体外探究脱落酸对肺腺癌细胞系SpcA1自噬的影响论文.pdf

分类号 r734 2 密级 u d c 编号 学 位 论 文 体外探究脱落酸对肺腺癌细胞系体外探究脱落酸对肺腺癌细胞系 spc a1 自噬的影响自噬的影响 the study of abscisic acid induced autophagy in lung adenocarcinoma cell line spc a1 in vitro 邵丽洁邵丽洁 指导教师姓名指导教师姓名 刘荣玉刘荣玉 教授教授 安徽医科大学第一附属医院安徽医科大学第一附属医院 申请学位级别申请学位级别 硕士硕士 专业名称专业名称 老老年医学年医学 提交论文日期提交论文日期 2012 年年 3 月月 15 日日 论文答辩日期论文答辩日期 2012 年年 5 月月 20 日日 学位授予单位和日期学位授予单位和日期 安徽医科大学安徽医科大学 2012 年年 7 月月 答辩委员会主席答辩委员会主席 费广鹤费广鹤 教授教授 评阅评阅人人 陈陈 琼 琼 张张 梅梅 教授等教授等 2012 年年 5 月月 硕士学位论文硕士学位论文 体外探究脱落酸对肺腺癌细胞系体外探究脱落酸对肺腺癌细胞系 spc a1 自噬的影响自噬的影响 the study of abscisic acid induced autophagy in lung adenocarcinoma cell line spc a1 in vitro 作者姓名作者姓名 邵丽洁邵丽洁 指导教师指导教师 刘荣玉刘荣玉 教授教授 学科 专业学科 专业 老年医学老年医学 研究方向研究方向 肺癌肺癌发生发生的分子生物学机制的分子生物学机制 论文工作时间论文工作时间 2010 年年 3 月至月至 2011 年年 5 月月 2012 年年 5 月月 论文原创性声明和授权使用声明论文原创性声明和授权使用声明 学位论文独创性声明学位论文独创性声明 本人所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果 据我所知 除了文中特别加以标注和致谢的地方外 论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果 与我一起工作的 同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确说明并表示谢 意 学位论文作者签名 日期 学位论文使用授权声明学位论文使用授权声明 本人完全了解安徽医科大学有关保留 使用学位论文的规定 学校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电 子版和纸质版 有权将学位论文用于非赢利目的的少量复印并允许论 文进入学校图书馆被查阅 有权将学位论文的内容编入有关数据库进 行检索 有权将学位论文的标题和摘要汇编出版 保密的学位论文在 解密后适用本规定 学位论文作者签名 导师签名 日期 安徽医科大学硕士学位论文 1 目 录 目录 错误错误 未定义书签 未定义书签 英文缩略词表 错误错误 未定义书签 未定义书签 中文摘要 4 英文摘要 7 正文 11 1 前言 错误错误 未定义书签 未定义书签 1 2 材料和方法 错误错误 未定义书签 未定义书签 3 3 结果 28 4 讨论 33 5 小结 37 6 下一步的工作设想 38 7 参考文献 错误错误 未定义书签 未定义书签 8 附录 41 致谢 43 综述 44 安徽医科大学硕士学位论文 2 中英文缩略词对照表中英文缩略词对照表 aba abscisic acid 脱落酸 atg autophagy related genes 自噬相关基因 ccd coiled coil domain 卷曲螺旋区 cdna complementary dna 互补脱氧核糖核酸 dbd dna binding domain dna 结合区 depc diethypyrocarbonate 焦碳酸二乙酯 dna deoxyribonucleic acid 脱氧核糖核酸 dntp deoxyribonucleoside triphosphate 脱氧核糖核苷三磷酸 dtt dithiothreitol 二硫苏糖醇 eb ethidium bromide 溴乙锭 edta ethylenediaminetetraacetic acid 已二胺四乙酸 hepes n 2 hydroxyethylpiperazine n 2 ethane sulfonic acid n 2 羟乙基哌嗪 n 2 乙磺酸 hrp horseradish peroxidase 辣根过氧化酶 kb kilobase 千碱基对 kda kilodalton 千道尔顿 lc3 microtubule associated protein 1 light chain 3 微管相关蛋白 1 轻链 3 mtor mammalian target of rapamycin 雷帕霉素的哺乳类靶蛋白 mrna message rna 信使核糖核酸 od optical density 光密度 p probability 概率 page polyacryamide gel electrophores 聚丙烯酰胺凝胶 pcr polymerase chain reaction 聚合酶链式反应 pvdf