ，y ，z o 一一) ( 2 1 ) 其中。表示卷积过程。 沿z 轴方向将三维样本分割成厚度n x z 的一系列平面物体，则可以将样本看 作由光学平面i ( f - l ，2 ，3 ，4 n ) 构成，如图2 - 2 ( b ) 所示。在实验中是通过移动物 镜使透镜焦平面位于样本的不同的平面层，则当物空间焦平面位于平面i 时采集的 二维图象f ，则三维样本为 f ( x ，y ，：) = ( t y ，i , 5 z ) 6 ( x ，y ，：- i a z ) a z ( 2 2 ) 7 华中科技大学硕士学位论文 其中 = 勉 这一系列物体平面在焦平面z 处得到的图象是单个平面图象之和 g ( x ，y ，z ) = f ( x ，y ，i a z ) o h ( x ，y ，止i a z ) a z f l 如果令；= i a z ，并且令z 趋向0 ，式( 2 4 ) 可以用积分表示 g ( x 出z 1 ) = fi ，( x ，y , z ) 。 ( x ，_ y ，小z ) 出 ( 23 ) ( 2 4 ) ( 2 5 ) 如果令在视野范围以外以及o z t 以外的， z ) 的值为0 ，将二维卷积展开， 则可以得 可简化表示为 g ( x ，y ，：) = f f f i ( x , j ，= ) ( x x ，y y r , z 一z ) d x 方d z( 2 6 ) g ( x ，儿z ) = h ( x ，y ，z ) 固f ( x ，y ，= )( 2 7 ) 其中g ( x ，y ，z ) 是图象函数，h ( x ，y ，= ) 是成象系统点扩展函数，f ( x ，y ，z ) 是样本函数。 可见图象函数和样本函数成一种线性的数学关系，即卷积关系。 用宽场显微镜对经荧光染料标记的活体细胞进行观察时，存在的主要问题是 每片二维光学切片都是焦外光和焦平面光信息的叠加，这会导致焦平面的图象变 得非常模糊。因此必须对图象进行恢复，去除或减弱在成象过程中引起的图象质 量下降或退化，使得处理后的图象尽量逼近或趋向没有退化的理想图象。 从式( 2 7 ) 可以看出，要想恢复图象，只需要对图象函数g ( x ，y ，z ) 进行反卷积运 算就可以实现。实验中所使用的三维荧光反卷积显微技术就是通过反卷积算法来 降低焦外光的影响，提高图象分辨率。因此，表征着成象系统特性的点扩展函数的 确定是进行反卷积运算至关重要的步骤。 2 4 点扩展函数 一般的三维图象反卷积恢复算法需要预先确定成象系统的点扩展函数( p o i n t 8 华中科技大学硕士学位论文 s p r e a df u n c t i o n ，p s f ) 。光学切片显微成象系统的p s f 是显微成象系统物空间中的 一个点光源被记录下的二维图象数据的堆栈，这些数据是离焦距离的函数，也就 是点光源样本相对物镜由最清晰的成象的位置( ：= o ) 移动的距离z 的函数【l i 】。 在非设计条件下，一个位于光轴上的点光源形成的三维图象的光强度场在检测 器象平面上位置( x d ，妇，劫的值可由k i r c h h o f f 的衍射积分公式f 1 2 l 计算得到。计算 的结果也就是该成象系统的p s f ，可以如下式描述 ，c x 。，。，z 。，= l j f ，。 k a p 学 e x p ( j w ( p ) ) p d p l 2 c 2 8 ， 其中 w ( p ) = k + o p d( 2 9 ) 式中c 是幅度常数，山( ) 是零阶贝塞尔函数，波数k = 2 石2 ，五是点光源发射光 的波长，o p d 为光程差。 利用式( 2 8 ) 、( 2 9 ) 可以计算出理论上的点扩展函数。实验使用的显微镜系统如 2 2 节中所述，另外显微镜物镜浸油的折射率为1 7 8 ，玻片的折射率为1 7 8 ，厚度 为0 1 5 m m ，c c d 象素大小为6 7 6 7 9 i n 2 ，= 轴步进距离为2 0 0 n m ，样本折射率 为1 5 9 。按上述条件计算出的显微镜成像系统的理论点扩展函数的二维切片图象如图 2 3 中所示。 从图2 3 a 中可以发现，每一x - y 平面图均为衍射光环；并且点光源成象时其 光强度集中于平面中心及附近，远离平面中一i i , 的光强度遵循一定的规律递减。另 外每一切片沿z 轴方向距离点扩展函数中心亮点的距离越远，衍射光环越大，同 时光强度也相应降低。