毕业设计（论文）-烟碱降解菌发酵条件的优化设计.doc

（2014）届本科生毕业设计（论文）题 目 烟碱降解菌发酵条件的优化设计 专 业 生 物 科 学 院 系 生命科学与技术学院 学 号 1011010113 姓 名 指 导 教 师 二 0 一 四 年 四 月 烟碱降解菌发酵条件的优化设计学 生：指导教师： 摘 要：烟碱又叫做尼古丁（nicotion）,它是烟碱生物碱中的最主要的碱。在目前，我国大部分草烟中烟碱含量都很高，有些研究者采用化学的方法来降低烟碱的含量，但是有些研究者采用微生物降解的方法来降低草烟中烟碱的含量，本课题就是将在实验室中经过初筛，复筛，生理生化鉴定实验后得到的烟碱降解菌A4菌进行发酵条件的优化设计。先对此A4菌进行不同PH、温度、接种量、碳源和氮源的单因素实验研究不同因素下A4菌降解烟碱的影响，最后再进行多因素的四因素三水平的正交实验，确定A4菌发酵的最佳条件为：温度30、PH7.0、接种量10%、柠檬酸三钠1.5%、胰蛋白胨0.5%。关键词：烟碱；微生物；降解；优化； The optimization design of nicotine degradation bacteria of Its fermentation conditions Undergraduate: Ma Jiajun Supervisor: Li JungangAbstract:.Alkaloid of tobacco is also called nicotion,nicotion is the main alkaloid in tobacco.At the stage of being, the nicotine content is a little high in most of the tobacco planting areas.Some researchers using chemical methods to reducing the content of nicotine,but some researchers adopting the method of microbial degradation to reducing the content of nicotine in cigarettes.This topic is which The optimization design of nicotine degradation bacteria fermenting conditions,which goning by early screening,after screening,physiological and biochemical identification in the science lab.The strain cultured in deferent carbon source、nitrogen source、PH、temperature、nicotion concentration and inoculum concentration to its best gowth conditions.The rusults is that temperature 30,PH7.0,inoculum concentration 8%,Sodium citrate concentration 1.5%,Tryptone 0.5%.Keywords: Nicotine；Microbes; Degradation; Optimization目录1前言11.1概述11.2国内外研究现状11.3研究目的及意义22实验材料与仪器32.1实验材料32.1.1样品:32.1.2主要药品及试剂：32.1.3培养基：32.2 