（遗传学专业论文）粘着斑激酶的原核表达、纯化及抗体的制备.pdf

摘要 粘着斑激酶( f o c a la d h e s i o nk i n a s e ，f a k ) 是细胞质内单亚基非受体型酪氨酸激酶， 通过各种信号途径参与调节细胞生长、发育、黏附、细胞骨架重组、转化、扩散和迁移 等过程。一采用p c r 方法，从f l a g - f a k 质粒中克隆编码f a kc 端2 7 3 个氨基酸的基因片 段，构建f a k 融合蛋白原核表达载体p e t 2 8 a ( + ) f a k ，进行原核表达与蛋白纯化，取纯 化的f a k 蛋白免疫小鼠，制备f a k 抗血清。结果表明构建了表达f a kc 端功能结构域的 原核表达质粒p e t 2 8 a ( + ) f a k ，经过b l 2 1 ( d e 3 ) 大肠杆菌表达、镍亲和层析柱纯化，获 得分子量约3 3k d a 的融合蛋白。e li s a 检测显示该蛋白有较高效价。荧光免疫结果显 示此多克隆抗体与f a k 蛋白特异性结合，为进一步研究神经细胞中f a k 的作用机制及奠 定了基础。 关键词：f a k ；原核表达；抗体制备 a b s t r a c t f o c a la d h e s i o nk i n a s e ( f a k ) i sam o n o s u b u n i ti n m c e p t o rp t k a n df a k p a r t i c i p a t et o r e g u l a t ec e l lg r o w t h ，d e v e l o p m e n t ，s t i c k y , c y t o s k e l e t o nr e c o m b i n a t i o n ，i n v e r s i o n ，d i f f u s i o n a n dm i g r a t i o nt h r o u g hm u c hs i g n a l - p a t h i nt h i ss t u d y , t h ef r a g m e n to ff a k g e n ee n c o d i n g t h el a s t2 7 3a m i n oa c i d si nt h ect e r m i n u sw a sa m p l i f i e df r o mf l a g - f a kp l a s m i db yp c r a n dt h i sf r a g m e n tw a si n s e r t e di n t ot h ep r o k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o rt oc o n s t r u c tt h e r e c o m b i n a n tp l a s m i dp e t 2 8 a ( + ) f a k ，a n de x p r e s s e di nf u s i o np r o t e i n ，t h ep l a s m i dw a s e x p r e s s e d i ne c o l i b l 2 1 ( d e 3 ) ，a n dt h ee x p r e s s i o np r o d u c tw a sp u r i f i e d m i c ew e r e i m m u n i z e dw i t l lt h ep u r i f i e df a kp r o t e i na n dt h ea n t i s e r u mw a so b t a i n e d t h er e s u l t s i n d i c a t e dt h a tt h ep l a s m i dp e t 2 8 a ( + ) f a kw h i c he o n t a i n e dt h ef a kct e r m i n u sf u n c t i o n a i s t r u c t u r a ld o m a i nw a sc o n s t r u c t e d a f t e ri n d u c t i o nw i t hi p t g , am o l e c u l a rw e i g h to f3 30 0 0 f u s i o np r o t e i nw a so b t a i n e db yn i n t aa f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y t h ea n t i f a ka n t i b o d yw a s o b t a i n e da n dp u r i f i e d t h er e s u l t so fe l i s aa n di m m u n o f l u o r e s c e n e ei n d i c a t e dt h a tt h e p o l y c l o n a la n t i b o d yh a dh i g ht i t r a t i o na n ds p e c i f i c i t y , a n dw i l lb eu s e di nt h ef u r t h e rr e s e a r c h o nf a km e c h a n i s mi nn l t k e yw o r d s ：f a k ，p r o k a r y o t i ce x p r e s s i o n ，a n t i b o d yp r e p a r a t i o n n 独创性声明 本人声明所璧交的学位论文是本入在导师指导下进行的研究工作及 欷褥豹磅究残暴。