好氧反硝化菌的分离纯化及特性研究毕业论文.doc

好好氧氧反反硝硝化化菌菌的的分分离离纯纯化化及及特特性性研研究究 毕毕业业论论文文 目目 录录 1 SOD 的发现和分类 5 2 SOD 的分布和定位 6 3 材料与方法 7 3 1 材料与试剂 7 3 2 仪器 8 3 3 方法 8 3 4 SOD 的鉴定 9 3 5 超氧化物歧化酶 SOD 活力测定 9 3 6 蛋白质含量测定 9 4 结果 9 4 1 沉淀法分离 SOD 9 4 1 1 热变性温度对提取 SOD 的影响 9 4 2 硫酸铵分级沉淀法浓缩 SOD 10 4 3 综合法提纯 SOD 11 4 4 电泳鉴定 SOD 12 5 讨论 12 5 1 实验误差 12 5 2 单一方法与综合法的比较 13 5 3 在实际中的应用 13 致谢 15 参考文献 16 好氧反硝化菌的分离纯化及特性研究 2 1 1 SODSOD 的发现和分类的发现和分类 自 1956 年解析肌红蛋白及血红蛋白晶体结构以来 至今已阐明了上 百个蛋白质晶体的结构和几个 t RNA 结构 蛋白质晶体学已作为一门边缘 学科而确立 随着科学技术的发展和实验技术的不断完善 科学工作者通 过各种手段能够获得生物大分子的基本结构信息 并可进一步获得有关作 用机理调节原理的有力的信息 为设计各种生物实验提供坚实的基础 自从 Mann 和 Keilin 于 1938 年首次从牛红血球中分离出一种蓝色 铜蛋白 最初定名为血铜蛋白 并由 McCord 和 Fridocivh 于 1969 年根据 其酶活特性定名为超氧化物歧化酶以来 人们对它的研究不断深入 近年来 的研究表明 在维持生物体内的产生与消除的动态平衡中起重要作用 它 能防御氧毒性 增强机体抗辐射损伤能力 还可预防衰老 在一些疾病如 肿瘤 炎症及自身免疫疾病等的治疗中有良好的疗效 目前国内对的研究 主要集中在应用及与应用直接相关的基础理论的研究上 SOD 已进入化妆 品 食品 医药等领域 无可置的应用与开发将有不可估量疑的前景按其 结合的金属离子 可分为 Fe SOD Mn SOD CuZn SOD 三种 前两种性质 相似 在蛋白质一级结构空间结构 分子量 光谱性质及对不同抑制剂的 敏感等方面与后者差别较大 早些时候认为 Fe SOD 主要存在原核细胞中 随实验手段的改进 现已在枸杞 何首乌等越来越多的维管植物中发现 Fe SOD 的存在 9 Mn SOD 在原核细胞和真核细胞中都存在 CuZn SOD 主要存在于真核细胞中 由此引出进化方面的研究 一般认为 Fe 型 Mn 型 SOD 很早起源于一个共同的祖先 光合细菌 而 CuZn SOD 是在以后的发 展中单独进化而成 10 2 2 SODSOD 的分布和定位的分布和定位 SOD 是生物体防御氧毒性的关键性防线 人们最初认为只 SOD 存在于 好氧生物和耐氧生物中 而专性厌氧生物中不存在 1973 年 Bell 发现在 好氧反硝化菌的分离纯化及特性研究 3 厌氧菌硫酸还原菌中有 SOD 的活力 以后 SOD 活力在多种厌氧菌中被发现 只是活力较低 不易检测 专性厌氧菌 SOD 可以在细菌偶尔暴露于低浓度 氧环境中时抵抗氧毒性 比如专性厌氧菌从一个无氧环境到另一个低氧环 境过程中就需要这种保护 真菌里一般含 Mn SOD 和 CuZn SOD 大多数真核藻类在其叶绿体基质 中存在 Fe SOD 类囊体膜上结合着 Mn SOD 这与原核蓝细菌相似 这些研 究结果都支持藻类叶绿体起源于蓝细菌内共生的假说 大多数藻类不含 CuZn SOD 蓝藻中极大螺旋藻 钝顶螺旋藻和盐泽螺旋藻中含 Fe SOD 绿藻 中不含 CuZn SOD 而含 Fe SOD 和 Mn