牙鲆变态过程中三种碘化甲状腺氨酸脱碘酶基因的时空表达.pdf

上 海 海 洋 大 学 硕 士 学 位 论 文 上 海 海 洋 大 学 硕 士 学 位 论 文 题 目 题 目 牙鲆变态过程中三种碘化甲状腺氨酸 脱碘酶基因的时空表达 英文题目 英文题目 the spatio temporal expression pattern of three iodothyronine deiodinases during metamorphosis of paralichthys olivaceus 专 业 专 业 水 生 生 物 学 研究方向 研究方向 发育与分子生物学 姓 名 姓 名 盖军伟 指导教师 指导教师 鲍宝龙 二 o 一二 年 五 月 五 日 二 o 一二 年 五 月 五 日 学校代码 1 0 2 6 4 研究生学号 m090102116 1 上海海洋大学 硕士学位论文 答辩委员会成员名单 上海海洋大学 硕士学位论文 答辩委员会成员名单 姓名 工作单位 职称 备注 苏锦祥 退休 教授 主席 王群 华东师范大学 教授 委员 赵云龙 华东师范大学 教授 委员 马凌波 东海水产研究所 研究员 委员 龚小玲 上海海洋大学 副教授 委员 答辩地点 水产与生命学院 b208 答辩日期 2012 05 25 2 上海海洋大学学位论文原创性声明 上海海洋大学学位论文原创性声明 本人郑重声明 我恪守学术道德 崇尚严谨学风 所呈交的学位 论文 是本人在导师的指导下 独立进行研究工作所取得的成果 除文中已经明确注明和引用的内容外 本论文不包含任何其他个 人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容 论文为本人亲 自撰写 我对所写的内容负责 并完全意识到本声明的法律结果 由本人承担 学位论文作者签名 日期 年 月 日 上海海洋大学学位论文版权使用授权书 上海海洋大学学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解学校有关保留 使用学位论文的规定 同 意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版 允许论文被查阅或借阅 本人授权上海海洋大学可以将本学 位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索 可以采用影 印 缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文 保 密 在 年解密后适用本版权书 本学位论文属于 不保密 学位论文作者签名 指导教师签名 日期 年 月 日 日期 年 月 日 i 牙鲆变态过程中三种碘化甲状腺氨酸脱碘酶基因的时空表 达 摘 要 比目鱼类 鲽形目 个体发育过程中 经历从变态前营浮游生活的身体两侧 对称的仔鱼变为营底栖生活的身体不对称的稚鱼 并伴随着一只眼睛从头的一端 移动到另一端和有眼侧色素的发生 消化道的变化 头部骨骼的重塑以及身体两 侧偶鳍的不同步发育等事件 甲状腺激素是脊椎动物正常发育所必须的 比目鱼 的变态发育也受甲状腺激素调控 t4 是甲状腺分泌的主要产物 几乎没有生物 活性 而有生物活性的 t3 是通过 1 型和 2 型碘化甲状腺氨酸脱碘酶 dio1 dio2 催化完成 此外 3 型甲状腺氨酸脱碘酶 dio3 不但可催化 t4 成为没 有活性的 rt3 而且可催化 t3 脱碘成为没有活性的 t2 三种甲状腺氨酸脱碘酶 既维持体内甲状腺激素稳定 又调控局部的甲状腺激素活动 虽然已较清楚甲状 腺激素调控比目鱼的变态 但脱碘酶在比目鱼变态发育过程各组织中的表达分布 还不清楚 本研究利用 rna 整体原位杂交技术检测了 dio1 dio2 和 dio3 在牙鲆变态 过程中的整体表达分布情况 发现变态前 dio1 dio2 和 dio3 基因广泛表达的 在背鳍膜 臀鳍膜 脊髓 胸鳍 鳃 肠道 肌肉和上下颌处均检测到这三种脱 碘酶基因的表达 在变态期 dio1 和 dio3 的表达仍然比较广泛 而 dio2 表达却 局限于眼睛周围皮肤组织和鳃等少数几个组织 在牙鲆变态期 三种脱碘酶基因 均在眼睛周围皮肤组织中表达 其中以 dio3 的左右表达差异最为显著 dio2 的 眼睛周围的这种左右不对称分布程度要弱于 dio3 dio1 在眼睛周围的左右分布 不对称现象最弱 在同一种基因的 rna 整体原位杂交中 左右眼周围的不对称 现象在变态期随着发育的进行先是由弱变强 然后再变弱 在三种脱碘酶的 rna 整体原位杂交实验过程中发现变态前 9adah 的牙鲆仔鱼在靠近头部位置的背 鳍膜的基部发现月牙状信号簇 随着仔鱼的变大 该信号簇逐渐向背鳍膜顶端和 头部前方扩展并最终在这个位置出现了冠状幼鳍 在牙鲆变态期的仔鱼的侧线处 ii 检测到了 dio1 和 dio3 的信号 并且在 dio1 基因在 g 期几乎整条侧线均有信号 dio3 基因在 f 期信号几乎遍布整条侧线 在 dio3 的变态期的结果中发现 在肠 道 心脏 肌肉 眼睛等组织的外表皮有实心点状信号 这种信号在 dio1 和 dio2 的检测结果中均没有发现 总之 本论文的研究结果 dio1 dio2 和 dio3 在牙鲆变态过程中的时空分 布既有相同点又有不同之处 这三种脱碘酶 rna 整体原位杂交图式的给出 