簇我濒鲡；豫了文枣褥爨黧疆蠡注窝致嚣豹建方努， 论文中不包含其稳入已经发表或撰写邋豹研究成果，瞧誉识含为获得东 北师范大学或其他教育机构的学位或诫粥而使用过的材料。与我一同工 作的同志对本研究所做的任何贡献均融谯论文中作了明确的说明并表示 谢意。 学位论文作者签名： 砗日期：量翌业 学位论文叛权使用授权书 本学霞论文于罄鬻宠全了解东憩赫藏大学有关徐髫，经掰学位论文豹 规定，即：东北师獭大学有权保留并向阐家有关部门或机构送交学位论 文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权东j b 师范大学可 以将学位论文的全部戚部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影 霹l 、缩印或其它复溯零段保存、汇编学经论文。 ( 绦密魏学霞论文在解密嚣遥鬻零致衩书) 学位论文作者熊名：垄l ：垒 、， 日期；地2 ：垒 指母教师签名：丝 日期：缨zi 盔 学位论文作者肇她后去向； 工作单位：盔! 勘：盔墨! 曼盗曼 通讯地址：旋独凌垫盟釜琶如当眨磊。 电话：竺壹丛：型；压 邮编：圭羔懋盥 l引言 粘着斑激酶f a k ( f o e a la d h e s i o nk i n a s e ) 是1 9 9 2 年h a n k s t l l 及s c h a l l e r t 2 1 分别在v s r c 转染的鸡胚细胞及正常细胞的黏附区发现并命名的一种单亚基、分子量为1 2 5 k d 的非 受体型酪氨酸激酶( n t p t k s ) 。f a k 家族包括p y k 2 、c a k b 、c a p t 、r a t f k 、f a k 2 五个成员【2 j ，广泛分布于成纤细胞、血小板、表皮细胞、内皮细胞、t c 、b c 、中性粒 细胞、单核细胞和滋养层细胞等的胞质中1 3 1 。通过多种信号途径参与调节细胞发育、生 长、存活、凋忘、黏附、细胞骨架重组、转化、扩散和迁移过程。近年来，f a k 在信 号传递中的重要作用尤其在肿瘤治疗中的新发现已成为分子生物学研究领域的热点问 题。 1 if a k 的结构 f a k 定位于人的8 q 2 4 , c d n a 全长4 2 8 5 b p ，编码1 0 5 2 个氨基酸。和其它酪氨酸 激酶不同，f a k 结构非常特殊，不含s h 2 及s h 3 结构域，不能与其它蛋白质的磷酸化 酪氨酸和富含脯氨酸序列结合 4 1 。完整的f a k 由3 个结构域组成：n 端结构域。 该结构域与整合蛋白( i n t e g r i n ) 受体b 亚基的胞质部分和表皮生长因子( e p i d e r m a lg r o w t h f a c t o rr e c e p t o r ，e o f r ) 的胞质域、血小板衍生生长因子受体( p l a t e l e td e r i v e dg r o w t hf a c t o r r e c e p t o r ，p d g f r ) 等受体酪氨酸激酶结合：3 9 0 到6 5 0 位高度保守的酪氨酸激酶 域( t k ) 。具有酪氨酸蛋白激酶共有底物的结合位点，催化位点；：c 端结构域。是 蛋白与蛋白相互作用富集区，含两个脯氨酸富含模体( 介导f a k 与含s h 3 结构域的胞 质蛋白相互作用) 和一个粘着斑靶向序列( f o c a l a d h e s i o n t a r g e t i n gs e q u e n c e ，f a t ) 。其 中，f a t 又与其它粘着斑蛋白( 如桩蛋白p a x i l l i n 、踝蛋白t a l i n 等) 结合。每个结构域 约4 0 0 个氨基酸【5 j 。f a k 已知有六个可以被磷酸化的酪氨基位点：位于n 端结构域的 t y r 3 9 7 、t y r 4 0 7 ；位于酪氨酸激酶域的t y r 5 7 6 和y r 5 7 7 和位于c 端结构域的t y r 8 6 1 和t y r 9 2 5 。其中t y r 3 9 7 是主要的自身磷酸化部位。t y r 3 9 7 磷酸化的f a k 可与多种含 s h 2 结构域的蛋白质分子结合，如s r e 家族，细胞信号抑制因子、生长因子连接蛋白7 ， s h e 接头蛋白、p 1 2 0 r a s g a p 、p 1 3 激酶p 8 5 甄基等。