仪器及用具33试验方法与步骤43.1试验流程43.2试验步骤43.2.1烟碱标准曲线的制作43.2.2对A4菌进行活化43.2.3A4菌菌株种液的制备43.2.4培养基初始PH对A4菌降解烟碱的影响43.2.5温度对A4菌降解烟碱的影响53.2.6接种量对A4菌降解烟碱的影响53.2.7不同浓度烟碱A4菌降解烟碱的影响53.2.8碳源A4菌降解烟碱的影响53.2.9氮源A4菌降解烟碱的影响53.2.10多因素正交设计实验54 结果与分析64.1 烟碱标准曲线的绘制64.2 单因素结果分析6 4.2.1PH值对A4菌降解烟碱的影响6 4.2.2温度对A4菌降解烟碱的影响7 4.2.3接种量对A4菌降解烟碱的影响8 4.2.4不同含量烟碱对A4菌降解烟碱的影响9 4.2.5碳源对A4菌降解烟碱的影响10 4.2.6氮源对A4菌降解烟碱的影响104.3 多因素结果分析114.3.1正交实验的结果分析124.3.2正交试验方差分析134.3.3验证实验135 小结及讨论14参考文献：15致 谢17绵阳师范学院2014届本科毕业设计（论文） 烟碱降解菌发酵条件的优化设计1前言1.1概述烟碱又名尼古丁，它是一种没有颜色或者谈黄色透明的油状液体物质，气味非常刺激，并且挥发性极强。在烟草生物碱中烟碱是最主要的生物碱，烟碱是一种中枢神经兴奋剂，吸食后使人产生生理和心理上的依赖性，是让人成瘾的物质。因此，如果烟草中烟碱的含量过高会严重影响人们的健康。微生物是一种非常丰富的资源，而且普遍的存在于自然界中。有些微生物通过分解自然界中废弃的资源获取自身生长所需要的物质和能量。在多年种植烟草的田中，有些烟草遗落在田间被微生物利用，烟草中含有烟碱，有些微生物能够分解烟草中的烟碱以供其生命活动。如果能够将这类降解烟碱的微生物分离出来用来降解高含量烟碱的烟草或烟草加工废弃物，会具有广阔的发展前景。目前已有不少文献1-3研究过微生物对烟碱的降解，利用微生物处理来降解烟碱这种方法不会造成香烟的损失还可以改善烟的品质，可以提高烟叶的资源利用率，更可以降低对人类健康的伤害，减少烟草工业产生的大量废弃物对环境的污染。因此其开发应用具有较大发展潜力和应用前景。本课题主要是将在实验室中经过初筛，复筛，生理生化鉴定实验后得到的烟碱降解菌A4菌进行发酵条件的优化设计。1.2国内外研究现状1958年Casida T E 等人，从烟叶中得到一种细菌，可将烟碱氧化成r-氨基丁酸。1959年Hylin从烟草叶子和土壤中分离出5株微生物，其生长均以烟碱为唯一碳源和氮源，最后的纯培养物。有两株可能是Achromobacter Nicotinophagumn sp.的变种。其不产生芽孢，不能运动，严格需氧，是一种需维生素B12才能生长的革兰氏阴性菌。1976年Uchida和Maeda等人从烟田土壤和烟叶表面上利用0.2%烟碱作为唯一碳源的培养基分离得到能够降解烟碱的细菌，最后把这些细菌命名为球形节杆菌（Arthrobacter globiformils）和争论产碱菌（Alcaligenes paradoxus）。他们在0.2%烟碱作为唯一碳源的培养基中加入少量的葡萄糖，发现菌株在葡萄糖存在情况下，会具有降解烟碱活性，而在烟碱浓度由0.5%调为0.2%时，该菌株的生长较快；然后制作存在细菌的液体培养基连续5天喷洒到潮湿烟叶上，没有产生降解，加入葡萄糖，发现在2天内有明显的产生降解烟碱效果。1977年Geiss等从一种雪茄烟叶上分离出除去烟碱和硝酸盐的纤维单胞菌（Cellulomonas sp.）和能对烟碱产生降解作用的假单胞恶臭菌（Pseudomonas putida G-）。1981年日本的Maeda等人，研究来源于烟叶表面的细菌来降解烟碱-N-氧化物在国内烟草行业对微生物降解烟碱的应用情况还很少见报道,2001年王革等人，研究烟叶上筛选了3株有较强的降解烟碱的菌株，其对蛋白质也有一定的降解能力，微生物不同其降解能力也不同，其代谢产物也就不同。