polyvinylidene difluoride 聚二氟乙烯 ra retinoic acid 维甲酸 rna ribonucleic acid 脱氧核糖核酸 安徽医科大学硕士学位论文 3 rpm rovolution per minute 每分钟转数 rt pcr reverse transcript polymerase chain reaction 反转录 pcr sds sodium dodecyl sulfate 十二烷基硫酸钠 sh2 src homologn 2 domain src 同源二区 socs suppressor of cytokine signaling 细胞因子信号传导抑制子 temed n n n n tetramethylethylenediamin 四甲基乙二胺 tris tris hydroxymethyl aminomethane 三 羟甲基 氨基甲烷 安徽医科大学硕士学位论文 4 体外探究脱落酸对肺腺癌细胞株体外探究脱落酸对肺腺癌细胞株spcspc a1a1自噬的影响自噬的影响 中文摘要中文摘要 研究背景研究背景 肿瘤是目前对人类健康和生命威胁最大的疾病之一 而肺癌是当今世界各国 常见的恶性肿瘤 其发病率及死亡率位居癌症之首 脱落酸 abscisic acid aba 是植物体内天然存在的一种激素 目前认为其在植物胚胎发育 种子休眠 果实 成熟 逆境胁迫等多方面具有重要的生理功能 这些大都通过钙离子进行调节 与植物相似的是 在调节细胞分化 细胞防御及组织重构等方面钙离子在动物体 内也起到了重要作用 然而 关于 aba 对肺腺癌细胞系的作用国内外尚未有相关 报道 自噬本是细胞通过自我消化维持生长的一种方式 但当自噬水平超过细胞 的承受能力时 自噬可能诱导细胞凋亡 我们前期已对肺腺癌组织及癌旁组织中 自噬相关蛋白表达做了研究 结果显示癌组织中自噬水平较癌旁组织低 本研究 采用体外培养的方法 加入 aba 作为干预因素 进一步探究自噬在肺癌细胞系 spc a1 中的作用及其可能机制 目的目的 本研究以人肺腺癌细胞系spc a1为对象 加入不同浓度aba进行干预 检测 aba作用后细胞活力的变化 将gfp lc3质粒转染入spc a1中 加入aba进行培 养 用激光共聚焦显微镜观察不同处理浓度下细胞的自噬现象 分别从mrna及蛋 白水平检测对照组及各处理组beclin 1及lc3 ii的表达 明确aba对spc a1自噬相 关指标表达的影响 对实验结果进行统计学分析 探讨aba对spc a1自噬的影响 对肺癌新型治疗的意义 方法方法 1 细胞培养细胞培养 将 spc a1 细胞培养于含 10 胎牛血清的 df 12 培养基中 37 5 co2 每 安徽医科大学硕士学位论文 5 2 3 天传代一次 保持细胞处于对数生长期 2 mtt法检测法检测aba作用下作用下spc a1细胞活力细胞活力 收集对数生长期的spc a1细胞 调整细胞密度为5 000 10 000个 ml 种于96 孔板中 待细胞贴壁后 加入aba使培养浓度分别为进行培养 24小时后 加入mtt 用酶标仪检测各孔吸光值 根据吸光值计算出相对细胞活力 3 细胞转染及自噬观察细胞转染及自噬观察 取对数生长期的 spc a1 细胞传代至细胞培养皿 待细胞贴壁后按 lipofectamine 2000 说明书转染入 gfp lc3 6h 后换正常培养基并加入浓度分 别 0 8 m 20 m 100 m 的 aba 37 5 co2 培养箱中培养 24h 后使 用后激光共聚焦显微镜观察转染 spc a1 细胞的自噬情况 4 荧光实时定量荧光实时定量pcr检测自噬相关基因表达检测自噬相关基因表达 分别抽取各处理组总rna 将mrna逆转录为cdna后采用实时定量荧光pcr 法分别检测beclin 1及lc3 ii基因水平表达的变化 5 western blot检测自噬相关蛋白的表达检测自噬相关蛋白的表达 分别抽取各处理组总蛋白 然后采用western blot法分别检测beclin 1及lc3 ii 基因水平表达的变化 6 统计学方法统计学方法 所有试验至少分3次独立完成 数据用x s表示 多组间的差异用one way anova分析 两组之间的差异用 t 检验 统计在spss 15 0软件统计包中进 行 p 0 05表示差异有显著性 结果结果 1 aba 作用于作用于 spc a1 细胞后细胞活力受到抑制细胞后细胞活力受到抑制 spc a1 细胞经浓度为 0 8 m 20 m 100 m 的 aba 处理后 用 mtt 比色法 各处理组测得细胞活力相对百分比分别为 89 9 2 4 77 1 0 5 64 9 2 8 各处理组细胞活力与对照组差异具有显著性 p 0 001 2 spc a1 细胞在细胞在 aba 的作用下自噬增多的作用下自噬增多 spc a1 细胞转染入 gfp lc3 质粒 经终浓度为 0 8 m 20 m 100 m 的 aba 安徽医科大学硕士学位论文 6 处理 24h 后观察 可见带有绿色点状荧光的 lc3 表达较未加入 aba 处理的细 胞显著增多 表明在 aba 的作用下 spc a1 细胞的自噬增强 3 aba 作用后增加了作用后增加了 spc a1 细胞中细胞中 beclin 1 及及 lc3 ii mrna 的表达量的表达量 spc a1 细胞经终浓度为 