f a k 与整合素的b 亚基结合而发生 构象改变使得t y r 3 9 7 自我磷酸化，从而使与之接合的s r c 消除自体抑制而被激活，活 化的s r e 催化f a kt y r 4 0 7 、t y r 5 7 6 、t y r 5 7 7 和t y r 9 2 5 磷酸化，使f a k 完全活化【6 j 。 t y r 8 6 1 的磷酸化是由c s r e 蛋白催化的1 7 j 。 1 2f a k 的功能 f a k 是一个多功能的非受体酪氨酸激酶，它在细胞及细胞与细胞外基质( e c m ) 黏附中起着关键作用，同时与胚胎发育，细胞生存、周期调控、增值、凋亡、铺展、迁 移及血管生成等密切相关。 1 2 1 增强细胞的黏附、铺展和迁移 细胞在整合素介导下与e c m 黏附后，f a k 的磷酸化水平升高，如果抑制f a k 的 磷酸化，细胞黏附、铺展均减少【8 j 。f a k 的活力与细胞迁移关系密切j 研究受伤组织内 l 皮细胞向伤口部位迁移时，发现它们f a k 的磷酸化水平升高，激酶活力增加，利用酪 氦酸激酶籀翎翻阻盘f a k 活讫，霹隧壹肉皮细穗熬迁移嘲。软失f a k 豹藏纤细懿，细 胞和基质的接触增强，细胞迁移率减少【3 t 。在培养细胞中，f a k 的过表达能增加纤粘连 蛋妇( f n ) 刺激的细胞迁移。尹航等用大鼹缒主动脉中膜细胞做材料，也证实了鞭k 的磷酸化能增强细胞的黏附和迁移秽l 。 1 2 2 调节细胞增假与胚胎磁常发育，阻止细胞凋亡 尹靛等诞稠取k 翡溪纯霹漫著增鸯羹瞧管乎澎瓤细稳( v a s c u l a rs m o o t hm u s c l e e v i l s v s m c ) 的d n a 合成，反义f a ko d n 转染和驻著抑制v s m c 的增值1 9 1 。众所周 知，黏附可臌止凋亡，f a k 在其中起着重矮作用，即使细胞发生黏附，且粘着斑也存 在，只要f a k 功髓被辫断，绍麓溺祥发生淄亡1 1 0 t 。f a k 墓嚣觳除圣鬣鸯葶期憝麓致殛 突黛，未形成发育完全的血管和心脏，部分缺少背擞动脉，脐肠系膜动脉也未形成l 。 l 。2 ，3 参与瓣瘸细臌的发生、发展、侵袭、转移 肿瘤缅臆俘随着f a k 的高表达量，抑制f a k 静活性或陌断f a k 的表达均能狮蒂 肿瘸细胞的侵袭【1 2 j 。通过抑n d , 鼠恶性黑色素瘤细胞中f a kf | 勺表达可抑制肿瘤的早期 转移。 l - 3 f a k 介导的信号转导 f a k 在细胞内信号转导中占有重要地位。它位于神经肽、整合素和癌基因作用的 聚会点，是多耱信号谨等逶路驰交汇点拜l 。f a k 主蘩参与整会索余导懿藏肉信号转警。 另外，酪氨酸蛋白激酶蹙体( r 肼矗) 及与酪氨酸蛋囱激酶联系的受体及g 蛋白偶联受 体受爨刺激鼷，f a k 瞧能活化，传递有关傣息i i o j 。 1 3 1f a k 上游依号分子及箕通路 f a k 上游信号分子有s r c l 7 ) 、i p 3 1 4 1 、r h o n 、f a k i 0 1 等。g 蛋白偶联的受体可能通 逑r h o 激嚣f a k ，s w i s s 3 t 3 缨戆孛，援缓戆分裂专孛经戆戆逶道r h o 激涟f a k ，受体 型酪氨酸蛋自激酶( r t k s ) 可能通过i p 3 激活f a k 。酪氨酸摄白激酶联系的受体通过 s r c 活化f a k ，有报道，在c h o 中，生长激素g h 能激活f a k ，j a k 2 岛f a k 结含， 在僚号传递逶鼹中，f a k 处于融l 笠下游，箕传递筏弼不清。f a kn 端与整合豢黪 弧熬结合后，其构象发生变化而导致的自我磷酸化弥补了整合綮不具催化功能的缺陷。 l 。3 2f a k 下游的信号分予发其通路 f a k 下游的信号分予有g r b 2 1 孤、p i ( 3 ) k t 6 1 、s r c n t s i 、r h o t l 2 1 等。s r c 与f a k 的结合 可以使t y r 9 2 5 发生磷酸化产生与接头蛋白( a d a p t o r ) g r b 2 的结合位点，通过g r b 2 的 s h 3 功能域冬鸟嘌泠竣餐羧交换鞠子s o s 绥会，s o s 将r a s 蛋翻麸无活瞧夔r a s a d p 转化为有活性的r a s a n ，；另外，g r b 2 还可通过与接头蛋白s h e 的结合，激活r a s 的 a d p ，然后活化丝裂原活化蛋白激酶( m i t o g e na c t i v a t e dp r o r e i nk i n a s e ，m a p k ) ，作用 予转录因子c l o s 、c - j u n ，最终影响基因静袭达。勇方瑟，s r e 与f a k 豹复合俸霹透 过磷酸化p a x i l l i n 和c a s 0 4 。后两者可通过衔接子c r k 连接到鸟嘌呤转换因子c 3 g 而 进入r a s 途径，扶丽激溺丝裂原鬣白激酶龇谨k 。