分子生物学考试复习题.doc

1.PCR的基本原理？答：PCR是在试管中进行的DNA复制反应，基本原理是依据细胞内DNA半保留复制的机理，以及体外DNA分子于不同温度下双链和单链可以互相转变的性质，人为地控制体外合成系统的温度，以促使双链DNA变成单链，单链DNA与人工合成的引物退火，然后耐热DNA聚合酶以dNTP为原料使引物沿着单链模板延伸为双链DNA。PCR全过程每一步的转换是通过温度的改变来控制的。需要重复进行DNA模板解链、引物与模板DNA结合、DNA聚合酶催化新生DNA的合成，即高温变性、低温退火、中温延伸个步骤构成PCR反应的一个循环，此循环的反复进行，就可使目的DNA得以迅速扩增。DNA模板变性：模板双链DNA?单链DNA，94。退火：引物单链DNA?杂交链，引物的Tm值。引物的延伸：温度至70 左右， Taq DNA聚合酶以种dNTP为原料，以目的DNA为模板，催化以引物末端为起点的53DNA链延伸反应，形成新生DNA链。新合成的引物延伸链经过变性后又可作为下一轮循环反应的模板PCR，就是如此反复循环，使目的DNA得到高效快速扩增。2.基因敲除的基本程序？答：通过DNA同源重组，使得胚胎干细胞特定的内源基因被破坏而造成功能丧失，然后通过胚胎干细胞介导得到该基因丧失的小鼠模型的过程称为基因敲除。1、打靶载体的构建：同源序列要足够长，要含有筛选用的标志基因。2、胚胎干细胞的体外培养3、打靶载体导入胚胎干细胞4、 同源重组胚胎干细胞的筛选5、基因敲除胚胎干细胞注射入胚泡6、胚泡植入假孕小鼠的子宫中7、杂交育种获得纯合的基因敲除动物3. 真核生物与原核生物基因表达调控的异同？（列表） 答；原核基因表达调控特点：RNA聚合酶只有一种，其因子决定RNA聚合酶识别特异性；操纵子模型的普遍性；阻遏蛋白与阻遏机制的普遍性（负性调节占主导）；转录和翻译偶联进行；转录后修饰、加工过程简单；转录起始是基因表达调控的关键环节。真核基因表达调控特点：RNA聚合酶有三种，分别负责三种RNA转录，每种RNA聚合酶由约10个亚基组成；活性染色质结构发生变化；正性调节占主导；转录和翻译分隔进行；转录后修饰、加工过程较复杂；转录起始是基因表达调控的关键环节。（1）原核生物和真核生物基因表达调控的共同点： a 结构基因均有调控序列； b 表达过程都具有复杂性，表现为多环节； c 表达的时空性，表现为不同发育阶段和不同组织器官上的表达的复杂性； （2）与原核生物比较，真核生物基因表达调控具有自己的特点： a 真核生物基因表达调控过程更复杂； b 基因及基因组的结构特点不同，如真核生物基因具有内含子结构等； c 转录与翻译的间断性，原核生物转录与翻译同时进行，而真核生物该两过程发生在不同区域，具有间断性； d 转录后加工过程； e 正负调控机制； f RNA聚合酶种类多。4、DNA甲基化和修饰及转录调控的相关问题DNA 甲基化是指胞嘧啶(C) 52位羟基的甲基化(m 5C) , 是一种DNA 复制后的酶促反应过程. DNA 复制以后, 在DNA 甲基化酶的作用下, 将S2腺苷酰甲硫氨酸(SAM ) 分子上的甲基转移到DNA 分子中胞嘧啶残基的第5位碳原子上1随着甲基向DNA 分子的引入, 改变了DNA 分子的构象, 影响了DNA 与蛋白质因子(如拓朴异构酶、RNA 聚合酶、阻抑蛋白等) 的结合，因为高等生物CpG二核苷酸序列中的C通常是甲基化的，极易自发脱氨，生产胸腺嘧啶，所以CpG二核苷酸序列出现的频率远远低于按核苷酸组成计算出的频率。由于这些CpG二核苷酸通常成串出现在DNA上，因此这段序列往往被称为CpG岛。DNA甲基化会抑制基因转录，DNA甲基化会导致某些区域DNA构想变化，从而影响了蛋白质与DNA的相互作用，抑制了转录因子与启动区DNA的结合效率。