0 8 m 20 m 100 m 的 aba 处理后 提取细胞总 rna 并反转为相应 cdna 进行荧光实时定量 pcr 实验 结果显示 随着 aba 浓度的升高 beclin 1 mrna 表达量升高 除了 aba 0 8 m 组与对照组之间 表达量无差异外 p 0 636 其余各组两两之间表达差异均有显著性 p 0 001 lc3 ii mrna 表达量随 aba 浓度的升高而升高 其中 各处理组 表达量两两之间差异具有显著性 aba 0 8 m 组与对照组 p 0 004 余各组 两两之间 p 0 001 4 aba 作用后增加了作用后增加了 spc a1 细胞内细胞内 beclin 1 及及 lc3 ii 的表达量的表达量 spc a1 细胞经浓度为 0 8 m 20 m 100 m 的 aba 处理后 提取细胞总蛋 白 用 western blot 法检测不同浓度 aba 处理后 spc a1 细胞中 beclin 1 以及 lc3 蛋白的表达量 结果显示 aba 100 m 处理组与对照组 beclin 1 表达 量差异具有显著性 p 0 04 余处理组较对照组及处理组与处理组之间表达 量未见显著性差异 aba 100 m 处理组与对照组 lc3 ii 表达量差异具有显著 性 p 0 005 aba 0 8 m 组与 aba 100 m 组之间表达量差异具有显著性 p 0 039 余处理组表达量两两之间未见显著性差异 结论结论 脱落酸可以促进调节自噬信号转导通路中相关基因 beclin 1 以及 lc3 ii 的表 达 从而诱导肺腺癌细胞 spc a1 自噬 而且随着自噬的增加 可能导致细胞的死 亡 抑制肿瘤的生长 关键关键词词 脱落酸 spc a1 自噬 beclin 1 lc3 安徽医科大学硕士学位论文 7 the study of abscisic acid induced autophagy in lung adenocarcinoma cell line spc a1 in vitro abstract background cancer is one of the most serious diseases which threatenthe health of human being however lung cancer is a common malignant tumor in the world today with the highest morbidity and mortality aba abscisic acid aba is a plant hormone which wildly exists it plays an important role in plant development through calcium adjustion such as seed dormancy fruit ripening and stress responses in mammals like plants aba is also involved in regulating homeostasis via calcium adjustion especially in the regulation of cell differentiation cell defense and tissue remodeling however there is no report about the role of aba in lung adenocarcinoma cell line at home and abroad autophagy is a process of self digestion in order to maintain the cell growth but when the autophagy level beyond the cell capacity may induce apoptosis our research team has carried out an experiment on autophagy related protein expression in lung adenocarcinoma and adjacent tissues which showed that the level of autophagy in the cancer tissues was higher than adjacent tissues in our study we have explored its possible mechanisms of autophagy in lung cancer cell line spc a1 by using vitro methods which added aba as intervening factor objective in this study we used human lung adenocarcinoma cell line spc a1 as the expriment material which divided into control group and abscisic acid treatment groups with various