2005年浙江大学闵航实验室分离得到的高效烟碱降解菌株Pseudomonas sp.HF-1,用Vitek system(GNI)鉴定结果表明与Ps.fluorescens 和Ps.putida的相似性为85%，与Ps.aeruginos的同源性为14%。用Biolog GN Microplate 检测表明菌株HF-1与Ps.plecoglossicida FPC 961T(GenbankAccession NO.AB009457)和Ps.putida MT 4T(GenBank Accession No.AB180734),分别有98%和97.8%的序列同源性；其DNA中GCmol%为62.7；在含1.0gL1烟碱，培养温度30，150rmp的条件下25h内可降解92.2%-99.6%烟碱，呈现出十分高效的烟碱降解率。此外，菌株在降解烟碱的过程中，培养液的PH维持稳定，最后生成绿色的代谢产物这些特点在以前的相关报道中从未报道过。2005年袁勇军等人，于福建三明的烟草土壤中，筛选、分离得到具有高效降解烟碱能力的一株菌株，该菌株进行鉴定，通过其生理生化、形态、及16SrDNA序列同源性分析，最终确立为Ochrobactrum intermedium ,菌株能在温度为30-40、PH值为6.0-9.0的范围内达到较高的将降解活性，降解最好时的温度为30和PH为6.5，并且是能以烟碱为菌株生长的唯一碳源，其烟碱耐受浓度在无极盐培养基里培养时可达到4g/L1。2005年阮爱东等人筛选出一株假单胞菌（Pseudom onas sp.HF-1）培养基中培养25h，烟碱浓度为1.3g/L，测的烟碱降解率大99.6%。2005年李雪梅等人从烟草废料中筛选得到一株芽孢杆菌（Bacillus sp.X6）能有效降解烟碱，经过36h培养将烟草物料中6.04mg/g的烟碱降解了60.3%，经过72h的培养，烟碱降解可达87.6%。2006年李雪梅等人，从植烟土壤和烟叶叶面中提取，分离到对烟碱有降解作用的多株微生物，经筛选得到活性较高的菌Nic22，添加少量的淀粉和（NH4）2SO4为碳氮源，结果显示提高烟碱降解，用Nic22菌株提取所产酶液，可以处理烟叶。能缓解烟叶中刺激性，杂气，使得其品质明显提高。2006年李梅云等人也对微生物降解烟碱进行了实验，其采用微生物菌株培养液对烟叶的不同部位喷洒，发现不同部位的烟碱降解率各不相同，其差异显著，上部烟叶降解率达37.25%，中部烟叶降解率达36.9%；经过处理得到的烟叶品质有所改善，刺激性有所下降。1.3研究目的及意义 烟草业对于我国的经济甚至与全球的经济都具有重大的影响，但是烟草中的烟碱会影响人类的健康，这不得不引起社会的关注。因此，降低烟草中烟碱含量的研究就变得刻不容缓了。随着各种研究的不断深入发现利用微生物的方法来对烟草中的烟碱进行降解和处理，能产生较大的社会效益以及经济效益，更可以减少烟草工业产生出来废弃物对生态环境的污染和有效地降低烟碱对人类健康的危害。因此，研究微生物对烟碱的降解作用具有很大的发展潜力和前景。本文采用的菌株为A4菌株，并且对其进行了发酵条件优化设计，试验后找到了其最大降解的条件，为以后利用此菌株可以更加准确和有效地利用。2实验材料与仪器2.1实验材料2.1.1样品:菌种：在实验室中经过初筛，复筛，生理生化鉴定实验后得到的烟碱降解菌A4菌2.1.2 主要药品与试剂：K2HPO4 分析纯KH2PO4 分析纯MgSO4.7H2O 分析纯MnSO4.7H2O 分析纯CaCl2.2H2O 分析纯FeSO4.7H2O 分析纯柠檬酸三钠 分析纯乳酸 分析纯葡萄糖 分析纯麦芽糖 分析纯蛋白胨 分析纯硝酸铵 分析纯胰蛋白胨 分析纯氯化铵 分析纯 调PH的Nacl溶液和Hcl溶液2.1.3 培养基： （1）烟碱固体培养基K2HPO4 13.3g KH2PO4 4.0g酵母提取物 1.0g 微量元素溶液 10ml制法：将除琼脂以外的以上各成分溶于蒸馏水中定容至1000ml，调PH7.0，加入琼脂，加热煮沸，使琼脂融化，加入1.0g烟碱后分装到三角瓶中于高压灭菌锅，121灭菌20min4。