为 后面研究这三种基因在牙鲆变态过程中作用提供了基础 关键词 关键词 牙鲆 变态 1 型甲状腺氨酸脱碘酶 2 型甲状腺氨酸脱碘酶 3 型甲 状腺氨酸脱碘酶 rna 整体原位杂交 眼睛移动 iii the spatio temporal expression pattern of three iodothyronine deiodinases during metamorphosis of paralichthys olivaceus abstract flatfish pleuronetiform metamorphosis is the most evident considering its transition from symmetrical pelagic larvae to unsymmetrical benthic juvenile with one eye migration from one side to another pigment occurence on the ocular side the change of digestive tract bone remodeling and the nsynchronous development of paired fins thyroid hormone is necessary for most vertebrates and the metamorphosis of flatfish is also regulated by thyroid hormone t4 is the main product of thyroid with little biological activity in order to produce t3 which has considerable biological activity t4 molecule deiodination should happen at the outer ring which was catalyzed by type1 iodothyronine deiodinase dio1 and type 2 iodothyronine deiodinase dio2 if the deiodination happens at the inner ring of t4 the rt3 will be produced which has no biological activity the inner ring deiodination of t4 was catalyzed by type 3 iodothyronine deiodinase dio3 which can also deiodinate t3 and thereby terminate thyroid hormone action three deiodinases play roles in maintaining thyroid hormone homeostasis at the same time they also participate in local thyroid hormone controlling although it is almost clear that the thyroid hormone is necessary for the metamorphosis of flounder the investigation of deiodinase is still only conducted to the research of whole body expression level and activity iv in this research we designed dio1 dio2 and dio3 antisense rna probe respectively and conducted the whole mount in situ hybridization of three deiodinases to detect the sptio temporal expression of these three deiodinases the results show that dio1 dio2 and dio3 are all widely expressed before metamorphosis dio1 and dio3 are still widely expressed during metamorphosis while dio2 expression is limited to a few tissues like gill and epithelial around the eyes a left right unsymmetry expression in epithelial around the eyes is found in all three deiodinases which of dio3 is the most evident then of the dio2 which of dio1 is the most weak the left right