concentration of aba added after treatment the mtt assay was used to evaluate cell viability confocal microscopy analysis was used to detect cells autophagy phenomenon induced by aba quantitative real time pcr and western blot analysis 安徽医科大学硕士学位论文 8 were used to detect autophagy related genes and protein expression the experimental results were analyzed by specific software in order to reveal the significance of the impact of aba on spc a1 and explore new treatment of lung cancer method 1 cell culture the human lung adenocarcinoma cell line spc a1 was cultured in df 12 medium invitrogen supplemented with 10 fetal bovine serum generated the cells 2 3 days keeping them at the logarithmic grow phase 2 mtt assay in detecting cell viability briefly cells were seeded in 96 well plates and allowed to attach overnight at 37 then aba with the concentrations of 0 8 mol l 20 mol l 100 mol l were added into the culture medium 24h later cells were measured using a plate reader after adding 20 l of mtt 5 mg ml into each well the relative viability of cells was calculated according to the od value 3 cells transfected and observation of autophagy spc a1 cells were transfected with gfp lc3 using lipofectamine invitrogen carlsbad ca aba with the concentrations of 0 8 mol l 20 mol l 100 mol l were added in each treatment groups respectively for 24 hours laser confocal microscope was used to observeing autophagy phenomenon 4 quantitative real time pcr total rna was extracted by using trizol regent the first strand cdna was synthesized by oligodt primers with reverse transcriptase the resultant cdna was used as template in quantitative pcr employing sybr chemistry using gene specific primers this method was use to detect the gene expression of beclin 1 and lc3 ii 5 western blot total protein was extracted form spc a1 cells then used western blot to detect the 安徽医科大学硕士学位论文 9 expression of beclin 1 and lc3 ii 6 statistical analysis all experiments were performed at least three independent times data were expressed as the x s and were analyzed for significant differences by independent student s t test and one way anova with spss 15 0 differences were considered statistically significant if p value 0 05 results 1 aba inhibited the cell viability of spc a1 spc a1 cells