（2）烟碱液体培养基：除上述烟碱固体培养基不加琼脂外，其他操作一致4。（3）配制微量元素溶液：MnSO4.7H2O 0.4g；CaCl2.2H2O 0.2g ；FeSO4.7H2O 0.2g 使用0.1mol/LHCl定容至100mL5。2.2 仪器及用具紫外分光光度计 WFZ-uv-2000 外商独资上海合利仪器有限公司低速离心机 SC-3610 安徽中科中佳科学仪器有限公司空气恒温摇床 KYC-100C 上海新苗医疗器械制造有限公司电热恒温鼓风干燥箱 DHG-905385 上海新苗医疗器械制造有限公司电子天平 YP2002 上海佑科仪器仪表有限公司电子万用炉 220V-1000W-AC 北京市光明医疗仪器厂超净工作台 上海新苗医疗器械制造有限公司高温灭菌锅以及各种规格的三角瓶、烧杯、比色皿等。3试验方法与步骤3.1试验流程 烟碱标准曲线的制作对A4菌进行活化菌株种液（烟碱培养液）的制备培养基初始PH对A4菌降解烟碱的影响温度对A4菌降解烟碱的影响接种量对A4菌降解烟碱的影响不同浓度烟碱A4菌降解烟碱的影响碳源A4菌降解烟碱的影响氮源对A4菌降解烟碱的影响四因素三水平的多因素正交试验单因素结果分析多因素结果分析3.2试验步骤3.2.1烟碱标准曲线的制作： 采用紫外分光光度计测定烟碱含量：取纯烟碱0.1g，用0.05mol/L的HCL稀释定容到1000mL，此时烟碱浓度为0.1mg/mL,分别吸取0、1、2、3、4、5、6、7mL与50mL容量瓶中，稀释至0、0、002、0.004、0.006.0.014mg/mL。以0号作为空白，进行全波长扫描，测的烟碱最大吸波长为260nm，在此波长下测的个稀释度中烟碱的吸光值，以烟碱浓度和吸光度为坐标轴绘制烟碱含量标准曲线，得出烟碱含量和吸光值的函数关系。3.2.2对A4菌进行活化配置烟碱降解菌适宜生长的培养基(烟碱培养基：烟碱1.0g；K2HPO4 13.3g； KH2PO4.0g；微量元素（MgSO4.7H2O 1.0g；MnSO4.7H2O 0.4g；CaCl2.2H2O 0.2g ；FeSO4.7H2O 0.2g 使用0.1mol/LHCl定容至100mL）10mL；用水定容至1000mL，调PH7.0，121灭菌20min5。菌种从保藏状态恢复到室温状态，比如将冷冻的菌种解冻，通过操作将保藏的菌种接种到培养基中培养，挑选培养基茁壮的菌落，挑选其中部分菌落接种到新的培养基中培养，重复此步骤2-3次，从而得到生长良好的菌落。经过以上步骤就到达将菌种从保藏状态活化的目的43.2.3A4菌菌株种液的制备接种1环A4菌到装有10mL烟碱液体培养基的试管中，于28，120r/min，培养48h。再将这10mL菌悬液接种到200mL液体培养基中，在相同的条件下培养48h3-4。3.2.4培养基初始PH对A4菌降解烟碱的影响：选择PH为6.0，7.0，8.0，做PH的单因素实验，每个PH值设置3个平行，以不含烟碱的培养基为空白对照，除空白外分别接种3mLA4菌的菌悬液到9个装有50mL液体培养基的三角瓶中，于28、120r/min，摇床培养3-4，48h后测定培养液中烟碱的吸光度，最后通过计算，得出不同PH下的烟碱降解率9-133.2.5温度对A4菌降解烟碱的影响 选择20、25、30、35、40做温度的单因素实验，每个温度设置3个平行，以不含烟碱的培养基为空白对照，除空白对照外分别接种3mL的A4菌的菌悬液到15个装有50mL液体培养基的三角瓶中，于各自相应的温度下、120r/min，摇床培养3-4，48h后测定培养液中烟碱的吸光度，最后通过计算，得出不同温度下的烟碱降解率9-13。