产前诊断中的基因检测　李运星.doc

产前诊断中的基因检测四川省妇幼保健院生殖中心；四川省计划生育科研所遗传室 李运星 以简炼的方式介绍产前诊断基因水平诊断的技术方法，并加以常见的病例给予说明，值得基层的产前诊断与优生优育工作者一阅。 基因检测在产前诊断中是十分重要，且正在不断发展与完善，其实质是在DNA水平或RNA水平对某一基因进行分析，从而对特定的疾病进行诊断。基因诊断始于1978年，美国科学家首先将限制性片段长度多态性（RFLP）用于基因诊断，从而揭开了基因诊断的序幕，基因诊断不仅可以明确指定个体是否患病，存在基因缺陷并揭示基因状态，而且可以对表型正常的携带者、对某种疾病的易感者作出诊断和预测。分子遗传检测技术大致可分为酶谱分析法、聚合酶链反应（PCR）、探针杂交分析法、DNA测序等方法。实际上，临床上多将这几种技术联合应用于基因检测。一、限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism, RFLP）人群中不同个体基因的核苷酸序列存在差异，称为DNA多态性。DNA顺序上发生变化而出现或丢失某一限制性内切酶位点，使酶切产生的片段长度和数量发生变化称为RFLP。任何一个基因内切大片段的缺失、插入以及基因重排，即使不影响到限制性内切酶位点的丢失或获得，也很可能引起限制性内切酶图谱的变化，使限制性内切酶片段的大小和数量发生变化，因而这类基因突变可以通过限制性内切酶DNA或结合基因探针的杂交方法将突变找出。例如1.镰形红细胞贫血症的基因诊断：已知镰形红细胞贫血症的突变基因是编码珠蛋白链的第6位密码子由GAG变为GTG，可用限制性内切酶Mst进行检测。因为这一突变使正常存在的Mst切点消失，这就使正常情况下存在的1.1kb及0.2kb条带变成患者（纯合子）的1.3kb条带。2.血友病A的诊断血友病A是一种X连锁隐性遗传病。用V因子基因的cDNA片段作为探针对待检者DNA酶切片段进行杂交，就可检出V因子基因部分缺失的男性患者和女性携带者。下图家系-1患有严重的血友病A，经V因子治疗后产生V因子抑制物。用两种不同的内切酶和探针组合对家系成员作RFLP分析。应用Bcl I/探针B（V因子基因）V因子基因部分缺失所致血友病A的基因诊断探针A是V因子基因1.7kb Kpn I cDNA 片段，包括112外显子。探针B是V因子基因4.7kb EcoR I cDNA 片段，包括1425和部分26外显子。A、B、C、D代表X染色体。患者无Bcl/探针1.2和4.4bk,但有Sst I/探针A14.5kb、4.7kb EcoR IcDNA片段，包括1425和部分26外显子，患者不见1.2kb和4.4kb。应用Sst I/探针A（因子基因1.7kb Kpn IcDNA片段，包括112外显子），患者和他的母亲（必然杂合子）出现异常的14.5kb。这一实验结果表明，V因子基因3端部分缺失后，其5端残留部分可由Sst I/探针A检出。杂合子兼有Bcl I/探针B检出的1.2kb和4.4kb与Sst I/探针检出的14.5kb。二、PCR技术在遗传病基因诊断中的应用特点 1983年Kary Mullis 发明了PCR技术。这项生命科学发展史上具划时代意义的技术一出现，首先就被分子遗传学家应用于几种常见的人类单基因遗传病的基因诊断、携带者检查和产前诊断，例如镰形红细胞贫血病（Sicle Cell Anemia）、地中海贫血（Thalassemia）、DMD/BMD（进行性肌营养不良）、血友病（Hemophilia）等等。我国1987年启动的国家高技术发展计划（863），对遗传病的基因诊断及相关新技术的研究结予了支持，及时拥有国际先进技术，完成了多项重要研究课题，获得了一大批科研成果。当时已完成了十多种遗传病的三十多例高危胎儿的产前基因诊断。 视频：PCR原理 (让我们用动画了解)PCR技术被称为试管里的基因克隆术，靶基因片段以2n的指数形式迅速增加（n代表循环数）。30个热循环后，靶DNA拷贝数就扩增上百万倍之多！而这仅仅需要约23个小时。PCR反应结束后，运用琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯胶电泳（PAGE, polyacrylamide gelelectrophoresis）进行PCR产物的分离分析，经溴乙啶（EB）染色或银染，即能观察到特定长度的DNA区带图谱。根据图谱即可作出基因诊断，也可对PCR产物进一步酶切，克隆或直接测序。值得指出的是，PCR并不仅仅是一个简单的DNA扩增反应，而是一项可以作出千变万化的改造，从而衍生出许许多多反应，运用于各种不同的研究和基因检测之中。 我国地中海贫血是由于位于第11号染色体上的珠蛋白基因序列中的十几种点突变。应用PCR及ASO（allelespecifice oligonucleotide，即等位基因特异的寡核苷酸探针技术），根据杂交图谱可作出突变型诊断，结果准确可靠；但有几种探针就得作几次杂交，相当繁琐费时。很快发展了一种称为3，-碱基特异的PCR或ASA（等位基因特异的扩增）技术，将突变碱基直接设计合成在特异引物的3，末端的第一个碱基位置上，当用来与另一端一条公用引物进行PCR时，出现特异长度扩增带，就表示模板中存在该种突变，反之表示无该种突变。