unsymmetry expression in epithelial around the eyes of one deiodinase gene becomes stronger as the development of flounder larvae then weaker again in 9dah day after hatch larvae a new moon shape of three deiodinase signal is found in the dorsal fin membrane bottom near the head the signal becomes larger and move forward towards head as the larvae becomes larger finally the crown like larval fin appears in the position where the deiodinase signal existed the signals of both dio1 and dio3 in lateral line are found in japanese flounder during metamorphosis dot shaped dio3 signals are found in the outer primary cuticula of intestine heart body muscle and eyes etc while the signals of dio1 and dio2 don t show this phenomenon key words paralichthys olivaceus metamorphosis type 1 iodothyronine deiodinase type 2 iodothyronine deiodinase type 3 iodothyronine deiodinase rna in situ hybridization eye migration 1 目录目录 第一章 综述 比目鱼 鲽形目 变态发育和甲状腺激素信号通路的研究 1 1 鲽形目鱼类的概述 1 2 甲状腺激素信号通路调控脊椎动物变态的研究 2 2 1 变态发育 2 2 2 甲状腺激素 3 2 3 甲状腺激素受体 4 2 4 碘化甲状腺氨酸脱碘酶 5 第二章 1 型甲状腺氨酸脱碘酶在牙鲆变态过程中的分布 10 2 1 材料与方法 11 2 1 1 仔鱼的饲养 11 2 1 2 原位杂交样本采集 12 2 1 3 各期牙鲆总 rna 的抽提 12 2 1 4 牙鲆脱碘酶探针引物设计 12 2 1 5 牙鲆脱碘酶探针序列克隆 13 2 1 6 碱裂解法大量制备质粒 dna 14 2 1 7 质粒酶切 14 2 1 8 转录反应 15 2 1 9 rna 整体原位杂交 16 2 1 10 数据采集 17 2 2 结果 17 2 2 1 变态前 dio1 的表达情况 17 2 2 2 变态期 dio1 的表达情况 23 2 3 讨论 26 第三章 2 型甲状腺氨酸脱碘酶在牙鲆变态过程中的分布 29 3 1 材料与方法 30 3 2 实验结果 30 3 2 1 牙鲆变态前 dio2 的分布 30 2 3 2 2 牙鲆变态期眼睛周围 dio2 的分布 31 3 3 讨论 33 第四章 3 型甲状腺氨酸脱碘酶在牙鲆变态过程中的分布 36 4 1 材料与方法 37 4 2 实验结果 37 4 2 1 变态前牙鲆 dio3 的分布情况 37 4 2 2 变态期 dio3 的表达情况 42 4 3 讨论 46 攻读硕士学位期间发表的论文 51 致谢 52 1 第一章第一章 综述 比目鱼 鲽形目 变态发育和甲状腺激素信 号通路的研究 综述 比目鱼 鲽形目 变态发育和甲状腺激素信 号通路的研究 1 鲽形目鱼类的概述鲽形目鱼类的概述 比目鱼一般营底栖生活 身体侧扁 两只眼睛位于头部的同一侧 变态后 的个体在结构上可以容易且迅速的识别 所有的比目鱼在其生活史的早期是浮游 并且两侧对称的 在仔鱼的个体发育过程中 比目鱼要经历一只眼睛从头的一侧 转移到另一侧这样显著的变化 brewster 1987 到底是左眼移动还是右眼移动 这取决于比目鱼的类别 在一些种类的比目鱼中 哪只眼睛移动是不确定的 然 而在另外一些种类的比目鱼中 哪只眼睛的移动是固定不变的 在眼睛移动结束 后 比目鱼的两只眼睛可能最终靠得比较近 也可能靠得不那么近 除眼睛之外 其他好多内部和外部的结构也背离了原来身体的左右对称的机制 这包括 鼻孔 在头部的位置 骨骼的发育 下巴形状的变化 身体每侧的生齿不一样 肌肉组 织发育侧化程度 身体每侧侧线的发育 有眼侧和无眼侧色素的分布有差异 有 眼侧和无眼侧偶鳍发育的不同 作为一个类群 比目鱼是唯一一类背离了原来身 体左右对称机制这么彻底的脊椎动物 比目鱼拥有与其身体左右不对称相关的独 特的形态特征 尽管很早就有人推测比目鱼跟一些身体左右对称的鲈形目拥有共 同的祖先 然而比目鱼的祖先和其姐妹群体现在还不清楚 chapleau 1993 在眼睛移动完成之后 比目鱼沉到水体的底部 比目鱼无眼侧朝下 开始 底栖生活 其经常趴在底部的表面 或者身体部分埋在沙里 只露出眼睛 比目 鱼的生活基底类型有淤泥 