3.2.6 接种量对A4菌降解烟碱的影响 选择1%、5%、10%、15%、20%做接种量的单因素实验，每个接种量设置3个平行，以不含烟碱的培养基为空白对照，除空白外分别接种3mLA4菌的菌悬液到15个装有50mL液体培养基的三角瓶中，于28、120r/min，摇床培养3-4，48h后测定培养液中烟碱的吸光度，最后通过计算，得出不同接种量下的烟碱降解 率9-13。3.2.7 不同浓度烟碱A4菌降解烟碱的影响 选择0.01%、0.05%、1.00%、1.50%、2.00%做烟碱含量的单因素实验，每个烟碱含量设置3个平行，以不含烟碱的培养基为空白对照，除空白外分别接种3mLA4菌的菌悬液到15个装有50mL液体培养基的三角瓶中，于28、120r/min，摇床培养3-4，48h后测定培养液中烟碱的吸光度，最后通过计算，得出不同烟碱浓度下的烟碱降解率9-13。3.2.8 碳源A4菌降解烟碱的影响 选择柠檬酸三钠，乳酸，葡萄糖，麦芽糖，做碳源的单因素实验，每个碳源设置3个平行，以不含烟碱的培养基为空白对照，除空白外分别接种3mLA4菌的菌悬液到12个装有50mL液体培养基的三角瓶中，于28、120r/min，摇床培养3-4，48h后测定培养液中烟碱的吸光度，最后通过计算，得出不同碳源下的烟碱降解率9-13。3.2.9 氮源A4菌降解烟碱的影响 选择蛋白胨、硝酸铵、胰蛋白胨、氯化铵做氮源的单因素实验，每个氮源设置3个平行，以不含烟碱的培养基为空白对照，除空白外分别接种3mLA4菌的菌悬液到12个装有50mL液体培养基的三角瓶中，于28、120r/min，摇床培养3-4，48h后测定培养液中烟碱的吸光度，最后通过计算，得出不同氮源下的烟碱降解率9-13。3.2.10 多因素正交设计实验根据单因素实验结果，选择四因素三水平进行正交实验，以确定复合因素对A4菌对烟碱的降解情况14-18。4 结果与分析4.1烟碱标准曲线的绘制管号01234567烟碱含量（mg/mL）00.0020.0040.0060.0080.0100.0120.014吸光度00.0540.1510.2280.3050.3820.4590.535这是在波长260nm下测定的一系列的烟碱稀释液的吸光度，得到的吸光值和烟碱浓度对应的标准曲线和函数关系为y=38.929*x-0.0082 R =0.9987,其中y为吸光度，x为烟碱含量g/L。 烟碱降解率的公式为:D%=100%*(C1-C2)/C1; C1:液体烟碱培养基中的初始浓度 C2：液体烟碱培养基中降解终止时的烟碱浓度4.2单因素结果分析4.2.1PH值对A4菌降解烟碱的影响PHOD(600)浓度（g/L）降解率（%）前后前后空白5.00.0390.0310.00120.001014.3%6.00.0420.0270.00130.0009-23.2%7.00.0310.0190.00100.000727.5%8.00.0390.0270.00120.000919.8%9.00.0420.0190.00130.001016.7% 培养基的初始PH变化能够影响细胞膜内外的物质运输，同时影响细胞内代谢酶的活性从而影响烟碱的降解率。图1中显示菌株A4菌的降解率随着PH值的变化而变化，PH值在5.0-7.0之间时，烟碱的降解率是随之增高的，降解率从14.3%上升到27,5%，但是当PH值增加到8.0时，烟碱的降解率呈下降趋势，从27.5%下降至19.2%，当PH值继续增加至9.0时，烟碱降解率下降至16.7%，但是从图1可以看出，PH值在8.0-9.0之间变化时，烟碱降解率的下降幅度很小，下降了2.5%。通过对图1的分析，可以看出该菌株适合在PH值为7.0的环境中生长。