SOD 轮藻中含 Fe SOD Mn SOD 和 CuZn SOD 三种类型 提示轮藻可能是绿藻向高等植物进化的过渡形式 植物细胞中的 Fe SOD 主要存在于叶绿体中 9 罗广华等用大豆下胚轴 为材料证明 SOD 活性主要存在于细胞质中 约占细胞内 SOD 的 87 3 其次 分布于线粒体中 这部分约占实验又表明细胞质的 SOD 以 CuZn SOD 为主 占胞质 SOD 的 86 线粒体 SOD 主要是 Mn SOD 占线粒体全部 SOD 的 74 76 王爱国 罗广华等将线粒体分离为外膜 内膜 基质膜间溶质 4 个部分 进一步证明大豆下胚轴线粒体内 SODD 主要在基质 80 97 且验证为 Mn SOD 其次分布在膜间溶质 16 17 且验证为 CuZn SOD 线粒体的内膜 一侧为基 质 另一侧为膜间溶质 内膜呼吸链上产生的 O2 能迅速被两侧 SOD 清除 可见植物线粒体在正常情况下对自身 O2 的防卫 能力已经相当完善 10 大多数原始的无脊椎动物细胞中都存在 CuZn SOD 这表明在动物进化 早期就有这类 SOD 脊椎动物一般含 CuZn SOD 和 Mn SOD 人 鼠 猪 牛 等红细胞和肝细胞中含 CuZn SOD 而从人和动物肝细胞中也纯化了 Mn SOD CuZn SOD 主要存在于细胞质也存在于线粒体内外膜之间 Mn SOD 一 般存在于线粒体基质中 SOD 是细胞内酶 但在人血清中分离到一种独特 的细胞外 CuZn SOD 不同于一般的 SOD 这种 SOD 已在多种动物细胞里发 现 从进化上来说是真核生物酶 但在某些细 D 菌如与鱼类共生 的发 光杆菌中含有 CuZn SOD 10 植物超氧化物歧化酶的制备工艺 其主要目的是纯化植物中的 SOD 最 好氧反硝化菌的分离纯化及特性研究 4 大限度地清除杂蛋白 因此 常用的方法主要有热变性法 等电点沉淀法 盐析法 有机溶剂沉淀法 超滤法层析法 2 等 而本文主要探究超氧化 物歧化酶的概况及制备工艺 比较几种常用工艺 热变性法等电点沉淀法 简单 不需加其他试剂 但不能大幅度提高 SOD 的比活 盐析法有利于保 持蛋质的生理活 3 性 但分辨率低 离子交换层析主要用于高纯度的 SOD 精品的制备 处理量小 本研究将几种简单工艺相结合 扬长避短 找出 一套既简便又能有效提高 SOD 纯化倍数的方法 3 3 材料与方法材料与方法 3 3 1 1 材料与试剂材料与试剂 黄瓜 氯化硝基四氮唑蓝 NBT 甲硫氨酸 二乙基氨基乙基纤 维素 DEAE 四甲基乙二胺 TEMED 三羟甲基氨基甲烷 Tris 丙烯酰 胺 国药集团化学试剂有限公司 甲叉双丙烯酰胺 中国医药集团上海化 学试剂公司 等化学试剂均为分析纯 标准蛋白采用上海生物化学试剂公司 产的牛血清白蛋白 考马斯亮蓝 G 250 上海化学试剂分装厂 3 3 2 2 仪器仪器 722 光栅分光光度计 上海精密科学仪器有限公司 DYY 2 稳压稳 流电泳仪 北 京市六一仪器厂 电热恒温水浴锅 JK S26 型 上海华联医 疗器械有限公司 高速冷冻离心机 D 37520 Osterode Kendro Laboratory Products LGJ 10 冷冻干燥机 军事医学科学院实验仪器 厂研制 北京松源滑行科技发展有限公司制造 HD 3 紫外检测仪 上海 沪西分析仪器厂 DHL A 电脑恒流泵 上海沪西分析仪器厂 DBS 100 电脑全自动部分收集器 上海沪西分析仪器厂 3 3 3 3 方法方法 将黄瓜用清水洗净 称取 100 g 以 1 5 1 比例 加入 pH7 8 0 05mol L 的磷盐缓冲液 150ml 先加 75ml 磷酸盐缓冲液和少许石英砂 用 