活纯豹f a k 还可与纭接子蛋白p l ( 3 ) k f 磷脂酰肌醇3 羟基激酶) p 8 5 驻基的s h 2 结构域缭合，使其酪氨酸磷酸化，形成磷 2 膳酸虢醇3 、4 二磷酸、磷驻酿瓤黪3 、4 、5 三磷酸，遴j 霆活亿p t o s 6 k 瑟磷羧纯核耱俸 小亚基的s 6 强国，使含s 6 蛋白的核糖体被m r n a 优先识掰利用，从丽寓现在细胞核 外调控基因表达。 在f a k 介释的多种信号通路巾，除整合素介导的r a s 途径较为清楚外，其它许多 道路其机制尚柬党全弄清。整合蠹彝壤集、钙离子浓度的上舞、p k c 活饿豹提高、血 小板德生熏长纛予p d g f 及生长激綮g 联戆裁激及s 掣娃s s - 3 t 3 缨羟夔筵镶瓣分裂神经 驮( 如铃蟾歇和内皮肤) 都能激活f a k ，使其磷酸纯。这些信号分子怎么传到f a k 以 及怎样调控基因，f a k 介导的信号通路与其它信号通路间怎样实现对话( c r o s st a l k i n g ) ， 其内在机制不清。f a k 作为在组织中广泛分布的一种激酶，通过复杂的信号通路调控 多种生物学功熊。 近年来，f a k 撵为德号分子是分子生物学骚究懿一个热熹，它是谗多豁号逮鼹鹣 交汇点l 珏1 嚷s 】l 6 1 ，律为治疗翳瘸的掰犯点，f a k 在辩瘸缁施中的研究霹内终有较多按 道。尽管f a g 禚神经细胞中也有离袭达，但它在其中的作用与机制尚不清楚l l 玎。针对 f a k 的深入研究，将为阐明细胞内储号途径和疾病的治疗提供帮助。 2 。1 材料 2 1 1 质粒和蔼种 2 材料与方法 大肠杆菌b l 2 1 ( d e 3 ) 和d h 5a 及质粒p e t 2 8 a ( + ) 为本实验室保存，f i a g - f a k 质粒 釉n l t 细胞出荚潮佐治亚医学院熊文成教授馈赠。实验小鼠购自长春生物铡晶研究所。 2 ，1 2 化学试裁 各种d n a 戳制性内切酶、t 4 遴接酶、t a q d n a 聚含酶、标准分子量蚤囱均购自大 连t a k a r a 有隈公司。d m e m 细胞璐葬基购自g i b c o 公司。d n a 胶回收试刿金和低 分子量标准蘩囱魏皇上海生工生鐾王穗公司。i p t g 、零弱霉素赡鑫蘧京爨圈垒携工程 公司。硝酸纤维索膜为o s m o n i c s 公闭产品；h r p 标记的筚抗鼠抗体购自j b 廉中山生物 技术有限公司：化学发光底物试剂窳为p i e r c e 公司产晶。+ 镍亲和层析柱购自q i a g e n 公司。其余常规试荆为国产分析纯试剂。 3 2 。1 3p c r 霉| 赞 裰据g e n b a n k ( g e n e l d ：3 9 6 4 1 6 ) v g , f f f a k 基因缪襄，宠疆c 璇结构域2 3 9 5 印歪3 2 1 0 b p 痔列( 该 区域含有粘菪斑定砬序列) ，设计合成一对s l 物( 引物f o r w a r d 和引物r e v e r s e ) 邮l 。引物合成 及序列测定幽上海生工鸯物工程公司完成。 序列为： f ：5 - c g g g a t c c g c a t g g c a g c c a a a c a t g g a g 一3 r ：5 - c c c a a g c r r r 淞g t g ( ；g g c c t g g a c t g g t c - 3 上游引物含有b a m hi 酶切位点，下游引物含有h i n d h | 酶切 髓点。 2 2 实验方法 2 2 1 原核表达载体p e t - 2 8 a ( + ) - f a k 的构建 2 2 ，l ，1目的基因f a k 的制各 以f l a g f a k ( o 2 6 u g u 1 ) 质粒为模板，进行常斓p c r 扩增“。觚过夜培养的卡那耩素抗性 豹乎叛上取藏落，教入2 0 啦无藏双蒸水中，9 0 - 1 0 0 煮1 0m i n ，以所褥的溶液为模扳 进行p c r 扩增。建立以下反应体系： 总搭袄( 2 5 l t l ) 引物f ( 0 6 2 5 u m ) 弓| 物r p 。6 2 5 u l v 0 模投( o 。2 6 u g u 1 ) 预混t a q 酶 d d h 2 0 p c r 反应条件： 9 5 ，5m i n 9 4 ，3 0s、 5 7 ，3 0s ，3 5 个循环 7 2 ，5 0sj 7 2 ，1 0r a i n 0 5 l 0 5 壮l 2 l a l 1 2 “l l o m 将p c r 扩增产物f a k 用限制性核酸内切酶b a m hi ，h i n d i l l 分别消化。 总俸袄( 5 0 牡1 )第一次酶讶t 第二次酶仞 毒 扩增产物 5 b u f f e r ( k 1 b a r n h i 砌d i d d h 2 0 反应时间 2 5g l ( 约1 2 0 n g ) 5 “l 2 p l 1 8p l l o h 2 3g l ( 约1 2 0 r i g ) 5f t l 2 1 d 2 0u l 8 h 第一次酶切：3 0 温浴1 0h ，o 8 琼酯糖凝胶电泳，在长波紫外光下用手术刀片切 下大片段，以d n a 凝胶回收试剂盒回收载体片段，溶于2 5g ld d h 2 0 中。 