从图2 3 b 中可以发现，x z 平面的切片图象外廓都是关于图 象平面中心垂线对称的曲线，其光强度同样也是集中于平面中心及附近位置a 由 图2 3 ，可知，宽场显微镜光学系统的理论点扩展函数是一个具有对称特性的双锥 体。 9 华中科技大学硕士学位论文 图2 3 理论计算得到的三维p s f 的x - y 和x - z 平面切片图象 ( a ) x - y 平面切片圈象，每切片上方数字表示该切片沿z 轴方向距离点扩展函数中心亮点 的距离；( b ) x _ z 平面切片图象。每切片上方数字表示该切片沿y 轴方向距离点扩展函数中 心亮点的距离。 2 5 反卷积恢复算法 成象系统记录到的原始图象是样本函数和p s f 的卷积，采集得到的三维原始 图象因受焦外光的影响面模糊。因此需要根据采集到的原始图象和p s f 求样本函 数，这一过程叫反卷积运算。目前，在数字图象处理中，反卷积的实现方法主要 有几种：逆滤波2 r , 法v 3 】、线性方法1 4 、统计方法 s j o 以及非预知p s f 的盲反卷积 方法 1 7 j 8 1 ，这些方法各有优缺点，而随着现代信息处理技术的发展，很多算法仍 存在着很大的改进余地。 本文中使用的反卷积算法是基于最大似然的最大期望迭代算法( m l - - e m ) 1 9 、2 0 , 2l i 。根据以往的研究，c c d 记录到的图象可用式2 1 0 表示【8 j ，该式为一泊松 1 0 华中科技大学硕士学位论文 过程形式 g ( 五) = p ( 置一x o ) s ( x o ) d x 。= h ( x ，) 。j ( 卫，) ( 2 1 0 ) 其对数似然函数模型为1 1 列 l ( s l g ) = 一f 【弘( 并。一x o ) j ( x o ) d r 。一g ( x , ) h a j h ( x , 一x o ) j ( x 。) d x 。) 批 式中x 一( x ，y ，z ) 表示三维矢量。 令掣：o 即可求得样本函数j 的最大似然估计j ，迭代求解如下： 。饥) = 学p ( 置圳器嘁 其中 量( x ，) = j h ( x ，一x 。) ；”( x 。) d x o 0 h o = j h ( x o ) d x 0 ( 2 1 1 ) ( 2 1 2 ) f 2 1 3 ) ( 2 1 4 ) 式中上标( t ) 表示迭代次数；扩，( 置) 为样本函数成象在迭代次数为时的图象恢复 估计。 e m 算法是一种经典算法，可以明显的改善宽场显微镜光传输函数在空间频率 上“丢失锥”现象引起的光轴方向上的分辨率下降的问题。 2 6 实验与结果 为了验证反卷积算法恢复的效果，文中将分别使用荧光珠和大鼠胰腺d 细胞来 做实验。首先将通过实验的方法 9 , 2 2 1 测定和2 4 节中同样条件的显微镜光学系统的 点扩展函数，然后计算得到的理论点扩展函数进行比较。比较结果证明，实验测 定和理论计算得到的点扩展函数非常接近，对应的x y 平面的衍射光环直径基本相 等，x z 平面的张角基本相等；对理论计算和实验测定p s f 的频谱和荧光强度分布 分别进行威尔科克秩和检验，结果证明两者没有显著性差异【2 2 】。因此后面的实验 中将均采用m l - - e m 算法和理论点扩展函数来进行反卷积恢复处理。 1 1 华中科技大学硕士学位论文 2 , 6 1 荧光珠实验 实验中使用的荧光珠( f o c a l c h e c k “f 1 u o r e s c e n tm i c r o s p h e r ek i t1 5 p m m o u n t e d o ns l i d e s ；m o l e c u l a r p r o b e s ，美国) 直径为1 5 “m ，这与后面的实验对象一大鼠胰腺b 细胞和p c 1 2 细胞的直径相当。在激发光照射下约0 7 u m 的球壳会发出荧光，而内 部不发光，其结构如图2 | 4 ( a ) 所示( 参数来n ( - 于f o c a l c h e c ( f l u o r e s c e n tm i c r o s p h e r e s t a n d a r d s ，m o l e c u l a rp r o b e s ) 。因此实验得到的三维图象中x y 切面、x z 切面均应 该是一定宽度的亮环，如图2 4 ( b ) 所示。亮环图象局部近似为二维高斯分布，假设 亮环中最亮点的亮度为厶，那么可把荧光强度大于0 8 厶的象素认为是亮环上点”1 。 ( e 1 )( b ) 图2 , 4 荧光珠结构示意图 ( a ) 荧光珠立体示意图；( b ) 荧光珠剖面图。 