沙 沙和贝壳的混合物 还有一些生活在水底岩石的 或者卵石的表面 一些种类的比目鱼特别喜欢某种特定的基底 在一些种类的比 目鱼中不同的生活阶段生活基底也不同 allen phelan et al 2001 2 目前已知的全世界共有比目鱼 538 种 在海洋和入海口附近分布较多 在 淡水中分布比较少 比目鱼因其在世界各地的海洋中广泛分布而为人们所熟悉 在一些地区他们的种群足够大 乃至都可以作为大量的渔业资源 2 甲状腺激素信号通路调控脊椎动物变态的研究甲状腺激素信号通路调控脊椎动物变态的研究 2 1 变态发育变态发育 变态一般定义为胚后发育过程中显著的形态与结构的变化 包括身体某些部 位的发生 某些特征的消失 和一些器官的重塑 laudet 2011 在脊椎动物中 研究最多的是两栖动物门的无尾类 实际上 变态现象普遍存在于脊椎动物中 尽管在不同的物种中变态可能以不同的形式表现出来 大多数的真骨鱼类经历一 个从仔鱼到稚鱼或者仔鱼到成鱼的形态变化过程 这一现象也被认为是变态 blaxter 1988 webb 1999 power et al 2008 parichy et al 2009 比目鱼在仔鱼 到成鱼的发育过程中经历显著的变态变化 其中最显著的是眼睛的变态 在变态 前比目鱼的眼睛是左右对称的 至变态阶段其中一只眼睛才从头部的一侧逐渐移 到头部的另一侧 以后两只眼睛一直在头部的同一侧 图 1 1 张孝威等 1965 根据眼睛在移动过程的位置 miwa 和 inui 2 把牙鲆变态过程分为 5 个阶段 1 变态前 眼睛开始移动之前 左右眼睛完全对称 2 阶段 e 眼睛刚刚开始移 动 3 阶段 f 从左侧可以看见右侧的眼睛 右眼上缘还没有到达头顶 4 阶 段 g 右眼上缘超过头顶 5 阶段 h 右眼刚好位于头顶 图 1 1 比目鱼眼睛移动过程的示意图 张孝威 1965 fig 1 1 eye migration of flatfish 3 2 2 甲状腺激素甲状腺激素 甲状腺激素 thyroid hormone th 前体蛋白在单层的滤泡上皮细胞中产生 滤泡上皮细胞在腺垂体分泌的促甲状腺激素的作用下最终释放出大量的四碘甲 状腺原氨酸 t4 和少量三碘甲状腺原氨酸 t3 即甲状腺激素 甲状腺激素 中主要活性成分是 t3 t4 作为 t3 的前体物质 几乎不起直接的作用 在外周 组织当中 t4 在酶的作用下脱去外圈的一个含碘基团 变成 t3 在脊椎动物中 血液当中大部分的甲状腺激素都是结合在甲状腺激素结合蛋白上的 schreiber and richardson 1997 power et al 2000 在鱼类中 脂蛋白在甲状腺激素的运输 中也起了很重要的作用 babin 1992 gudernatsch 发现用含有马的甲状腺的饲料喂养蝌蚪会导致蝌蚪变青蛙的时 间提前 但当时并不清楚是甲状腺中什么物质促进了蝌蚪的提前变态 直到 1915 年 kendall 从甲状腺中分离出了甲状腺因子 经过了一段艰难的调查研究之后 于 1919 年宣布成功的从甲状腺中分离出一种含碘 65 的物质 给其命名为 thyroxine 经大量的临床调查 boothby and sandiford 1924 这种物质被证实 是甲状腺发挥其调控代谢速率的最重要的或者至少其中最重要的一种物质 但当 时 edward 没有给出这种甲状腺因子的正确化学结构 在 1926 年 英国伦敦大 学学院的博士 harrington 证实了 thyroxine 是甲状腺原氨酸的四碘衍生物 还成 功地合成了有活性的这种物质 harington 1926 到了 1952 年 另一种更有活 性的甲状腺激素 3 5 3 三碘甲状腺氨酸 t3 被证实了 t4 的代谢产物 gross and pitt rivers 1952 甲状腺激素在哺乳动物和两栖动物的早期发育和变态过程中的用作已经研 究的较为清楚了 甲状腺激素是两栖类幼体变态发育所必需的 两栖类幼体器官 的吸收和成体新组织的形成几乎无一例外的需要甲状腺激素 shi et al 1986 与在两栖类中的作用类似 甲状腺激素在比目鱼从仔鱼向稚鱼的转变过程中也起 4 着重要的作用 甲状腺激素在比目鱼中的研究最早是在牙鲆中进行的 甲状腺激 素可以加速牙鲆眼睛的移动 而甲状腺激素合成的抑制剂硫脲则会抑制其眼睛的 移动 inui and miwa 1985 在比目鱼的变态过程中有甲状腺激素的升高 inui et al 1994 在牙鲆的变态高峰期 甲状腺激素水平也伴随着达到高峰 yamano and miwa 1998 2 3 甲状腺激素受体甲状腺激素受体 甲状腺激素的作用是通过与核受体 trs 的结合实现的 这些核受体属于 转录因子核受体超科 laudet et al 1992 甲状腺激素受体和视黄醇类x受体杂 合二聚 结合到位于基因组区域靶基因的t3反应元件上 yen 2001 在没有t3 的时候 trs和共抑制蛋白相互作用抑制靶基因的转录 一但t3结合到trs上 共抑制蛋白即被公激活蛋白所替代 trs与共激活蛋白组成转录复合体 激活依 赖t3的靶基因的转录 比较重要的是 包括促甲状腺激 thyroid stimulating hormone tsh 在内的一些基因会受t3的抑制 但是基因依赖于t3的抑制表达 的机制到目前为止所知甚少 lazar 2003 在脊椎动物中有两种主要的tr