第二次酶切：，3 7 1 2 温浴8h ，o 8 琼酯糖凝胶电泳，在长波紫外光下用手术刀片切 下大片段，以d n a 凝胶回收试剂盒回收载体片段，溶于2 5i l ld d h 2 0 中。 2 2 1 2 p e t - 2 8 a ( + ) 载体片段制备 将p e t - 2 8 a ( + ) 质粒用限制性核酸内切酶b a m hi ， 总体积( 5 09 1 )第一次酶切 p e t - 2 8 a ( + ) 2 0l a l ( 约8 0 n g ) 5 x b u f f e r ( k ) 5u l b a m h i 2 1 1 1 肺h d i i i d d h 2 0 2 3u l 反应时间 l o h 肺硼1 1 1 分别消化。 第二次酶切 2 01 1 1 ( 约8 0 n g ) 5 山 2 9 l 2 3u l 8 h 第一次酶切：3 0 ( 2 温浴1 0h ，1 o 琼酯糖凝胶电泳，在长波紫外光下用手术刀片切 下大片段，以d n a 凝胶回收试剂盒回收载体片段，溶于2 5f t ld d h 2 0 中。 第二次酶切：3 t c 温浴8h ，1 0 琼酯糖凝胶电泳，在长波紫外光下用手术刀片切 下大片段，以d n a 凝胶回收试剂盒回收载体片段，溶于2 5u ld d h 2 0 中。 2 2 1 3 目的基因f a k 片段与载体p e t - 2 8 “+ ) 连接 建立以下连接反应体系： 总体积( 2 0 u 1 ) t 4 d n a 连接酶 l l t 4 d n a 连接酶b u f f e r 2f t l 制备的p e t - 2 8 a ( + ) 载体片段 5m ( 约2 0n g ) 制备的目的基因f a k 片段 1 0 p 。l ( 约4 0 n g ) d d 2 0 2 山 1 6 反应过夜，将连接反应液转化大肠杆菌感受态细胞d h 5a ，将转化菌液涂于 5 l b 平板上( 含5 0i t g m l ，k a n a m y c i n ) ，3 7 过夜培养。 2 2 1 4 重缒质粒p e t - 2 8 a ( + ) 一f a k 的箍定 幻p c r 鉴定 获过夜培养豹卡郡霉索挠榷靛平援上取蘩落，放入2 0 瓣无藏双蒸承孛，9 0 10 0 煮1 0m i n ，以所得的溶液为模板进行p c r 扩增。建立以下反应体系： 总体积( 2 5 i t t ) 引物f 1l x l 引物r 1t t l 模叛2 批i 预混t a q 酶 1 2 “l d d | 2 09 掰 p c r 反应条件： 9 5 ，5m i n 9 4 ，3 08 5 7 ，3 0s 3 5 令锤琢 7 2 ，5 0sj 7 2 ，1 0 m i n o 8 琼赡糖凝胶电泳分析结果。 b ) 酶切鉴窝 然取p c r 阻燃的菌落，接种子3m ll b 壤券液巾( 含5 0g g m l ，k a n a m y c i n ) ，3 7 振荡培养过彼，碱裂解法小量制备质粒，以h i n d l l l 和b a m h1 分别酶切，鉴定麓组质孝藏， 建立弑下反癍体系； 总体积( 2 5 a 1 ) 第二次酶切 第二次酶切 p e t - 2 8 a ( + ) - f a k 8 5 扛l ( 约8 0 0r i g ) l oxb u f f e r ( k )2 5l t l b a m h1 0 5 t t l h i n d l l l 0 5g l d d h 2 0 1 3 5 l 第一次酶切，3 0 溆浴8h 。第二次酶切在第一次酶切体系中直接加入0 5 山h i n d i l l ，3 7 滠浴lh 。o 8 臻酯糖凝获毫溶分辑结采。藿维袋粒p e t - 2 8 a ( + ) - f a k 豹痔残分 析测定由上海生工生物工程公司完成。f a k 序列插入p e t - 2 8 a ( + ) 载体聪与n 端的6 x h i s 标签融会，f a k 将戳融合蛋白形式表达。 2 2 2f a k 基因在大肠秆篱中的诱导袋达 矗 挑取含重组质粒p e t - 2 8 a ( + ) f a k 的表达菌株b l 2 1 ( d e 3 ) 的单菌落，接种于3m ll b 培养液中( 含5 0 g h a 。k a n a m y e i n ) ，3 7 振荡培养过夜，取过夜培养液按l ：1 0 0 的 比例扩大培养。在不同o d 6 0 0 值范围( o 4 0 5 ，0 5 - 0 6 ，0 6 0 7 ，0 7 0 8 ，0 8 0 9 ，0 9 1 o ) 加入i p t g 至终浓度1 0m n l o i l 进行诱导，4h 后取1l n l 培养物收集菌体，进行 s d s p a g e 电泳检测融合蛋白表达情况。在o d 6 0 0 值为0 6 0 7 范围内，加入i p t g 至终 浓度1 0 m m o l l 进行诱导，经不同的诱导时间( 1h ，2 h ，3h ，4 h ，5h ，6 h ) 后取1m l 培养物收集菌体，进行s d s - p a g e 电泳检测融合蛋白表达情况。 