样本的原始图象及反卷积处理后的图象如图2 5 所示。从图2 5 ( a ) 中x - y 平面 图象可以看出，由于焦外光的影响，所采集到的原始图象中圆环宽度比实际荧光 珠发光层的厚度要厚，而且内部也有些亮光，另外环外有一些小而且细的圜环； 从x z 平面图象可以看出，圆环的底部已经模糊，而顶部却变得非常明亮，整个z 轴方向的图象已经发生拉t * n 变而不再是个圆环。发生z 轴拉伸现象的原因是由 f 宽场显微镜系统点扩展函数豹空间频率响应有“丢失锥”的现象，导致z 轴方 向上的分辨率下降，一些细节信息无法恢复。 从图2 5 ( b ) d p 可看出，经2 0 0 次反卷积迭代运算后x - y 平面的模糊基本去掉， 1 2 华中科技大学硕士学位论文 原始图象中的圆环外的细圆环和环内部的亮光均已消失，而且圆环的宽度与实际 值相符合；x z 方向的图象中的模糊和环内的亮光已去除，同时圆环顶部的过亮部 分已被去除，而圆环底部的过暗部分已被加强，但很明显的是圆环在z 轴方向的 拉伸形变没有得到改善。图象经过更多次数( 1 0 0 0 次) 迭代的反卷积恢复运算后， 如图2 5 ( c 1 所示，圆环亮度更为均衡，特别是圆环的顶部和底部亮度趋于一致，z 轴方向的形变已经得到比较大的改善，基本恢复成一个圆环状。 通过已知结构荧光珠的原始图象和反卷积恢复后图象的对比可以看出，反卷 积恢复算法确实能够有效地去除焦外光带来的模糊，并能提高z 轴的分辨率。 图2 5 荧光珠三维图象的x y 平面切片和x z 平面切片图象 ( a ) 原始图象：( b ) 迭代运算2 0 0 次的处理结果；( c ) 迭代运算1 0 0 0 次的处理结果。 2 6 。2 大鼠胰腺p 细胞实验 大鼠胰腺6 细胞的原代培养方法本研究所已有报道。吖啶橙( a c r i d i n e o r a n g e ，a o ) 是一种可以跨膜扩散的荧光染料，主要被分泌囊泡等嗜酸性囊泡摄取， 凼此本文使用吖啶橙( m o l e c u l a rp r o b e s ，e u g e n e ，0 r ) 对细胞内分泌囊泡进行标记。 1 3 华中科技大学硕士学位论文 细胞贴壁后，使用3i - t m 吖啶橙溶液在2 1 条件下孵育1 5 分钟2 4 1 ，然后用1 3 细 胞标准外液将细胞冲洗干净。外液成分为( m m ) ：1 3 8n a c i ，5 6k c l ，1 2m g c l 2 ，2 6 c a c l 2 ，3g l u c o s e ，5h e p e s ( p h = 7 4 ) 。观察时，先在显微镜的明场条件下找到活性 较好的细胞，然后用波长为4 8 8n l n 激发光激发，受激发射光的波谱峰值约为5 4 0 n m f 5 刚。 本实验使用a p o1 0 0 x 1 6 5n ao i lh r 物镜，x - y 平面采样间隔为o 0 6 7 ”m ，z 一 轴步进问隔为0 2u m ，均满足奈奎斯特采样定理。三维数据矩阵大小为2 5 6 2 5 6 x 6 4 。原始图象和经反卷积运算恢复之后的x _ y 平面和x z 平面的切片图象分别如 图2 6 和图2 7 所示。在得到的图象中，荧光亮点指示细胞内分泌囊泡的位置和形态。 图2 6 大鼠胰腺6 细胞三维图象x - y 平面切片图象 ( a ) 原始图象，( b ) 迭代运算2 0 0 次的处理结果，( c ) 迭代运算1 0 0 0 次的处理结果，z 。4 0 切 而也上角亮点为白色箭头所指囊泡的放大图，其中标尺为3 0 0n m 。 1 4 华中科技大学硕士学位论文 图2 7 大鼠胰腺1 3 细胞三维图象x - z 切面 t a ) 原始图象，( b ) 迭代运算2 0 0 次的处理结果，( c ) 迭代运算1 0 0 0 次的处理结果，玻片的大 概位置如a 中所示。 从图2 6 ( a ) 和图2 7 ( a ) 中可以看出原始图象除了指示囊泡的亮点外整个细胞都 有一定的亮光，而且这些指示囊泡的荧光亮点因为受到焦外光的影响而明显的模 糊，其大小已不能反映囊泡的实际大小。如图2 6 ( b ) 和2 7 ( b ) 所示，经过2 0 0 次恢 复运算之后原始图象的背景模糊已基本被去掉，但是亮点仍较模糊。从图2 6 ( c ) 和图2 7 ( c ) 可以看出经过1 0 0 0 次反卷积恢复后模糊背景已全部被去掉，而且荧光 亮点得到突出( 如图2 6 和图2 7 中的箭头指向所示) 。