高速组织捣碎机充分搅碎 在 12 000min 4 离心 40 min 使悬浮物完全 沉淀 取沉淀再加入 75 ml 磷酸盐缓冲液 冰浴充分研磨 并 12 000 好氧反硝化菌的分离纯化及特性研究 5 r min 4 下离心 40 min 弃去沉淀 合并两次上清液 制得粗酶液 将 粗酶液静置于 55 恒温水浴锅中 25 min 进行热变性 使杂蛋白变性沉淀 下来 再在 4 下 12000 r min 离心 20 min 弃去沉淀 保留上清液 用 0 mol L 盐酸调节上清液 使其 pH 达到 5 0 在 4 下 12 000 r m 离心 20 min 收集上清液 在上清液中加入固体硫酸铵粉末 使溶液达到 45 的饱和度后 用玻璃棒搅拌 30 min 然后冷藏静置 2h 再在 4 12 000 r min 离心 40 min 去除沉淀 取上清液 再加入固体硫酸铵粉末到 90 饱 和度 搅拌 30 min 冷藏过夜 再在 4 12 000 r min 离心 60 min 取 沉淀 溶解于 pH7 8 0 0mol L 的磷酸盐缓冲液中 4 透析过夜 待 上柱 预先处理 DEAE 纤维素 装柱 将待上柱的酶液加入层析柱中 用 pH7 8 0 05 mol L 的磷酸盐缓冲液进行洗脱 洗脱速度控制在 3 ml min 以每管 3 ml 收集洗脱物 收集 70 管 将收集 SOD 活性峰的部分 合并 测定蛋白峰处各管的酶活力 U 及蛋白质含量 mg 将收集的酶液 4 透析 再置于 70 冰箱中 冷冻过夜 用冷冻干燥机将酶液制成 干粉 即为成品 3 3 4 4 SODSOD 的鉴定的鉴定 本实验采用聚丙烯酰胺凝胶电泳 PAGE 及 SOD 酶活性染色来鉴定 纯化物确为 SOD 4 3 3 5 5 超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶 SOD SOD 活力测定活力测定 用 NBT 光还原法来测定超氧化物歧化酶的活性 根据光照时体系 中产生氧自由基使 NBT 还原成蓝色甲簪 在 560 nm 处有一吸收峰 而超 氧化物歧化酶作为氧自由基的清除剂可抑制此反应 酶活性单位采用抑制 NBT 光还原 50 为一个酶活性单位表示 5 3 3 6 6 蛋白质含量测定蛋白质含量测定 以考马斯亮蓝 G250 在 595 nm 波长下制作标准曲线 再进行样品液 中蛋白质含量测定 根据所测定的 A595 值 在标准曲线上查出其相当于 标准蛋白的量 重复 3 次取平均值 通过计算求出样品中蛋白质含量 mg 好氧反硝化菌的分离纯化及特性研究 6 4 4 结果结果 4 4 1 1 沉淀法分离沉淀法分离 SODSOD 本实验通过热变性沉淀法 等电点沉淀法从黄瓜中分离 SOD 在此过 程中 热变性温度 pH 的选择均对分离提取 SOD 存在影响 4 4 1 1 1 1 热变性温度对提取热变性温度对提取 SODSOD 的影响的影响 SOD 是一种热稳定性很好的酶 当温度低于 80 时 短时间的热 处理 酶活力不会有明显的变化 而一般杂蛋白却在高于 55 时就易变 性沉淀 因此选择不同温度及时间对粗酶液进行热击 酶活性结果见表 4 1 表表 4 14 1 热变性温度和时间对热变性温度和时间对 SODSOD 活性活性 U U 的影响的影响 温度 T SOD U 15 min 20min 25min 30min 50 64 5573 154 0696 144 4797 140 8397 55 98 2798 130 4797 167 3171 113 1197 60 102 3048 81 4098 68 1098 64 1898 表 4 1 结果表明 