挑取含重组质粒p e t - 2 8 a ( + ) f a k 的表达菌株b l 2 1 ( d e 3 ) 的单菌落，接种于3i i l ll b 培养液中( 含5 0p 咖l ，k a n a r a y c i a ) ，3 7 振荡培养过夜，取过夜培养液按l ：1 0 0 的 比例扩大培养至4 0 0m ll b 培养基中( 含5 0 g m l ，k a n a m y e i n ) 。在o d 6 0 0 值为0 6 0 7 范围内，加入i p l u 至终浓度1 0 1 1 1 1 1 1 0 i f l 进行诱导，诱导4 h 后取1l n l 培养物收集菌体， 进行s d s p a g e 电泳检测融合蛋白表达情况，余下培养物备用。 2 2 3f a k 融合蛋白的分离纯化 收集诱导后菌体，在变性条件下按q i a g e n 公司n i n t aa g a r o s e 试剂操作方法进 行表达融合蛋白的纯化1 6 0 l ，具体步骤如下： 1 ) 4 ，1 0 0 0 0g ，离心收集菌体，去上清。 2 ) 加入2 0 m i 磷酸盐缓冲液p b s ( 1 3 7 m m n a c i ，2 7 m m k c i ，1 0 m m n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 0 ， 2m m k h 2 p 0 4 ，p h8 o ) 重悬菌体沉淀，4 1 2 ，1 2 0 0 0g 离心1 0m i n ，去上清。 3 ) 加入2 0m lb u f f e rb 溶液0 0 0m mn a h 2 p 0 4 ，1 0m mt r i s c i ，8m u r e a ，p h8 o ) ，重 悬菌体沉淀，冰浴搅拌3 0r a i n 。 4 ) 7 0 功率超声破碎6 次，每次3 0s ，间隙3 0s ，均在冰上操作。 5 1 4 ，1 0 0 0 0 9 离心2 0 - 3 0 m i n ，取上清。 6 ) 上清液加入n i n t aa g a r o s e 介质4 0 0 | i l 悬浮液，冰浴搅拌lh 。 7 ) 先用2m lb u f f e rb 溶液平衡n i - n t aa g a r o s eb u f f e r 柱，然后加入步骤( 6 ) 中的混合液 至n i - n t a a g a r o s e b u f f e r 柱中。收集流出液，记为“收集液b ”。 8 ) 加入8m lb u f f e rc 溶液( 1 0 0m mn a h 2 p 0 4 ，1 0m m t r i s c i ，8m u r e a ，p h6 3 ) 冲洗， 收集流出液，记为“收集液c ”。 9 ) 加入0 5m lb u f f e rd 溶液0 0 0m b ln a h 2 p 0 4 ，1 0m mt r i s c i ，8mu r e a ，p h5 9 ) ，重 复四次，收集流出液，分别记为“收集液d 管l ，收集液d 管2 ，收集液d 管3 ，收集 液d 管4 ”。 1 0 ) 加入0 5m lb u f f e re 溶液( 1 0 0m mn a h 2 p 0 4 ，1 0m m t d s c i ，8m u r e a ，p h4 5 1 ， 重复四次，收集流出液，分别记为“收集液e 管1 ，收集液e 管2 ，收集液e 管3 ，收 集液e 管4 ”。 11 ) 所有流出液4 保存，取5p l 样品加5p l 蛋白上样缓冲液( o 2 5m o l lt r i s - h c i 7 p h 6 8 ，o 5m o l l 二硫叔糖醇，1 0 s d s ，0 5 溴酚蓝，5 0 甘油) 进行s d s p a g e 电 溶检测融会鬃皇豹缝缘效莱。 用p b s ( p h7 4 ) 于4 透析8h ，去除尿素、t r i s 等离子，褥到的蛋白样品用b r a d f o r d 比色法经分光光度计分析蛋白质浓度。 2 2 4f a j ( 融合蛋自抗体的帝备及抗体效价的检测 2 2 4 1f a k 融合蛋酝免疫b a l b c 小鼠 1 ) 第一次受疫6 8 捌龄豹b a l b e 夸甄3 只，接1 5 耀纯晶疆鑫其翅鬟，箍器与等谚 积弗氏完全佐荆充分混匀，腹腔注射，渡射前用酒精棉球擦下腹部。 2 ) 第一次免疫1 4 天臌对b a l b e 小鼠进行第二次免疫。按1 5p g 纯品缓白只用照，抗 瓣与等体积弗氏不完全佐裁充分混匀，羧腔注毒砉。 3 ) 第二次免疫2 1 天厝对b a l b e 小鼠进行第三次免疫。按1 5 烬纯品鬣白，只用熬，抗 原与等体积弗氏不完全佐剂充分混匀，腹黢注射。第三次免疫聪7 天，取鼹尾血傲e l i s a 稳测。 4 ) 饲养免疫后的小鼠，每7 天熙换一次数料。取出垫料后清洗鼠笼，晾干。每3 天更 换次痰簸巾豹锻承，麴农菠魂蠢杂物爨璞或藻类艇长应立攀处理。每3 天添翅次藏 粮。添加时应本着之多不少的原则。 2 2 4 2f a k 融合蛋鑫抗体虢e l i s a 检溺 1 ) 将缒让薅灼f a k 融合蛋白溶液按梯度臻释威l 抖1 0 0p l ，o 。