且荧光亮点大小接近于实 际值，约3 0 0 1 1 1 2 2 , 2 5 1 ，如图2 6 ( c ) 中右上角囊泡的放大图所示。 2 6 3 结论 从已知结构的荧光珠和大鼠胰腺1 3 细胞恢复前后的图象对比可以看出反卷积 恢复算法能有效去除焦外光造成的模糊，处理后的图象质量得到明显的改善，而 且能提高z 轴的分辨率，改善z 轴方向的形变。 2 7 小结 在这一章中主要论述了实验中使用的三维荧光成象系统和三维荧光反卷积显 微技术的一些相关知识，并用已知结构的荧光珠进行实验证明了反卷积荧光算法 华中科技大学硕士学位论文 的实用性和正确性，最后对实验的研究对象之一大鼠p 细胞的三维荧光图象进行 了反卷积运算恢复，结果证明恢复后的图象质量得到很好的改善，符合生物研究 的要求。 1 6 华中科技大学硕士学位论文 3 1 引言 3 科学计算可视化 使用反卷积荧光显微技术得到三维图象数据一般都比较庞大，如何从这大量 的数据中得到研究者感兴趣的内容，帮助洞察和发现数据中包含的现象、关系和 规律，这就需要使用科学计算可视化技术。科学计算可视化通过计算机图形学将 枯燥的数据转化成直观的图形，让研究者便捷地获得关于数据的直观、形象、深 刻和全面的理解。 在这一章里，首先介绍关于科学计算可视化的一些基础知识，然后着重论述 科学计算可视化常用的两种方法及相应的算法，最后运用这些方法对本文中第二 章中得到的三维荧光反卷积图象进行可视化处理，从而实现对活体细胞内分泌囊 泡在空间分布的分析和研究。 3 2 科学计算可视化 科学计算可视化是指运用计算机图形学和图象处理技术将科学计算过程中或 汁算结果的数据转换为图形或图象在屏幕上显示出来并进行交互式处理的理论、 方法和技术，一般简称为科学可视化( s c i e n t i f i cv i s u a l i z a t i o n ) 【3 4 1 。其主要功能是从 复杂的一维、二维、三维甚至多维数据中产生图形，也能分析、处理输入计算机 的图形数据。其研究内容包括寻找适当的数据预处理方法特别是好的特征抽取方 法、快速高效的数据组织方法等，建立直观的可视化映射模型以便于最大程度上 揭示数据中蕴涵的规律及提出新的绘制算法，从而可在二维的屏幕上更好显示三 维甚至更高维场的特性。同时还要研究将合适的可视化方法集成为通用或专用的 可视化平台，并将它应用到具体的研究领域中【2 “。 一 1 7 华中科技大学硕士学位论文 3 2 1 可视化数据的分类 可视化操作处理的对象是数据，它既有来自科学计算或试验的，也有来自生 产实践的，其格式与特征五花八门，可以洗是包罗万象。其中，最常见的是通过 各种科学仪器扫描而得到的，这些科学仪器包括核磁共振( m r i ，m a g n e t i c r e s o n a n c e i m a g i n g ) 、c t ( c o m p u t e r i z e dt o m o g r a p h y , 计算机x 射线断层造影术) 等。另外在工 程应用当中，经常采用有限元分析和计算流体动力学的方法产生各种模拟数据， 而在气象、地质勘探等领域则大都通过观测获得数据。 可视化数据都是离散的，从拓扑维数上讲，有一维的、二维的、三维的、四 维的、以至更高维的。目前关于三维数据场的研究是最活跃的。 根据数据场中采样点分布的空间几何特征，数据场一般分为规则场与非规则 场。所谓规则场，就是样点分布于直线型正交网格交点上，且这些网格点沿各轴 向的间距是相等的。在三维空间，每一个网格即为一个小立方体，称为立方体素 ( v o x e l ，也称体素或体元) 或单元( c e l lo 非规则场可以进一步分成结构化的和非 结构化的。前者的含义是数据场在逻辑上依然是较规整的，而每个单元的形状不 是正交网格型的。后者又称为散乱的数据场。 根据数据的物理特征，数据场可以分为标量场和向量场。标量场是指数据只 有大小而无方向的数据场。比较常见的有密度场，温度场等。标量场的可视化主 要是揭示各分类物质的空间分布。向量场的数据不仅有数值的大小，还有方向的 变化。典型的有流体力学的数据场。向量场的可视化除了揭示各分类物质的空间 分布外，还要反映其变化的趋势。 本文研究的三维荧光反卷积图象是规则的标量场。 3 2 2 科学可视化的模型及过程 科学计算可视化实质上是科学研究过程中关于计算机辅助数据处理部分，其目 的是为研究者提供一种可视的分析手段。通常研究一种物理现象时首先要建立一 个物理模型( 物理定律) ，然后将其转换为数学模型( 物理定律的数学表达式) ，据