tra和trb 这两种tr来自于不同的基因 哺乳动物的tra和trb通过可变剪切和可变的转录起始为点可以产生很多种甲状 腺激素受体亚型 lazar 1993 flamant and samurat 2003 tra和trb的功能在转 基因小鼠中进行了大量的研究 在真骨鱼类中也有tra和trb 然而和哺乳动物相比 牙鲆 星康吉鳗和大 西洋鲑有两个不同的tra基因 yamano et al 1994 marchand et al 2001 jones et al 2002 kawakami et al 2003a 星康吉鳗还有两个不同的trb基因 但在其他 的真骨鱼类中都只有一个trb基因 但有trb可变剪切的报道 yamano and inui 1995 marchand et al 2001 kawakami et al 2003b tra和trb的功能在转基因小鼠中研究的较为广泛 在体内它们既起着共同 的作用又各司其职 cheng 2005 flamant and samurat 2003 在内耳 forrest et al 1996a 肝和甲状腺激素平衡方面 forrest et al 1996b trb起着比tra更重 要的作用 然而在心脏 mai et al 2004 和体温调控中tra起着更加重要的作用 大西洋鳙鲽有2种tra和2种trb trb的表达量要明显高于tra的 并且在变态高 5 峰期trb的表达也达到峰值 malyka et al 2007 2 4 碘化甲状腺氨酸脱碘酶碘化甲状腺氨酸脱碘酶 脱碘作用是甲状腺激素发挥其作用的第一步 通过脱碘作用 t4 中的一个 碘基团被除去 从而产生有生物活性的 t3 血浆中大部分的 t3 都来自于 t4 的 脱碘处理 t4 是一种苯氧基多聚碘化物分子 为了产生 t3 脱碘作用必须发生 在 t4 分子的外圈 该反应可由 1 型和 2 型碘化甲状腺氨酸脱碘酶催化完成 如 果脱碘作用发生在 t4 分子的内圈 将会产生 rt3 rt3 是一种没有生物活性的分 子 d3 除了这种脱碘作用 还可以催化 t3 分子的脱碘作用 进而终止甲状腺激 素的作用 3 种脱碘酶路径的验证用了很长时间 图 1 2 图 1 2 脱碘酶调控几种主要的碘化甲状腺氨酸代谢示意图 bianco and kim 2006 fig 1 2 schematic of deiodinase mediated metabolism of the major iodothyronines 早期脱碘酶 1 的活性的研究有一些是在在肝脏和肾脏匀浆中进行的 visser tj et al 1975 chopra ij 1977 kaplan mm and utiger rd 1978 还有一些是在动物 和人中进行的酶动力学的研究 后来对于脱碘酶 1 领域研究的兴趣大增 并取得 了很大的进步 schimmel m and utiger rd 1977 chopra ij et al 1978 1983 6 leonard jl and visser tj 1986 hennemann g 1986 目前 脱碘酶 1 在人中的作 用所知甚少 只知道它可以使甲状腺机能亢奋的病人的血浆中产生高的 t3 浓度 且脱碘酶 1 容易受丙基硫氧嘧啶 ptu 和安碘达隆 amiodarone 的抑制 sugawara m et al 1984 takamatsu j et al 1984 nishikawa m 1998 oppenheimer jh et al 1972 wiersinga wm and trip md 1986 另一种表达更加广泛的的脱碘酶 2 脱碘酶 2 对 t4 的亲和性比脱碘酶 1 的 亲和性高 3 个数量级 的发现不仅揭露了主要的 t3 产生的通路 同时也把目光 聚焦在脱碘酶调节甲状腺激素体内平衡的新功能上 larsen pr et al 1981 脱 碘酶 2 在甲状腺机能衰退的个体中表达被上调 在甲状腺机能亢奋的个体中则相 反 这说明脱碘酶 2 的表达和活性在维持血浆和细胞中持续的 t3 浓度中起着重 要的作用 随后的灭活甲状腺激素的脱碘酶 3 的发现 脱碘酶 3 主要在中枢神经系统和 胎盘中表达 给脱碘酶的整个图谱的绘制画上了句号 kaplan mm and yaskoski ka 1981 becker kb et al 1995 st germain dl and galton va 1997 脱碘酶 2 和脱碘酶 3 二者组成的系统 互相协调 调整生物体内的甲状腺激 素的平衡 确保体内环境中碘的正常供应 脱碘酶除了维持体内甲状腺激素水平的稳定之外 还调控局部的甲状腺激素 的活动 这一概念的提出来自一个发现 暴露在寒冷环境中小鼠的褐色脂肪组织 中脱碘酶的激活增加了细胞中 t3 的浓度 silva je and larsen pr 1985 这些增 加的t3使得褐色脂肪组织中的甲状腺激素受体 tr 饱和了 bianco ac and silva je 1987 bianco ac et al 1988 carvalho sd et al 1991 参考文献参考文献 babin p j 1992 binding of thyroxine and 3 5 3 triiodothyronine to trout plasma