7 5 弘1 0 0t a l ，0 5 , g 1 0 0 t a l ，0 , 2 5 i 1 0 0p l ，0 1p 1 0 0l a l ，0 0 5p g ，1 0 0i t l ，0 0 1p g ，1 0 0p l ，0 0 0 5o g 1 0 0l a l ， 0 ，0 0 1 扯1 0 0l a l ，与包被缓冲液混匀，按浓度由高歪低的顺序加入到9 6 孔聚苯乙烯板 审，4 篷拨过夜。次鼙，赛去羟内溶液，矮洗涤缓；孛滚；串浚3 次，每次4 m i n 。 2 ) 加0 1m l 封闭液于融包被的反应孔中，置于3 7 孵育1h 。然后弃去孔内溶液，用 洗涤缓冲液冲洗3 次，每次4 m i n 。 3 ) 将f a k 融合蛋自的抗体盘清戳封闭液绞1 ：4 0 0 ，1 ：8 0 0 ，i ：1 6 0 0 ，1 ：3 2 0 0 ，l ：6 4 0 0 ，t ：1 2 8 0 0 的比例稀释后加入到每个反应孔中( o 1 5m l 孔) ，鬣3 7 孵育1h 。弃去孔内溶液，用 洗涤缓；孛滚 申洗3 次，每次4 m i n 。 种加入用封闭液按l ：5 0 0 0 的比例新鲜稀释的辣根遥氧化物酶标记的羊抗鼠i g g ( 第二 抗体) o 1m l 于各反成孔中，3 7 孵育lh 。弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液冲洗3 次， 每次4 m i n 。 5 1 加底物工作液0 1i n l 于各反臌孔中，辍摇，室濑避光反应1 5m i n 。 6 ) 于各反应孑l 中加入0 0 5m l 反应终止液终止反应q 于4 9 2n m 在e l i s a 酶标检测仪测 蔹0 d 债。 冀 e l i s a 溶液配制： 1 ) 包被缓冲液：o 8 5m o l l 碳酸缓冲液p h9 6 ，1 0 0m l n a 2 c 0 30 v t w1 0 5 9 9 ) 0 1 5 9g n a h c 0 3 ( m w8 4 0 1 ) 0 2 9 3g 2 ) 洗涤缓冲液：磷酸盐缓冲液( p b s dp h7 4 ，1 0 0 0m l n a c i ( m w5844)8g k c l ( m w 7 4 5 5 ) 0 2 9 k _ i - 1 2 p 0 4 ( m w1 3 6 0 9 ) 0 2g n a 2 h p o l 4 1 2 1 2 0 ( m w3 5 8 1 4 ) 2 9g t w e e n 2 00 5 m l 3 ) 封闭液( 现用现配) ：1 0 ( w v ) 脱脂奶粉的p b s 溶液 p b s1 0 0m l 脱脂奶粉 l og 4 ) 底物缓冲液：o 1m 磷酸一柠檬酸缓冲液p h5 0 ，2 0 0m l n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 0 ( m w3 5 8 1 4 ) 7 3 7 5g 1 0 3m l c 6 h s 0 7 h 2 0 ( m w2 1 0 1 4 ) 2 0 3 7g 9 7m l 5 ) 底物工作液( 现用现配) ： 磷酸一柠檬酸缓冲液 3 h 2 0 2 o p d 6 ) 终止液：2 m h 2 s 0 4 2 0 0 m l h 2 0 9 8 h 2 s 0 4 l o m l 1 5 0m 5m g 1 7 8 3 m l 2 1 7 m l 2 2 4 3f a k 融合蛋白抗体的w e s t e r n - b l o t 检测 将纯化后的f a k 融合蛋白溶液按每上样孔2 | l 1 5 p i 的用量进行s d s p a g e 电泳。 电泳后进行转膜，杂交。步骤如下： 1 ) 电泳结束前2 0m i n 配制湿转电泳转移缓冲液( t r i s3 0g ，g l y1 4 4g ，m o h2 0 0m l ， 加去离子水至1 0 0 0m 1 ) 。 2 ) 电泳结束后，将胶卸下，刮去浓缩胶，左下切角，在转移缓冲液中浸泡3 0m i n 。 3 1 戴手套剪切滤纸和膜时，以防止手上的蛋白污染膜。将切好的略比胶大的硝酸纤维 素膜( n i t r o c e l l u l o s e ，n c ) 置于去离子水上浸泡3m i n ，随后浸泡入转移缓冲液中3 0 m i n 。 将滤纸、海绵和夹子也浸入转移缓冲液中。 4 ) 将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，用玻棒来擀走里面的气泡。 在海绵垫子上垫三层滤纸，擀去其中的气泡。将胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对 齐，擀去气泡。将膜盖于胶上，要盖满整个胶并除气泡。在膜上盖3 张滤纸并除去气泡。 9 最飚箍上另一个海绵垫，合起夹子。封紧聪放入电转槽。整个操作在转移液中进行。要 不薮静辩去气浚。 5 ) 将夹子放入b i o - r a d 电转移槽槽中，便峡的黑面对槽的黑丽，夹的自黼对槽的熊葡， 加入约8 0 0m l 转移缓冲液。电转移时会产热，在槽的一边放一块冰来麟温，并将电泳 稽鬻于球承瀵合纺中。瘸1 0 0 v 转移1 5 h 。 