were treated with a concentration of 0 8 mol l 20 mol l 100 mol l of aba mtt assay was measured the relative percentage of cell viability respectively as follows 89 9 2 4 77 1 0 5 64 9 2 8 cell viability of each treatment group and control group difference was significant p 0 001 2 aba increased autophagy level of spc a1 cells in this study spc a1 cells were transfected with gfp lc3 plasmid then treated with aba concentration of 0 8 mol l 20 mol l 100 mol l for 24 hours the green fluorescence of gfp lc3 increased significantly compared with negative control group 3 aba increased beclin 1 and lc3 mrna expression of spc a1 cells spc a1 cells were treated with a final concentration of 0 8 mol l 20 mol l and 100 mol l of aba treatment total rna was extracted and reversed the corresponding cdna for real time pcr experiments the results showed that beclin 1 mrna expression increased with the increasing of the aba concentration however there was no difference between aba 0 8 mol l group and control group p 0 636 the rest of the expression differences between any other two groups were significantly p 0 001 lc3 ii mrna expression with the aba concentration was increased as well the differences in expression between any two groups was significant aba 0 8 mol l group and control group p 0 004 other two groups with p 0 001 安徽医科大学硕士学位论文 10 4 aba increased autophagy related protein beclin 1 and lc3 expression of spc a1 spc a1 cells were treated with a concentration of aba as 0 8 mol l 20 mol l 100 mol l western blot assay was used to exam lc3 and beclin 1 protein expression of each group the results were as follows the difference of beclin 1 expression between aba 100 mol l treatment group and control group was significant p 0 04 the difference of any other two treatment groups was not significant the difference of lc3 ii expression between aba 100 mol l treatment group and control group was significant p 0 005 the difference between aba 0 8 mol l group and the aba 100 mol l group was significant p 0 039 the difference of any other two treatment groups was not significant conclusion aba may regulate cell viability via improving the genes expression in the autophagy related pathway of human lung adenocarcinoma cell line spc a1 with the increasing of autophagy