该方法虽操作很简便，不需杂交，但技术精度要求高，否则会出现假阳性或假阴性结果。目前国内多采用反向斑点杂交膜的方法，来检测运用PCR技术扩增并作标记的珠蛋白基因片段（在液相中）。点在膜上的是所有十几种突变和正常的寡核苷酸片段，这样一次杂交下来，就可检出具体的突变类型，从而作出基因诊断或检出携带者，或作出高危胎儿的产前诊断。该技术显然较PCR/ASO要简便许多；但由于这么多ASO在相同的条件下进行杂交、洗脱，故有时也难免出现假阳性或假阴性信号。 如右图，重型-地中海贫血：出生后即严重贫血，肝脾肿大。生长缓慢，反应迟纯。导致我国地中海贫血的则是由于位于第16号染色体上的珠蛋白基因族的三种大片段的缺失所致（分别缺失20Kb, 3.7Kb, 4.2kb），另有2种点突变只占很少一部分。在缺失断点两侧设计三个引物，可直接检出缺失并区分杂合子与纯合子。对于另外两种非缺失型珠蛋白基因点突变，就得采用PCR技术结合检测点突变的技术，如SSCP（单链构象多态性），DGGE（变性梯度凝胶电泳），dHPLC (变性高效液相层析)，3，- 碱基特异的PCR，ASO或DNA测序等技术。由于a- 地贫基因诊断试剂盒不久即将问世。该试剂盒是含有7个引物的多重PCR体系，每份DNA标本只须做单管PCR，产物用琼脂糖凝胶电泳分离。根据电泳图谱即可作出分子遗传学诊断，详见下表。甲型血友病（HA）是常见的一种X-连锁隐性遗传病，由于X染色体上的凝血因子基因（F）缺陷所致。但F长达186Kb，由26个外显子，25个内含子组成，已报道的突变类型有二百多种点突变，五十余种小缺失，十几种插入，八十多种大的缺失，及很长的基因倒位（Inversion）等等。利用一种长距离PCR技术，可直接为40%以上的重型HA患者作出诊断，也可直接作携带者检查及产前诊断。对于不是倒位的HA家系，则采用间接基因诊断方法，包括PCR/Bell酶切片段长度多态性（RFLP），PCR/VNTR（重处长串联数目可变多态性）及PCR/（CA）n二核苷序列重复数目多态性技术进行家系成员基因连锁分析，检出携带者，并进行产前诊断，不需花费巨大工作量去查清其具体突变是什么。但此类间接诊断技术有局限性，例如必须得有先证者的DNA样品，携带者必须是某多态性的杂合子才能进行产前诊断，每一种间接诊断技术的可诊断率约在70%75%左右。联合运用二种甚至三种间接诊断技术，以保证对所有家系都能进行携带者检出和产前诊断。唐氏综合征，是染色体数目异常（21-三体）引起的智力低下的先天性疾病，在我国新生儿中发病率高达1/750。运用PCR扩增21号染色体上6个STR（短串联重复序列）位点，以及PAGE技术可产前诊断该病。从以上例子可以看出，运用PCR技术进行基因诊断有几个特点：（1）它要检测的是人类基因组中特定的靶基因片段，其PCR的模板是人的基因组DNA，能得出明确诊断结果；（2）涉及到的技术方法种类多，不但要查出靶基因，而且要求查出具体突变基因。能像检测病毒、细菌的试剂那样形成大批量者，只有-地中海贫血、-地中海贫血、唐氏综合征、HLA配型等少数试剂盒。（3）标本受污染机会较少。当然这绝不意味着可以放松、放宽运用PCR技术进行遗传病基因诊断、产前诊断工作的管理和质控。尤其是产前基因诊断的结果涉及到胎儿的命运，而一个假阴性的结果可能生出一个病孩。在过去十几年中，确曾发生过这类的事例，造成了不良后果。因此必须使产前诊断结果做到万无一失，同时要进行技术人员的培训及开展实验室的资格认证，使这方面的工作得到健康有序的发展。三、无创产前基因诊断技术产前基因诊断的取材一般是孕早期取少量绒毛或孕中期取羊水。这些操作应该由具实践经验的医生进行，尽量降低胎儿流产的可能性。近年来国际上有很多关于无创产前基因诊断技术的研究报告，即是从孕妇外周血中分离获取极少量的胎儿的有核红细胞（FNRBC），从这少数FNRBC对胎儿作出基因诊断。这种技术对胎儿是安全的，无创的，但其实验室中技术难度是很高的。通常要先进行一次该单细胞全基因组DNA的预扩增（WGA，whole genome amplification），然后以WGA产物为模板，进行靶基因的多次扩增和基因诊断，具有较好的应用前景。四、生物芯片技术近年来，以DNA芯片（DNA CHIPS）为代表的各种生物微阵列技术，微流阵列技术及蛋白芯片等发展迅速，它将PCR等分子生物学新技术与计算机技术，半导体工业中微加工，微电子等自动化技术结合起来，使基因检测及基因表达，药物筛查等实现高通量，大规模和自动化，具有诱人的应用前景。检测SNPs（single nucleotide polymorphism）及点突变的Oligo-Chip(寡核苷酸芯片)的基本工作原理类似于前文提到的反向斑点杂交，不过斑点数量很大，不是几十，而是几百，数千甚至数万个。因此可提供的信息量很大。但目前这类仪器和技术的检测结果仍有相当比率的假阳性和假阴性率有待克服，在样品的制备、探针的合成与固定，分子的标记，数据的读取分析等方面，仍有待研究提高，另外，设备昂贵，重复性差也不尽人意。已有把芯片技术用于遗传病的