4.2.2温度对A4菌降解烟碱的影响温度（）OD(600)浓度（g/L）降解率（%）前后前后空白200.0310.0250.00100.000815.6%250.0310.0160.00100.000637.9%300.0310.0140.00100.000544.2%350.0310.0190.00100.000730.1%400.0310.0290.00100.00097.5% 温度影响着微生物的许多化学反应，过低温度会抑制酶的活性，过高的温度会使酶失活，从而影响微生物的降解率。图2表示温度在20-40范围内，烟碱降解率的变化趋势。温度从20-30，降解率从15.6%升至44.2%，但是当温度继续增加，A4菌的降解率呈急速下降形式，当温度升至40时，降解率从44.2%降至7.5%，由此可见温度过高可能酶失活，降解率降低。这说明A4菌承受低温的耐受性高于高温，从图2可以看出该菌株适合在20-35环境内生长，30时降解率最高。4.2.3接种量对A4菌降解烟碱的影响接种量（%）OD(600)浓度（g/L）降解率（%）前后前后空白10.0310.0260.00100.0008812.2%50.0310.0140.00100.0005742.3%100.0310.0130.00100.0005347.3%150.0310.0080.00100.0004258.1%200.0310.0160.00100.0006139.2% 在相同的环境中生活物种间存在着竞争关系，微生物会因为获取物质和能量的不同而影响其化学反应。从图3中反应，当接种量为1%时A4菌的降解率为12.2%，随着接种量的增加，菌株的降解率也随之增加，当接种量增加至15%时菌株的降解率达到最大值58.1%，但是随着接种量继续增加到20%时，从图3可以明显看出，A4菌株的降解率反而是下降的，这可能是由烟碱培养液中的营养物质有限，微生物之间存在竞争营养物质的情况从而影响了降解率，从图3可以看出当接种量为15%时降解率最高。4.2.4 不同含量烟碱对A4菌降解烟碱的影响烟碱含量（%）OD(600)浓度（g/L）降解率（%）前后前后空白0.10.0310.0250.0010.0008515%0.50.1860.1360.0050.0003726.5%1.00.3810.1900.0100.005148.8%1.50.5760.0310.0150.01033.0%2.00.7700.6430.0200.0167416.3% A4菌株利用烟碱作为唯一碳氮源生长，那么烟碱的浓度会因影响菌株的生长。从图4可以看出当烟碱含量在0.01%-0.05%变化时，烟碱的降解率比较低，当烟碱含量继续增加时，菌株的降解率也随之增加，从图看出当烟碱含量从0.05%上升至1.00%时，菌株降解率从26.5%上升至48.8%，但是当烟碱含量继续增加至2.00%时，菌株的降解率呈明显的下降趋势，当烟碱含量为1.00%时，降解率仅为16.3%。从图2可以看出当烟碱含量为1%时降解率最高为48.8%，从图4可以看出该菌株在烟碱含量为0.05%-1.50%范围内生长最佳。4.2.5 碳源对A4菌降解烟碱的影响碳源OD(600)浓度（g/L）降解率（%）前后前后空白蛋白胨0.0420.0220.00130.0007840.0%硝酸铵0.0390.0180.00120.0006843.2%胰蛋白胨0.0580.0170.00170.0006462.1%氯化铵0.0460.0170.00140.0006453.3% 在微生物细胞的组成中，碳源是不可缺少的重要元素之一，碳源的来源也会影响微生物的生长。从图5可以看出A4菌株降解率随着培养液中添加的碳源不同其降解率也随之改变。当培养液中添加柠檬酸三钠为碳源时，菌株的降解率最大为48.1%，当培养液中分别添加乳糖、葡萄糖和麦芽糖作为碳源时，A4菌株的降解率依次为28.3%、21.5%、30.2%，其中以葡萄糖作为碳源时的降解率最低为21.5%。