level of cells cell death may inevitable which may inhibit tumor growth key words abscisic acid lung adenocarcinoma cell line spc a1 autophagy beclin 1 gene lc3 gene 安徽医科大学硕士学位论文 11 体外探究脱落酸对肺腺癌细胞系体外探究脱落酸对肺腺癌细胞系spcspc a1a1自噬的影响自噬的影响 1 前言 近50年来 癌症的发病率呈逐年上升趋势 已成为危害人类健康的重要问题 2002年肺癌在世界范围内的新增病历约为135万 死亡率约87 4 居恶性肿瘤之 首 1 我国肺癌年龄调整死亡率总体呈上升趋势 尤以农村明显 男性年均上升 2 7 女性上升3 6 且各年龄段 15岁以上 均呈不同程度上升趋势 肺癌按 组织学分类 分为非小细胞肺癌和小细胞肺癌 其中非小细胞肺癌分为鳞癌 腺 癌 大细胞肺癌 鳞腺癌 在这些类型中腺癌是发病率最高的一种 尽管联合应 用手术 放疗 化疗 生物治疗等各种治疗手段 肺腺癌患者的预后率始终并无 大幅度提高 总的5年生存率低于10 所以新型治疗方法的研发迫在眉睫 beclin l 是在哺乳动物中最早发现的一个自噬基因 其主要通过与磷酸肌醇 三磷酸激酶 iii 型 pik 形成复合体来调节自噬活性 2 beclin 1 被认为是抑癌基因 在抑制肿瘤 抗衰老 保护神经等方面发挥着重要作用 尤其是定位于内质网上 的 beclin 1 是重要的自噬诱导因子 有研究表明 beclin 1 表达的下调与乳腺癌 卵 巢癌 脑肿瘤的进展相关 3 6 这提示 在癌症的发病过程中 可能使 beclin 1 的 表达发生了变化 微管相关蛋白 1 轻链 3 microtubule associated protein 1 light chain 3 lc3 是哺乳动物细胞中酵母自噬相关基因 8 atg8 的同源物 细胞中 lc3 ii 的表 达量与自噬泡数量成正相关 研究表明 肺部疾病的发生发展过程中 lc3 ii 的 表达量也有相应的变化 7 此外 一些研究报道肿瘤组织及癌旁组织中 lc3 ii 表 达量有显著差别 lc3 表达量的下降与卵巢癌及脑部肿瘤相关 8 这提示 lc3 ii 可能成为肺癌诊断及治疗中的新成员 细胞自噬是一种在真核细胞中常见的自我消化现象 在自噬过程中 自噬体 与溶酶体结合形成自噬溶酶体 后者可降解细胞质中受损 变性的大分子和细胞 器 并将降解产物循环利用 从而为细胞的正常生存 代谢提供原料 但是 当环 安徽医科大学硕士学位论文 12 境过度恶劣并超过了细胞可承受的水平时 自噬也可能成为一种细胞自杀方式 过度上调的自噬可导致细胞的自噬性死亡 即 型程序性细胞死亡 programmed cell death pcd 9 越来越多的证据表明 在肿瘤的发生及发展中 自噬发挥了重 要作用 10 脱落酸 abscisic acid aba 是植物体内天然存在的一种激素 目前认为其 在植物胚胎发育 种子休眠 果实成熟 逆境胁迫等多方面具有重要的生理功能 而这些调节作用有赖于一系列的信号转导过程 主要包括以受体为中心的细胞信 号识别 以第二信使为中心的胞内信号传导以及以蛋白磷酸化为中心的信号放大 等过程 11 其中 主要的第二信使有 钙离子 磷酸肌醇 cadpr 且这三条信 号传导途径都和钙离子的作用密切相关 与植物相似的是 在动物体内 钙离子 也参与了内环境稳态的调节 12 14 特别是在调节细胞分化 细胞防御及组织重构 方面起到了重要作用 15 在自噬的调节中 钙离子也是重要的参与者 脱落酸不 仅在植物生长中发挥了重要的作用 在动物体内也参与稳态的调节 有研究表明 脱落酸在人类粒细胞中扮演了内源性细胞因子的角色 且脱落酸可以刺激胰岛细 胞释放胰岛素 这些对内环境的调节都是基于钙离子介导的信号转导通路来完成 的 16 17 有趣的是 脱落酸与维甲酸的结构颇为相似 其是否也具有如维甲酸相 似的抑制肿瘤细胞生长的作用仍不是很明确 自噬广泛存在于人体内各细胞中 参与调解内环境稳态 在许多疾病的发生 和发展中 自噬都起到了重要的作用 肺癌是威胁人类健康导致人类死亡的最常 见原因之一 其中肺腺癌在肺癌中占主要类型 然而至今肺腺癌发病机制尚未研 究清楚 自噬在肺癌中的作用途径 aba对肺腺癌细胞系的作用效果至今尚未有 研究报道 期望通过从自噬角度对肺腺癌细胞系的研究 以aba体外诱导spc a1 细胞自噬的相关研究为今后肺腺癌的临床诊断和治疗提供一定的实验室依据 安徽医科大学硕士学位论文 13 2 材料和方法 2 1 实验材料 2 1 1 实验试剂 1 spc a1 肺腺癌细胞株购于上海细胞库 2 aba 脱落酸 购于 sigma 公司 3 mtt 购于 solarbio 公司 4 lc3 多克隆抗体购于 novus biologicals 公司 5 beclin 1 单克隆抗体购于 abcam 公司 6 hrp 标记兔源二抗购于 santa cruz biotechnology 公司 7 df 12 培养基 lipofectamine 2000 trizol 及胎牛血清均购于 invitrogen 公司 8 荧光实时定量 pcr 试剂盒购于 takara 公司 9 ecl 化学发光试剂盒购于 pierce 