lipoproteins am j physiol 262 e712e720 becker kb schneider mj davey jc galton va 1995 the type iii 5 deiodinase in rana catesbeiana tadpoles is encoded by a thyroid hormone responsive gene endocrinology 136 4424 4431 bianco ac sheng x silva je 1988 triiodothyronine amplifies norepinephrine stimulation of 7 uncoupling protein gene transcription by a mechanism not requiring protein synthesis j biol chem 263 18168 18175 bianco ac silva je 1987 nuclear 3 5 3 triiiodothyronine t3 in brown adipose tissue receptor occupancy and sources of t3 as determined by in vivo techniques endocrinology 120 55 62 braverman le ingbar sh sterling k 1970 conversion of thyroxine t4 to triiodothyronine t3 in athyreotic subjects j clin invest 49 855 864 carvalho sd kimura et bianco ac silva je 1991 central role of brown adipose tissue thyroxine 5 deiodinase on thyroid hormone dependent thermogenic response to cold endocrinology 128 2149 2159 chopra ij 1977 a study of extrathyroidal conversion of thyroxine t4 to 3 3 5 triiodothyronine t3 in vitro endocrinology 101 453 463 chopra ij hershman jm pardridge wm nicoloff jt 1983 thyroid function in nonthyroidal illnesses ann intern med 98 946 957 chopra ij solomon dh chopra u wusy fisher da nakamira y 1978 pathways of metabolism of thyroid hormones recent prog horm res 34 521 657 evolution of the thyroid hormone binding protein transthyretin gen comp endocrinol 119 241255 gross j pitt rivers r the identification of 3 5 3 l triiodothyronine in human plasma lancet 1952 1 439 441 gudernatsch jf feeding experiments on tadpoles i the influence of specific organs given as food on growth and differentiation a contribution to the knowledge of organs with internal secretion wilhelm roux arch entwicklungsmech organismen 1912 35 457 483 harington cr chemistry of thyroxine isolation of thyroxine from the thyroid gland biochem j 1926 20 293 299 hennemann g 1986 thyroid hormone deiodination in healthy man in hennemann g ed thyroid hormone metabolism new york marcel dekker 277 295 inui y 189 229 nishikawa m toyoda n yonemoto t ogawa y tabata s sakaguchi n tokoro t gondou a yoshimura m yoshikawa n inada m 1998 quantitative measurements for type 1 deiodinase messenger ribonucleic acid in human peripheral blood mononuclear cells mechanism