4.2.6 氮源对A4菌降解烟碱的影响氮源OD(600)浓度（g/L）降解率（%）前后前后空白柠檬酸三钠0.0460.0200.00140.0007348.1%乳酸0.0420.0280.00130.0009328.3%葡萄糖0.0540.0420.00160.001321.5%麦芽糖0.0500.0350.00150.001130.2% 在微生物细胞的组成中，氮源也是不可缺少的重要元素之一，氮源的来源也会影响微生物的生长。从图5可以看出A4菌株降解率随着培养液中添加的氮源不同其降解率也随之改变。当培养液中添加胰蛋白胨作为氮源时，菌株的降解率最大为62.1%，当培养液中分别添加蛋白胨、硝酸铵和氯化铵作为氮源时，A4菌株的降解率依次为40.0%、43.2%、53.3%，其中以蛋白胨作为氮源时的降解率最低为40.0%。4.3 多因素实验分析 在烟碱含量为1%，温度30的条件下，根据单因素实验结果分析选择PH值、接种量、柠檬酸三钠和胰蛋白胨进行多因素的正交实验，在培养48h后检测液体中烟碱的含量从而计算出烟碱的降解率，最后选出A4菌株的最佳发酵条件。设计的四因素三水平正交表如下15-22。（其中每个水平做2个重复） 表1 正交试验数据安排表ABCDPH值接种量/%C源（柠檬酸三钠）D源（胰蛋白胨）16.05%1.0%0.5%27.010%1.5%1.0%38.015%2%1.5% 表2 多因素实验正交表试验号A(PH值)B（接种量）C（碳源、%）D（氮源/%）降解率/%11(6.0)1（5%）1(1.0%)1(0.5%)29.5212（10%）2(1.5%)2(1.0%)33.0313(15%)3(2.0%)3(1.5%)22.342（7.0）12338.05223146.56231242.073（8.0）13220.08321328.09332134.5K总293.8K184.887.599.5110.5K2126.5107.5105.095.0K382.598.888.888.3k128.329.233.236.8k242.235.83531.7k327.532.929.629.4R14.76.65.57.4最优水平A2B2C2D14.3.1正交实验的结果分析根据正交试验原理，选取A因素（PH）的三个水平A1、A2、A3进行分析，对于A1、A2、A3三组来说，它们的实验条件是完全相同的，所以可以进行直接比较，如果A因素对于整个实验指标没有影响，那么K1、K2、K3的值应该相等，可是经过计算K1、K2、K3的值不等，这就说明A因素的变动对实验结果会有影响。A因素对实验结果的影响可以根据K、K2、K3的大小来判断A1，A2、A3对实验指标的影响。由于K2K1K3，所以可以判断A2是A因素的最优水平。同理可以推算出B2、C2、D1分别为B、C、D因素的最优水平。四个因素最优水平的组合为：A2B2C2D1，A4菌株发酵条件的最优水平组合为PH值7.0，接种量10%，柠檬酸三钠含量为1.5%，胰蛋白胨含量为0.5%。 从表2中各个因素的极差值R大小可以看出，谁是影响该实验的主次因素。根据计算结果发现，R1R4R2R3，因此，影响实验的主次因素为ADBC4.3.2正交试验方差分析 在极差分析的基础上对最优组合A2B2C2D1进行显著性分析，列出方差分析表，结果见下表1,4。表3方差分析表变异来源SSdfMSFFa显著性A（PH）408.92204.422.9F0.01(2，9)=8.02*B(接种量)97.0248.65.5*D（胰蛋白胨）86.4243.24.9F0.05(2，9)=4.26*误差17.828.9总和610.117注：*表示极显著*表示显著 采用A4降解菌的降解率及极差分析的结果的数据来计算矫正数、总平方和、四个因素的平方和，误差平方和、总自由度以及因素自由度。由于在设计四因素三水平正交试验的时候没有考虑到空白列，所以在计算方差分析表的时候将极差值最小的C因素作为空白列，最后得到表3的方差分析表。