6 ) 转完后将臌从电转梢中取出，t b s t 0 0 0 m m o l l t r i s c i p i - 1 7 5 ，1 5 0 m m o i l n a c i ， 0 。0 5 t w e e n2 0 ) 稍加漂浚，然后将貘浸没予封闭渡( 脱i 鬟奶粉lg ，t b s t 2 0m 1 ) 巾， 室漱下脱色摇床上摇动封闭lh 。 7 ) 用t b s t 将膜浸洗3 次，每次5 m i n 。 秘耱貘漫途焱蠲努翔滚缓1 ：5 0 0 0 鹣毙翻穗黪戆一抗( 帮f a k 融合蛋自瓣多克隆羧钵) 中，室温下脱色摇床上摇动孵育lh 或4 静置过夜。 9 ) 魍t b s t 将膜浸洗3 次，每次5 m i n 。 1 0 ) 将膜浸海在用t b s t 按1 ：5 0 0 0 的篦例稀释静二藏( 帮辣裰避襞伍耪酶标记酶羊抗藏 i g g 抗体) 中，室温下脱色摇床上摇动孵育lh 。 | 1 ) 援t b s t 褥膜浸洗3 次，每次5 m i n 。然后进行a e c 纯学攫色检测。 1 2 ) 显色反应：膜浸入藏色液( a e c1 0 m g ，二甲基甲黻胺1 2 5m l ，0 0 5m n a a c2 5m l ， 3 0 h 2 0 21 2 5t t l ) 中，观察颜色区带的出现，一般反应在l o 2 0 m i n 内完成。充分鼹色 嚣立帮将貘转歪去褰予窳孛，终壹显色爱蔽，宠势浚净显色滚，淤免鹜爨避深。骥藿滤 纸上干燥，分析结果。 2 2 4 4f a k 多抗的免疫荧光细胞染色 将n l t 细胞铺在1 2 孔板内清洗干净的箍玻片上，贴壁过夜培养：预冷甲醇2 0 固 定2 0 m i n ，p b s 清洗，2 p b s 窒溢封溺3 0 分锋：p b s 清洗，翻入瑁p b s 稀释黥挠 血清孵育2 h ，。p b s 清洗，加入p b sl ：5 0 0 稀释的f 1 t c 标记的羊抗鼠抗体，室温反应 2 h ，p b s 洗去 特舅绦结合，9 0 磐油封篾。分裂教耀未免疫豹夺鬣盎渗，纯纯懿f a k 中和过夜的f a k 抗血清，按相同的方法进行对照染饿，置荧光短微镜观察。 l o 3 结果 3 1 原核表达质粒p e l 一2 8 a ( + ) 一f a k 的构建 原核表达质粒的构建流程图如图1 所示，采用p e t - 2 8 a ( + ) 为表达载体经b a m hi 和 h i n d 酶切后得到表达载体骨架( 图2 ) ，将质粒f l a g - f a k 经p c r 得到目的基因f a k 片段( 图3 ) ，3 端带有t a g 终止密码予。将目的基因f a k 片段克隆于表达载体p e t 2 8 + ) 的b a m hi 和h i n di i i 酶切位点之间( 图4 ) ，构建的融合基因表达出的融合蛋白在n 端带有6 h i s 的标签。因为f a k 蛋白本身分子量为3 0k d a ，加上n 端的融合标签部 分多出的3 3 个氨基酸，该融合蛋白分子量约为3 3k d a 。将连接产物转化到感受态菌细 胞d h 5 a 中复制扩增。 目的基因f a k 片段 8 2 6 b p 片段 l d n a 连接酶 _ 图l 重组质粒p e t - 2 8 a ( + ) - f a k 构建示意图 酶 黼2 质鞋f i a g - f a k 豹p c r 产物扩增黼潜 m ：m a r k e r 2 0 0 0 l ；阴性对照 2 ；p c r 扩增产耪。 f i glt h e p c r p r o d u c t o f p l a s m i d f t a g - f a k m ：d l2 0 0 0m a r k e r ；l ：n e g a t i v cc o n t r o l ；2 ：p e r p r o d u c t o f p l a s m i df l a g - f a k 圈3 质粒p e t - 2 8 a ( + ) 的限制性酶切鉴定 m x d n a d i g e s t ： 1 # 点酷鼯d | i b a m hi 酶切。 秭2r e s t r i c t i v e e n z y r i l ed i g e s t i o n娃 r e c o m b i n a n tp l a s m i dp e t - 2 8 a ( + ) f a k m ：l - h i n di i i d i g e s td n am l t r k e r ：1 ： r e c o m b i n a n t p l a s m i dp e t - 2 8 耐+ ) f a k d i g e s t e db yi l i n d l l a n db a m hf 必黧t c p t c g a t = c g c 。：a a a t j t a a t a 焉c gt 三c a c 磊葡t t g 黝鬻赢。然t a c a a a ，a a t t t t g t 。t t t 。勰，#c# ct n g # 8 口“t e c c 0 0 t 矗c 1 t c c c c t ct t cm 融 g 丝i l 警攘鲢蹩氅! 鼬 h t c c t 8 e 口c e e c 盯c 1 e t 0 t c 0 c 觞e