在 55 下热击 25 min 时 酶活性最大 因此确定选择 在此温度 时间进行处理 则 SOD 粗酶液在热击前后结果见表 4 2 表表 4 24 2 热变性前后处理结果比较热变性前后处理结果比较 总蛋白 总 SOD 酶 比活 纯化 时间 含量 m mg 活 U C U mg 1 倍数 热变前 23 362 4 189 123 3 8 095 9 1 00 热变后 13 937 3 167 317 1 12 005 0 1 48 从表 4 2 可发现 热变性前后 总蛋白含量从 23 362 4mg 下降到 13 9373 mg 而 SOD 酶活却没有明显变化 说明粗提液中部分杂蛋白被除 去 而单用此方法提纯 SOD 其纯化倍数为 1 48 倍 2 1 2 不同 pH 对分离 SOD 的影响 在 pH 值 1 0 7 0 范围内 调节 SOD 粗酶液的 pH 值 研究不同 pH 对 SOD 分离的影响 好氧反硝化菌的分离纯化及特性研究 7 图图 4 14 1 不同不同 PHPH 处理结果处理结果 从图 4 1 可知 用等电点沉淀法处理粗酶液 在 pH 5 0 时 总 蛋白含量最低为 8 69 mg SOD 总活力最高为 115 42 U 比活为 13 2819 U mg 1 纯化倍数为 1 64 倍 pH 大于 5 0 后 总蛋白含量逐渐 恢复 说明大部分蛋白在 pH 为 5 0 时被去除 此时纯化效果最佳 4 4 2 2 硫酸铵分级沉淀法浓缩硫酸铵分级沉淀法浓缩 SODSOD 对 SOD 粗酶液进行硫酸铵分级沉淀 首先选择最佳的硫酸铵饱和度 30 55 清除杂蛋白 12 000 r min 离心 40 min 弃去沉淀 测出 上清液中总蛋白质含量及总 SOD 酶活性 见表 3 再选择一定浓度的硫 酸铵饱和溶液 60 90 使 SOD 呈盐析状态 沉淀出来 测定其总蛋 白质含量及总酶活 结果见表 4 4 表表 4 34 3 第第 1 1 步硫酸铵沉淀结果步硫酸铵沉淀结果 总蛋白总 SOD 比活 浓度 含量 mg 酶活 U U mg 1 30 20 16 182 34 9 044 6 35 18 62 176 41 9 474 2 40 16 45 201 08 12 223 7 45 10 89 185 42 17 026 6 50 12 51 178 64 14 279 8 55 16 81 176 90 10 523 5 表 4 3 4 4 结果表明 用硫酸铵分级沉淀法处理粗酶液 在饱和度 为 45 和饱和度 90 时 SOD 比活最高 分别为 17 026 6 U mg 1 和 20 6514 U mg 1 说明分离效果最明显 因此若用此方法提纯 其纯化 倍数分别为 2 10 和 2 55 好氧反硝化菌的分离纯化及特性研究 8 4 4 3 3 综合法提纯综合法提纯 SODSOD 按本实验的方法 将热变性法 等电点沉淀法 硫酸铵分级沉淀法相 结合处理 再经 DEAE 纤维素离子交换柱 1 5 cm 25 cm 层析纯化 用 pH7 8 0 05mol L 的磷酸缓冲液洗脱 流速在 3 ml min 每管收集 3ml 洗脱液 洗脱曲线和酶活测定结果如图 2 洗脱曲线上出现 2 个蛋白峰 经活力测定后发现酶活性峰与峰 基本重合 所以峰 为杂蛋 白 合并 SOD 活性部分 4 透析 再置于 70 冰箱中 冷冻过夜 冷 冻干燥浓缩后 用于电泳鉴定 表表 4 44 4 第第 2 2 步硫酸铵沉淀结果步硫酸铵沉淀结果 浓度 总蛋白含量 m mg 总 SOD 酶活 m U 比活 C U mg 1 60 5 11 86 25 16 878 7 65 5 86 101 22 17 273 0 