从表3可以看出，各因素的F值都有不同程度的显著性，灵敏度也是有差异的。PH的F值=22.9显著高于F0.01(2，9)=8.02，因此PH在99%水平极显著。接种量F值=5.5和氮源的F值=4.9同样显著高于F0.05(2，9)=4.26但是却低于F0.01(2，9)=8.02，所以接种量和氮源在95%水平上显著在99%水平上不显著。经过极差分析和方差分析，因素A、B的优水平为A2、B2，因素D的水平变动对实验结果影响很小，从经济条件方面考虑，最终确定A4菌株发酵条件的最优组合为：A2B2C1D1即PH7.0、接种量10%、柠檬酸三钠含量1%、胰蛋白胨含量0.5%。4.3.3验证实验 以正交设计实验得出的最优组合进行实验验证，从而获得最理想的实验组合。根据PH7.0、接种量10%、柠檬酸三钠含量1%、胰蛋白胨含量0.5%、烟碱含量1%，温度30、120r/min，摇床培养，48h后测定培养液中烟碱的吸光度，最后通过计算，得出此组合下的烟碱降解率63.2%，同复筛时未优化的培养条件测的降解率33.4%相比，优化后的组合有明显的优势。所以本实验所选取的A4菌株降解烟碱条件的生长条件的最佳组合为PH7.0、接种量10%、柠檬酸三钠含量1%、胰蛋白胨含量0.5%、烟碱含量1%，温度30、120r/min。5小结及讨论 在单因素实验中，A菌株降解烟碱的最适PH值为7.0;该菌株适合在20-35环境内生长，30时降解率最高降解率为44.3%；当接种量为1%时A4菌的降解率为12.2%，随着接种量的增加，菌株的降解率也随之增加，当接种量增加至15%时菌株的降解率达到最大值58.1%；当烟碱含量在0.01%-0.05%变化时，烟碱的降解率比较低，当烟碱含量继续增加时，菌株的降解率也随之增加，当烟碱含量从0.05%上升至1.00%时，菌株降解率从26.5%上升至48.8%，A4菌株降解率随着培养液中添加的碳源不同其降解率也随之改变。当培养液中添加柠檬酸三钠为碳源时，菌株的降解率最大为48.1%；A4菌株降解率随着培养液中添加的氮源不同其降解率也随之改变。当培养液中添加胰蛋白胨作为氮源时，菌株的降解率最大为62.1%。以单因素实验为结果依据，进行四因素三水平的多因素实验，经过正交试验的极差和方差分析，得到最适合A4菌株的发酵条件，即PH7.0、接种量10%、柠檬酸三钠含量1%、胰蛋白胨含量0.5%、烟碱含量1%，温度30、120r/min，摇床培养，48h后测定培养液中烟碱的吸光度，最后通过计算，得出此组合下的烟碱降解率63.2%，同复筛时为优化的培养条件测的降解率43.4%相比，优化后的组合有明显的优势。菌株还可以进行其他方面的不同优化，观察是否有更适宜的条件，能否得到更高的降解率，这也是以后的研究方向。参考文献：1孔雯,先锋,李长影,王家昕,李晓华,1株烟碱降解菌的筛选、鉴定及其降解性能的初步研究,中南民族大学生命科学学院/ 生物技术国家民委重点实验室, 武汉4300742雷丽萍1，夏振远1,郭荣君2,赵坤芬1，降烟碱节杆菌发酵条件研究，1.云南省烟草科学研究所, 云南玉溪653100; 2.中国农业科学院植物保护研究所、植物病虫害生物学国家重点实验室, 北京1000813李珏，降烟碱微生物的筛选及其初步应用，江南大学4夏露烟碱降解微生物筛选，鉴定及降解条件的优化 湖南农业大学5万虎1,赵海刚2,宋纪真3,JinByungRae4,李建洪*1,高浓度烟碱降解菌的筛选、鉴定及降解特性,1. 华中农业大学植物科技学院, 武汉市南湖狮子山街1号 430070,2. 山东淄博烟草有限公司, 山东省淄博市张店区商场西街143号 255035 ,3. 中国烟草总公司郑州烟草研究院, 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