当组蛋白H1和含CCGG序列的甲基化或非甲基化DNA分别形成复合体时，DNA的构型存在很大差异，甲基化达到一定程度是会发生从常规的B-DNA向a-DNA的过渡，由于a-DNA结构收缩，使许多蛋白质赖以结合的部件缩为大沟而不利于基因转录的起始。DNA甲基化与X染色体失活：哺乳动物中，雌性体细胞内存在两条x染体，而在雄性体细胞内只存在一条x染色体，这就要求必须对不同数量的x染色体进行剂量补偿，使雌性个体中的一条x染色体失活。失活的x染色体保持低转录水平与滞后复制，其与结构性的异染色质相似，但在看家基因启动子的Gpc岛处发生了甲基化。x染色体失活可以防止雌性个体体内双倍x基因发挥功能，从而维持雌性体细胞正常的生长发育。哺乳动物中Gpc岛胞嘧啶的甲基化与x染色体失活密切相关，若GpC岛甲基化缺失，x染色体失活状态将不稳定。研究表明，x染色体失活是由x失活中心顺式控制的，包括启动、计数、选择、建立与维持等复杂的过程。x染色体失活一旦建立则保持稳定，其所有的子细胞均失活同一条x染色体。当一个卵子与精子形成一个雌性胚胎时，x特异性失活转录本可以通过甲基化使来自于父方的那条染色体失活xist基因5端在活性的x染色体中是完全甲基化的，而在失活的x染色体上则是非甲基化的，也就是说xist基因是在失活x染色体上转录而在活性x染色体上不转录的唯一基因，即xist基因的。5、（1）乳糖操纵子（lac）：1、包括三个结构基因：Z、Y、A以及启动子，控制子和阻遏子。转录时RNA聚合酶首先与启动区结合，通过操纵区向右转录，转录从O区中间开始，按Z-Y-A方向进行，每次转录出来的一条mRNA上都带有这三个基因，转录的调控实在启动区和操纵区进行的。Z、Y、A基因的产物为一条多顺反子mRNA。lacZ：编码-半乳糖苷酶，它可以将乳糖水解为半乳糖和葡萄糖；lacY：编码半乳糖苷透性酶，它能将乳糖运送透过细菌的细胞壁；lacA：编码硫代半乳糖苷乙酰转移酶，进行乳糖代谢。3、调控方式：负调控：诱导物：实际上是异构乳糖。正调控：葡萄糖腺苷酸环化酶活性降低， ATP无法转变成 cAMP不能形成CAP-cAMP复合蛋， RNA 酶无法结合在DNA上结构基因不表达、 （2）色氨酸操纵子的调控模式色氨酸操纵子(tryptophane operon)负责色氨酸的生物合成，当培养基中有足够的色氨酸时，这个操纵子自动关闭，缺乏色氨酸时操纵子被打开，trp基因表达，色氨酸或与其代谢有关的某种物质在阻遏过程（而不是诱导过程）中起作用。由于trp体系参与生物合成而不是降解，它不受葡萄糖或cAMP-CAP的调控。色氨酸的合成分5步完成。每个环节需要一种酶，编码这5种酶的基因紧密连锁在一起，被转录在一条多顺反子mRNA上，分别以trpE、trpD、trpC、trpB、trpA代表，编码了邻氨基苯甲酸合成酶、邻氨基苯甲酸焦磷酸转移酶、邻氨基苯甲酸异构酶、色氨酸合成酶和吲哚甘油-3-磷酶合成酶。trpE基因是第一个被翻译的基因，和trpL和trpa（不是trpA）。trp操纵子中产生阻遏物的基因是trpR，该基因距trp基因簇很远，后者在大肠杆菌染色体图上25min处，而前者则位于90min处。在位于65min处还有一个trpS（色氨酸tRNA合成酶），它和携带有trp的tRNATrp也参与trp操纵子的调控作用。L区编码了前导肽，当有高浓度Trp存在时，由于弱化子a的作用，转录迅速减弱停止，生成140核苷酸的前导RNA；当Trp浓度较低时，弱化子不起作用，转录得以正常进行，生成长约7kb的mRNA，操纵子中第一个结构基因的起始密码子AUG在+162处。1trp操纵子的阻遏系统trpR基因突变常引起trp mRNA的永久型合成，该基因产物因此被称为辅阻遏蛋白(aporepressor)。