公司 10 pvdf 膜购于 millipore 公司 2 1 2 实验所用主要仪器和设备 hettich universal 32r台式离心机 德国eppendorf公司 高压蒸汽灭菌锅 上海天能科技有限公司 电热干燥箱 上海天能科技有限公司 微量加样器 微量加样管 德国eppendorf公司 phs 25电子ph计 上海今迈仪器仪表 高精度变量程电子分析天平 瑞士mettler 公司 超低温冰箱 日本sanyo公司 离心管 德国eppendorf公司 power pac1000垂直电泳槽 美国bio rad公司 hettich universal 32r台式离心机 德国eppendorf公司 318mc型酶标仪 上海三科仪器有限公司 752改进型紫外可见光光度计 上海分析仪器厂 安徽医科大学硕士学位论文 14 bl 2200型电子分析天平 日本岛津公司 微波炉 格兰仕电器有限公司 sw cj 2d型医学净化工作台 苏州净化设备有限公司 漩涡振荡器 上海安亭科学仪器厂 水平摇床 金坛国胜实验仪器厂 olypus荧光显微镜 日本东京奥林巴斯公司 4 医用恒温冰箱 中科美菱 revco elite ii型co2培养箱 美国asheville nc公司 激光共聚焦显微镜 德国zeiss公司 2 2 实验方法 2 2 1 人肺腺癌细胞株 spc a1 的培养 1 自液氮容器中小心取出 spc a1 细胞冻存管 立即放入事先准备的 37 水浴中 快速解冻 轻摇冻存管使细胞悬液在 1 分钟内全部融化 以 75 酒精擦拭冻存管 外部 放入离心机 1000rpm 离心 5min 2 将离心好的冻存管移入超净工作台 弃去上清 加入新鲜培养基 4ml 含 10 fbs 的 df 12 制成细胞悬液 移入 60mm 培养皿中 十字交叉 将细胞悬液混合均 匀 放入 co2培养箱 37 5 co2 中培养 3 每 2 3 天换培养基 1 次 保持细胞处于对数生长期 常规传代或冻存 2 2 2 mtt 法检测 aba 作用下 spc a1 细胞活力 1 原理 mtt 法又称 mtt 比色法 是一种检测细胞存活和生长的方法 其检测 原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性mtt还原为水不溶性的蓝紫色 结晶甲瓒 formazan 并沉积在细胞中 而死细胞无此功能 二甲基亚砜 dmso 作为一种有机溶剂 能溶解细胞中的甲瓒 在一定细胞数范围内 mtt 结晶形成 安徽医科大学硕士学位论文 15 的量与细胞数成正比 故用酶联免疫检测仪在 450nm 波长处测定其光吸收值 可 间接反映活细胞数量 该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测 大规模 的抗肿瘤药物筛选 细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等 它的特点是灵敏 度高 经济 2 收集对数生长期细胞 用 0 25 胰蛋白酶消化汇合约 80 的 spc a1 单层细胞 待细胞基本变圆时终止消化 小心将细胞从培养皿底部吹下 将细胞悬液收集到 离心管中 1 000rpm 4min 3 从离心机中取出离心好的细胞 弃上清 用新鲜培养基重悬细胞 调整各处理 组细胞密度至 5 000 10 000 个 ml 4 取出平底 96 孔板 将 spc a1 细胞分别加入培养孔 200ul 孔 培养板四周各 孔加入 pbs 200ul 孔 每个处理组设重复实验组 3 个 5 24 小时后取出培养板 加入 aba 使处理组培养基中 aba 浓度分别为 0 8 mol l 20 mol l 100 mol l 对照组仍为普通培养基培养 整个过程避光 6 避光培养 24h 后 将培养板从培养箱中取出 每孔加入 pbs 配置浓度为 5mg ml 的 mtt 20ul 在 37 5 co2条件下避光培养 4h 7 取出培养板 弃上清 每孔加入 150ul dmso 待紫色结晶溶解后 用酶标仪 检测各孔于 od 450nm 波长处的吸光值 8 细胞活力 实验组吸光度 对照组吸光度 100 2 2 3 转染 gfp lc3 进入 spc a1 细胞观察自噬现象 2 2 3 1 感受态 e colidh5 的制备 1 取 80 冻存的 e colidh5 菌 划板接种 lb 固体培养基 37 倒置培养过夜 2 次日挑取单菌落 接种 3mllb 液体培养基 37 210rpm 恒温振荡培养过夜 3 次日取 150 le colidh5 菌液 加入 3mllb 液体培养基 37 210rpm 恒温 震荡培养培养 2h 左右 4 待菌液 od600nm约为 0 3 0 4 时 取 1 5ml 菌液加入 ep 管中 水浴 10min 安徽医科大学硕士学位论文 16 5 于 4 离心机 4000rpm 离心 10min 倒置流尽残液 6 加 300 l 冰预冷的 0 1mol lcacl2 重悬细菌 冰浴 30min 7 于 4 离心机 4000rpm 离心 10min 倒置流尽残液 8 加 120 l 冰预冷的 0 1mol lcacl2重悬细菌 再加 120 l 甘油 80 保存 2 2 3 2 gfp lc3 质粒转化感受态 e colidh5 1 gfp lc3 质粒由中国科学技术大学周江宁教授惠赠 