of the preferential increase of t3 in hyperthyroid graves disease biochem biophys res commun 250 642 646 oppenheimer jh schwartz hl surks mi 1972 propylthiouracil inhibits the conversion of l thyroxine to l triiodothyronine an explanation of the antithyroxine effect of propylthiouracil and evidence supporting the concept that triiodothyronine is the active thyroid hormone j clin invest 51 2493 2497 power d m elias n p richardson s j mendes j soares c m santos c r a 2000 schimmel m utiger rd 1977 thyroidal and peripheral production of thyroid hormones review of recent findings and their clinical implications ann intern med 87 760 768 schreiber g richardson s j 1997 the evolution of gene expression structure and function of transthyretin comp biochem physiol 116b 137160 silva je larsen pr 1985 potential of brown adipose tissue type ii thyroxine 5 deiodinase as a local and systemic source of triiodothyronine in rats j clin invest 76 2296 2305 st germain dl galton va 1997 the deiodinase family of selenoproteins thyroid 7 655 668 sugawara m lau r wasser hl nelson am kuma k hershman jm 1984 thyroid t4 5 deiodinase activity in normal and abnormal human thyroid glands metabolism 33 332 336 takamatsu j sugawara m kuma k kobayashi a matsuzuka f mozai t hershman jm 1984 ratio of serum triiodothyronine to thyroxine and the prognosis of triiodothyronine predominant 9 graves disease ann intern med 100 372 375 visser tj van der does tobe i docter r hennemann g 1975 conversion of thyroxine into tri iodothyronine by rat liver homogenate biochem j 150 489 493 wiersinga wm trip md 1986 amiodarone and thyroid hormone metabolism postgrad med j 62 909 914 10 第二章第二章 1 型甲状腺氨酸脱碘酶在牙鲆变态过程中的分布型甲状腺氨酸脱碘酶在牙鲆变态过程中的分布 变态一般定义为胚后发育过程中显著的形态与结构的变化 包括身体某些部 位的发生 某些特征的消失 和一些器官的重塑 laudet 2011 比目鱼从仔鱼到 稚鱼的变化也被认为是一个变态过程 power et al 2001 mart nez and bolker 2003 比目鱼 鲽形目 变态过程中最显著的变化就是从变态前营浮游生活的 身体两侧对称的仔鱼变为营底栖生活的身体不对称的稚鱼 伴随着一只眼睛从头 的一端移动到另一端和有眼侧色素的发生 消化道的变化 头部骨骼的重塑以及 身体两侧偶鳍的不同步发育等 ferna ndez d az et al 2001 power et al 2001 mart nez and bolker 2003 甲状腺激素是大多数的脊椎动物正常发育所必须的 甲状腺功能障碍的两栖 类无法完成变态发育 dodd mhi dodd jm 1976 buckbinder l brown dd 1993 像两栖动物一样 比目鱼的变态发育也是受甲状腺激素调控的 power et al 2001 blanton and specker 2007 牙鲆 paralichthys olivaceus 是第一种 用来研究甲状腺激素在变态过程中作用的真骨鱼类 inui and miwa 1985 