除非培养基中有色氨酸，否则这个辅阻遏蛋白不会与操纵区结合。辅阻遏蛋白与色氨酸相结合形成有活性的阻遏物，与操纵区结合并使之关闭转录trp mRNA。阻遏-操纵机制对色氨酸来说是一个一级开关，主管转录是否启动，相当于粗调开关。trp操纵子中对应于色氨酸生物合成的还有另一个系统进行细调控，指示已经启动的转录是否继续下去。这个细微调控是通过转录达到第一个结构基因之前的过早终止来实现的，由色氨酸的浓度来调节这种过早终止的频率。6、cDNA文库的构建 cDNA文库：真核生物mRNA逆转录所形成的DNA称为cDNA。将cDNA与载体DNA重组，并转化到宿主细菌里或包装成噬菌体颗粒，得到一系列克隆群体。这样的克隆群体叫做cDNA文库。 cDNA文库可直接进行筛选目的基因，由于cDNA中不含内含子，因此所筛选的基因可以直接表达。构建cDNA文库主要包括以下几个步骤：1、 mRNA的分离2、cDNA第一链的合成3、cDNA第二链的合成4、cDNA与载体的连接：5、噬菌体的包装、转染和质粒DNA的转化 如果用质粒DNA做载体，cDNA与载体连接后可直接转染宿主细胞，建立cDNA文库。如采用噬菌体为载体，必需经过体外包装，形成噬菌体颗粒，感染宿主菌。RNA提取将用生物素标记的寡聚(dT)引物与细胞总RNA共温育，加入与微磁球相连的抗生物素蛋白，用磁场吸附通过寡聚(dT)引物与抗生物素蛋白及强力微磁球相连的mRNA。7、人类基因组计划的科学意义？（1）确定人类基因组中约5万个编码基因的序列及其在基因组中的物理位置，研究基因的产物及其功能。（2）了解转录和剪接调控元件的结构与位置，从整个基因组结构的宏观水平上理解基因转录与转录后调节。（3）从整体上了解染色体结构，包括各种重复序列以及非转录“框架序列”的大小和组织，了解各种不同序列在形成染色体结构、DNA复制、基因转录及表达调控中的影响与作用。（4）研究空间结构对基因调节的作用。有些基因的表达调控序列与被调节基因从直线距离上看，似乎相距甚远，但若从整个染色体的空间结构上看则恰恰处于最佳的调节位置，因此，有必要从三维空间的角度来研究真核基因的表达调控规律。（5）发现与DNA复制、重组等有关的序列。DNA的忠实复制保障了遗传的稳定性，正常的重组提供了变异与进化的分子基础。局部DNA的推迟复制、异常重组等现象则导致疾病或者胚胎不能正常发育，因此，了解与人类DNA正常复制和重组有关的序列及其变化，将对研究人类基因组的遗传与进化提供重要的结构上的依据（6）研究DNA突变、重排和染色体断裂等，了解疾病的分子机制，包括遗传性疾病、易感性疾病、放射性疾病甚至感染性疾病引发的分子病理学改变及其进程，为这些疾病的诊断、预防和治疗提供理论依据。 （7）确定人类基因组中转座子、逆转座子和病毒残余序列，研究其周围序列的性质。了解有关病毒基因组侵染人类基因组后的影响，可能指导人类有效地利用病毒载体进行基因治疗。（8）研究染色体和个体之间的多态性。这些知识可被广泛用于基因诊断、个体识别、亲子鉴定、组织配型、发育进化等许多医疗、司法和人类学的研究。此外，这些遗传信息还有助于研究人类历史进程、人类在地球上的分布与迁移以及人类与其他物种之间的比较。8、真核细胞与原核细胞在基因转录、翻译及DNA的空间结构方面存在的差异。 在真核细胞中，一条成熟的mRNA链只能翻译出一条多肽链，很少存在原核生物中常见的多基因操纵子形式。 真核细胞DNA与组蛋白和大量非组蛋白相结合，只有一小部分DNA是裸露的。 高等真核细胞DNA中很大部分是不转录的，一些由几个或几十个碱基组成的DNA序列，在整个基因组中重复几百次甚至上百万次。大部分真核细胞的基因中间还存在不被翻译的内含子。 真核