70 6 48 125 76 19 407 4 75 6 95 130 27 18 743 9 80 7 58 142 84 18 844 3 85 8 01 154 43 19 279 7 90 8 49 175 33 20 651 4 图图 4 2 DEAE 纤维素离子交换提取纤维素离子交换提取 此综合法的提纯效果与单一方法提纯相比 SOD 酶比活力 明显有大幅度的提高 结果见表 5 表表 4 54 5 综合法分离提纯黄瓜超氧化物歧化酶的结果综合法分离提纯黄瓜超氧化物歧化酶的结果 总蛋白 总活力 比活 回收率 分离步骤 纯化倍数 m mg m U C U mg 1 粗酶 23 362 4 189 123 3 8 095 9 10 0 1 00 热变性 13 937 3 167 317 1 12 0050 88 47 1 48 等电点沉淀 5 851 4 14 1 167 7 24 125 5 74 64 2 98 45 饱和硫酸铵 3 611 5 129 422 2 35 836 1 68 43 4 43 90 饱和硫酸铵 1 836 0 92 121 2 50 175 0 48 71 6 20 DEAE 离子交换 0 390 2 34 820 7 89 238 1 18 41 11 02 好氧反硝化菌的分离纯化及特性研究 9 从表 4 5 中可以看出 黄瓜 SOD 分离纯化前的比活为 8 0959U mg 1 经最终纯化后的比活为 89 2381U mg 1 纯化倍数为 11 02 回收率为 18 41 4 4 4 4 电泳鉴定电泳鉴定 SODSOD 将浓缩干燥后的成品 溶解于 pH7 8 0 05mol L 的磷酸缓冲液中 进 行聚丙烯酰胺凝胶电泳 6 h 用 SOD 活性染色 提纯后的物质经电泳处理 再进行 SOD 活性染色后 出现一条透明 条带 因此 可以确定 该提纯物质确为超氧化物歧化酶 5 5 讨论讨论 5 5 1 1 实验误差实验误差 实验过程中 对 SOD 各步的酶活力和总蛋白含量进行计算 其比活 和纯化倍数较低 可能与操作过程中样品放置时间的长短和试材的质量有 关 另外 在运用聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定 SOD 时 发现最终的电泳条带 只有一条 可能是由于提纯物中还存在一定量的杂蛋白 也可能与点样中 SOD 含量有关 据有关文献显示 通过离子交换后 总蛋白含量一般在 4 10 mg 6 7 而本实验只是从 100 g 黄瓜中提取 其最终总蛋白含量为 0 390 2 mg 因此其余两条带不能清晰显现 5 5 2 2 单一方法与综合法的比较单一方法与综合法的比较 从结果分析可知 若用热变性法处理粗酶液 在 55 下热击 25 min 部分杂蛋白被去除 比活从 8 095 9 U mg 1 上升至 12 005 0 U mg 1 此工艺的纯化倍数为 1 48 回收率为 88 47 若用等电点沉 淀法 选择 pH 5 0 时处理粗酶液 则提纯后总蛋白含量为 8 69mg 酶 总活力为 115 42U 比活为 13 281 9 U mg 1 纯化倍数为 1 64 回收 率为 61 03 若只采用 45 和 90 的饱和硫酸铵处理粗酶液时 酶的比活 则分别为 17 026 6U mg 1 和 20 651 4U mg 1 纯化倍数分别为 2 10 和 2 55 回收率分别为 98 04 和 92 71 而用综合法提纯 SOD 提 纯后总蛋白含量为 0 390 2 mg 酶总活力为 34 820 7 U 比活为 89 238 1 U mg 1 纯化倍数为 11 02 回收率为 18 