虽然已经明确比目鱼的变态发育是受甲状腺激素调控的 然而甲状腺激素调 控比目鱼变态的分子机制目前尚不清楚 尽管在两栖类中有大量的关于非洲爪蟾 蝌蚪变态的研究 在比目鱼中有关变态的研究却只有在甲状腺激素水平和甲状腺 激素受体方面有相关的研究 有关甲状腺氨酸脱碘酶的酶的研究很少 尽管 t4 是脊椎动物甲状腺主要的分泌产物 但是其代谢和发育主要是受 t3 调控的 1 型碘化甲状腺氨酸脱碘酶在调控组织 t3 供应中起着重要的作用 在 正常情况下 血浆中多余 80 的 t3 都来自于 t4 的 5 单脱碘作用 vander geyten et al 2005 这一反应主要是由肝脏和肾脏中的脱碘酶 1 催化的 alvarez et al 2005 甲状腺也表达脱碘酶 1 研究发现甲状腺中表达的脱碘酶 1 和肝脏中表 达的是一样的 green 1978 除了能把 t4 变成 t3 之外 脱碘酶 1 还可以把 t3 灭活 变成 3 3 t2 硒是一种重要的成分和潜在的抗氧化剂 在调控甲状腺激素代谢中起着重要 11 的作用 来自动物 临床 体外细胞培养的研究证据表明 脱碘酶 1 的表达随着 可获得的硒的量而变化 korhle 1999 由于硒是构成脱碘酶 1 必不可少的成分 behne et al 1990 berry et al 1991 当发生硒缺乏的时候 脱碘酶 1 的活性 迅速降低 backett et al 1987 脱碘酶 1 基因中含有 4 个组氨酸位点 经突变 验证 其中两个 185 和 253 不参与脱碘过程 组氨酸 174 与脱碘酶跟甲状腺 激素的结合相关 组氨酸 158 与脱碘酶的形成或者催化脱碘有关 berry m j 1992 在两栖动物中发现非洲爪蟾的 dio1 在调控变态发育过程中几乎不起作用 brown 2005 cai and brown 2007 在比目鱼中的一些研究也支持这一结果 isorna et al 2009 kae itoh et al 2010 然而 dio1 在牙鲆变态中是否像在两栖 动物中一样 起着一种无关紧要的作用 为了探究 dio1 在比目鱼变态过程中的 作用 我们检测 dio1 在比目鱼变态前和变态过程中的整体分布情况 2 1 材料与方法材料与方法 2 1 1 仔鱼的饲养仔鱼的饲养 牙鲆仔鱼购自青岛忠海水产有限公司 山东 青岛 按照参考文献的方 法 17 在上海海洋大学水产与生命学院 a 区 4 楼 403 和 405 房间饲养 仔鱼早 期用褶皱臂尾轮虫 brachionus plicatilis 饲养 后期用卤虫 eubranchipus vernalis 无节幼体饲养至变态结束 饵料密度维持在 5 个体 ml 养殖温度控制 在 20 左右 参考分钟 ami 18 的标准把牙鲆正常的变态发育过程分以下几个阶 段 变态前 眼睛开始移动之前 17 dah e 期 眼睛开始移动 19 dah f 期 从不移侧可以看到移动眼 但移动眼上缘还没有到背鳍中线 21dah g 期 移动眼上缘到背鳍中线 23dah h 期 移动眼刚好位于头顶 27 dah i 期 整个移动眼越过背鳍中线 32dah 相应的孵化后天数 the days after hatch dah 代表本实验中各时期仔鱼 12 2 1 2 原位杂交样本采集原位杂交样本采集 取一定量各时期的仔鱼 用 4 多聚甲醛固定 2 小时后 换成甲醇保存备用 2 1 3 各期牙鲆总各期牙鲆总 rna 的抽提的抽提 取 50 100 毫克的牙鲆于离心管中 用剪刀剪碎 加入 1 毫升的 trizol 把离 心管中的组织和 trizol 移入匀浆器中匀浆 把匀浆器中的液体移入新的离心管 中 不足 1 毫升的加入 trizol 补足 加入 0 2 毫升的氯仿 盖紧盖子 用手轻弹 15 秒钟 在 2 8 摄氏度 1 3x104rpm 离心 15 分钟 转移顶层液相至新的离心管 中 加入 0 5 毫升异丙醇 在 15 30 摄氏度放置 10 分钟 然后在 2 8 摄氏度 1 3x104rpm 离心 10 分钟 倒掉上清 用 75 的酒精冲洗管底 rna 然后加入不 少于 1 毫升的 75 的酒精 2 8 摄氏度 1 3x104rpm 离心 5 分钟 倒掉上清 自 然晾干 根据 rna 重 用不同体积的 0 01 的 depc 处理的无菌水溶解 在 70 摄氏度保存 2 1 4 牙鲆脱碘酶探针引物设计牙鲆脱碘酶探针引物设计 为了研究三种脱碘酶基因在比目鱼变态过程的表达模式 本研究选取了三种 脱碘酶间具有较低同源性的区域设计 rna 原位杂交探针 分别选取牙鲆 dio1 471 684 accession no ab362421 1 dio2 382 859 accession no ab362422 1 dio3 262 461 accession no ab362423 1 制备牙鲆三种脱碘酶特异性地 高锌标记的 rna 原位杂交探针 引物序列如表 2 1 一种脱碘酶探针与其他另 外两种脱碘酶基因序列的相似性比较如表 2 2 以牙鲆 cdna 为模板 将脱碘酶 探针序列克隆至 pgem t 载体 以制备探针 表 2 1 制备牙鲆三种脱碘酶特异性探针的引物序列 table 2 1 the primer sequences of three iodothyronine deiodinase 探针 引物序列