2 5 l 连接反应物加 200 l 感受态细胞 冰浴 30min 3 42 水浴 90 秒 立即冰浴 1 2min 4 加 800 lsoc 37 缓慢 225rmp 摇菌 1h 5 制备 kana lb 平板 先将 lb 固体培养基加热 液化 冷却至 50 左右 1mllb 培养基加 1 lkana 混匀 铺平板 待 lb 凝固后 每板 约培养基加 20mllb 培养 基 加入 30 liptg 和 40 lx gal 均匀涂布于平板表面 1h 后用于下一步实验 6 4000rpm 离心 10min 弃上清 加 200 lsoc iptg kana 2mlsoc 加 100 liptg 和 2 lamp 重悬 7 100 l 涂布 iptg x gal kana lb 平板 8 室温放置 15min 37 倒置培养过夜 2 2 3 3 质粒提取 采用蓝白斑筛选方法 从上述平板上挑取单个白色菌落 于50ml液体lb培养基 含 50 lkana 中 37 恒温振荡培养过夜 次日 按 promega 中抽质粒试剂盒说明书 提取质粒 具体步骤如下 1 将过夜培养的菌液约 50ml 置于离心管中 离心 8000rpm 10min 弃上清 2 加入 3ml cell resuspension solution 充分振荡 使细胞悬浮 3 加入 3ml cell lysis solution 轻微翻转 3 5 次 室温下静置 2 3min 4 加入5 0ml neutralization solution 轻微翻转3 5次 静置2 3min 离心8000rpm 20min 安徽医科大学硕士学位论文 17 5 将上清液倒入 clearning column 离心 2000rpm 6 上清液倒入 binding column 离心 2000rpm 2min 7 取出离心管在 binding column 中加入 5ml endotoxin removal wash 2000rpm 2 min 弃上清 8 在 binding column 中加入 column wash solution 20ml 3600rpm 5min 9 弃去滤液 再 3600rpm 5min 10 将 binding column 将放入烤箱干燥 11 加 600 l nuclease free water 加在 binding 膜上 静置 3min 12 离心 2000rpm 5min 收集离心液于 ep 管中 13 纯化 加 1 10 体积 3mol l naac 2 5 倍体积的 95 乙醇 冰上静置 15min 12000rpm 弃上清 加入 50te 溶解沉淀 14 用紫外分光光度计检测抽提结果 od260nm od280nm值在 1 8 2 0 之间标本可用 2 2 3 4 脂质体法转染 spc a1 细胞 1 取对数期生长的 spc a1 细胞 用 0 25 胰蛋白酶消化 制成单细胞悬液 调整细胞浓度为 1 4 105个细胞 ml 种入 6 孔培养板中 培养板底部放置多聚 赖氨酸处理过的细胞爬片 2 在 37 5 co2培养箱培养 24h 待细胞贴壁后准备进行转染 转染时细胞汇 合度不超过 80 3 取一支 ep 管 将 lipofectamine2000 与 opti mem 在其中混合 再取一支 ep 管 将 gfp lc3 与 opti mem 在其中混合 室温静置 5min 4 将以上两支 ep 管中液体充分混合 动作轻柔 使 lipofectamine2000 与 gfp lc3 的比值为 2 1 l g 室温静置 20min 5 将上述混合液均匀滴入六孔板中 放入培养箱中培养 6h 后换成正常培养基 6 转染后 6h 弃去以上培养基 将对照组更换正常培养基 含 10 fbs 的 df 12 将处理组加入 aba 浓度分别为 0 8 mol l 20 mol l 100 mol l 避光培养 7 24h 后 将转染细胞爬片取出 pbs 冲洗 4 甲醛溶液室温固定 10min 甘油 安徽医科大学硕士学位论文 18 封片 避光置于激光共聚焦显微镜下观察细胞自噬情况 2 2 4 实时荧光定量 pcr 1 原理 为了能准确判断样品中某基因转录产物 mrna 的起始拷贝数 pcr 技术被广泛应用 pcr 过程是按照 2n n 代表 pcr 循环的次数 指数的方式进行 模板的扩增 但在实际的 pcr 反应过程中 随着反应的进行由于体系中各成分的 消耗 主要是由于聚合酶活力的衰减 使得靶序列并非按指数方式扩增 而是按 线性的方式增长进入平台期 因此在起始模板量与终点的荧光信号强度间没有可 靠的相关性 如采用常规的终点检测法 利用 eb 染色来判断扩增产物的多少 从 而间接的判断起始拷贝量 即使起始模板量相同经 pcr 扩增 eb 染色后也完全 有可能得到不同的终点荧光信号强度 实时荧光定量 pcr 采用新的参数 ct 值 定量的根本原理是 ct 值与样品中起始模板的拷贝数的对数成线性反比关系 在实 时荧光定量 pcr 的过程中 靶序列的扩增与荧光信号的检测同时进行 定量 pcr 仪全程采集荧光信号 实验结束后分析软件自动按数学算法扣除荧光本底信号并 设定阈值从而得到每个样品的 ct 值 ct 值中的 c 代表 cycle 循环 t 代 表检测 threshhold 阈值 其含义是 pcr 扩增过程中荧