41 因此可以看出 用 好氧反硝化菌的分离纯化及特性研究 10 单一方法提纯粗酶液 其比活和纯化倍数均不是很高 说明单一方法分离 提纯 SOD 不能有效提高其纯度 5 5 3 3 在实际中的应用在实际中的应用 从整个制备工艺提纯后的回收率中 我们发现提纯步骤越多 最终 获得的蛋白含量越少 也就是说 在每步提纯之后 杂蛋白被逐渐去除了 达 到了预期的目的 但从另一方面看 若将此方法用于工业化生产 虽说最 终 SOD 酶比活力能达到 89 238 1 U mg 1 可回收率却只有 18 41 那 么在投放市场后 企业的投入与产出就不能有效地达到平衡 所以 若作 为企业生产 则最好是酶的比活要高 且回收率也要高 要在两者之间寻 找一个平衡点 见图 4 由图 4 可知 在第 4 第 5 步时 即在硫酸 铵分级沉淀后 比活与回收率乘积最高 此时比活约为 45 005 6 U mg 1 回收率约为 58 57 最适宜企业生产 最可能得到可观收益 综合考 虑 若要获取高比活的精制品 则本实验工艺可以满足需求 若要符合实 际生产投放市场 则可适当减少提出步骤 提纯工艺只到硫酸铵分级沉淀 为止 图图 5 15 1 比活与回收率乘积比活与回收率乘积 通过将黄瓜粗酶液经热变性沉淀 等电点沉淀处理后 再经 45 90 硫酸铵 分级沉淀和 DEAE 纤维素离子交换层析 四步纯化后 用聚丙烯酰胺凝胶电泳及 SOD 活性染色进行鉴定 确定提取得到的为黄瓜 SOD 酶 实验结果表明 黄瓜 SOD 酶的比活为 89 238 1 U mg 1 回收率为 18 41 提纯倍数为 11 02 倍 工艺所 用时间约为 48 h 很明显 提纯效果比单一使用某一方法要好 因此若要获取高比活 的精制品 则本工艺可以满足需求 若要符合实际生产投放市场 则可适当减少提纯步 骤 提纯工艺只到硫酸铵分级沉淀为止 好氧反硝化菌的分离纯化及特性研究 11 致谢致谢 我的这篇毕业论文的完成 首先应当归功于指导老师原东林老师 他 无论是在讲课 室内资料整理还是在论文的撰写等各个方面都给予了大量 的指导和帮助 令我不但完成了论文 也学到了许多书本上学不到的知识 受益匪浅 特致以深深的感谢 同时也要感谢王文静同学的帮助 我们共 同完成实验和部分室内整理工作 另外还要感谢实验室 系资料室及复印 室的各位工作人员的帮助与合作 感谢我所有同学在这次论文中所给与的帮助 也感谢焦作大学化工 与环境工程学院所有老师的帮助和鼓励 感谢老师在实习中给予的悉心指 导以及在论文的写作中给与的帮助 同时也感谢在三年的学习中各位老师 对我的帮助和支持 随着这篇毕业论文的最后落笔 我三年的大学生活也即将划上一个圆 满的句号 回忆这三年生活的点点滴滴 从入学时对大学生活的无限憧憬 到课堂上对各位老师学术的羡慕 种种的一切 让人无限留恋 十分珍惜 好氧反硝化菌的分离纯化及特性研究 12 在此再一次感谢我的指导老师 正是由于他们在百忙之中多次审阅全 文 对细节进行修改 并为本文的撰写提供了许多中肯而且宝贵的意见 本文才得以成型 从而使我对 SOD 有了较系统的认识 最后 我要向在百忙之中抽时间对本文进行审阅 评议和参加本人论 文答辩的各位老师表示忠心的感谢 参考文献参考文献 1 丁 琳 姜 红 王丹焱 等 榆树叶超氧化物歧化酶的纯化及性质研究 J 沈阳化工学院学报 2005 19 4 262 2 金绍黑 植物超氧化物歧化酶的提取 修饰制备工艺及其应用研究 J 成都 航空职业技术学院学报 2005 21 1 44 3 邓 旭 李清彪 孙道华 等 从大蒜细胞中分离纯化出超氧化物歧化酶 J 食品科学 2001 22 9 47 4 姚澍晖 蕨菜 SOD 同工酶分析 J 特产研究 20