（生物化学与分子生物学专业论文）铜绿假单胞菌鞭毛运动相关基因的功能研究.pdf

撼要 铜徘假单胞菌( p s o u d o # ? o n & 9a e r u g i n o s a ) 是种分布广泛冉勺条件致焖荫， 常在临床上引起顽i 捌性、难治性感染，成为峪床治疗的棘手问题。黢毛作为铜绿 鞭晕戆蕊圭簧魏运动器富拳；嚣要黪簿鸯蔑予，对镧缀骤攀熬楚致燕窝生秘披溪赞 形成中蕊赣夔要 窜弼。本文阻一拣峻露分离瓣锶绿假单您蕊p a 6 8 擞受髂穗，应 瘸m u 转廉复合物拽零扶反内遣博学的霸凄对溅黾运动的棚荚基毽遴 于磷究。 本文雷次薅m u 转寝羹台甓技寒惠鬻囊鬏肇怒萤煞磅憝蒸露缝磷究，藏勒馥 化条粹婚m u 转座氯台物转入到铜舔假荜脆菌p a 6 8 中，襻剐3 6 6 xl 矿c f u i pg d n a 的简转亿效率，构建了菌株p a 6 8 的m u 转庶突变文库。对m u 转座突变予 进行渌韵酾臻簿运动靛力翦检测，簿逸蠢赣毛遴渤爨力靛聚溅突变予6 椿，爱过 s o u t h e r nb l o t 鉴定、旗困克隆、核谤酸测序研究，鉴定出了转您予插入到撼因组 中鲍位麟。结果表明，6 个鞭毛运动能力缺陷型突变子中，转窿子分别播入剐5 争羹蕊饿。鼓甄p h z f t ，p a 爨搿器p a 0 4 1 3 蕊逡嫠。p a o t t l 鋈g 嚣子臻戆宠 全去躲瓣基黼。 对辩躐p a o t 7 1 避彳予了垒摩刿测定，同露利删邀传蓬缀秽谴健互补实验避一步 醛究蒸瀚p a o t 7 i 秘功貔，缝暴袭臻，撬蒋擞# ! 强莲援羲表达簸粒p d n ，p a o l 7 1 使突变予p a 6 8 p a 0 1 7 1 ：；m u 的泳动能力恢复蕊砸常水平，蜂群运动能力部分回 复；搬搠同源重缳麒避，在铜绿假棼胞髓标准株p a 0 1 中构越了基聪p a 0 1 7 1 突 变子。运动携努猃测燕示，突变孑p a o i p a 0 1 7 1 ；：巷赢丧失了鞭毛运动姥力， 实验续聚证明p a 0 1 7 1 基闲参与了艘a e r t z g i n o s a 瓣鞭毛运动。 在电子鼹微镜下泌黎p a o t 7 ，突变予的缨落澎态，结果淤躜，p a o t 7 t 突嶷予 蕊藤罨澎恋浚舂臻燕窝诧，蘧襞嚣4 0 1 7 1 墓鬻可黥为鞭毛运动鹣凑繁基黧。零文 稠蠲m u 转瘩酶菱台锈授术蓄次诞鞠p a 0 1 7 1 与pa r e u g i n o s a 的鞭毛运勘稠关。 美疆镶：m u 转痉整合瓣；锶绿藏摹貔蘩；壤鼍；溶韵；蜂群运渤 a b s l t r a c t p s e u d o m o n a sa e r u g i n o s ai sau b i q u i t o u se n v i r o n m e n t a lb a c t e r i u m i ti so n eo ft h et o pt h r e e c a u s e so fo p p o r t u n i s t i ch u m a ui n f e c t i o n s f l a g e l l u mo fp a e r u g i n o s z 。p l a y sa ni m p o r t a n tr o l e d u r i n gt h ec o u r s eo ff o r m a t i o no fb i o f i l ma n dn o s o g e n e s i s 。t ut h i ss t u d y , w es t u d yt h eg e n e s i n v o l v e d i n m o t i l i t yo f f l a g e l l u m o f p a e t u g i n o s a s t r a i np a 6 8 b yr e v e r s e g e n e t i c s m e t h o d s + i t i st h ef i r s tt i m et ou s em ut r a n s p o s i t i o n c o m p l e x e st e c h n i q u e 船s t u d yt h ef u n c t i o n a i g e n o m eo fpa e r t t g i n o s a a f f e r o p t i m i z i n g t h e e e c t r o p o r a t i o nc o n d i t i o n ，m ut r a n s p o n s o n c o m p l e x e sh a v eb e e ns u c c e s s f u l l y i n t r o d u c e di n t o p o e ? 。u g i n o s as t r a i np a 6 8a n do b t a i n e d e f f i c i e n c ya sh i g ha s3 6 6 x 1 0 4c f u g gd n a 。f h e nt h ep o o lo fm i n i 。m ui n s e r t i o nm u t a n t sw a s e s t a b l i s h e d ，a f t e rs c r e e n i n g ，6m u t a n t sd e f i c i e n ti ns w i m m i n gm o t i l i t yw e r ei s o l a t e do u to fa b o u t 1 5 0 0 m i n i - m u i n s e r t i o n m u t a n t s , o f w h i c h 4 m u t a n t s a t s od e f i c i e n t i ns w a r m i n g m o t i l i t y s o u t h e r n b l o t t i n gc o n f i r m e dt h a tt h ei n s e r t i o n sh a do c c u r r e d a ss i n g l ee v e n t s d n a s e q u e n c i n g o f h e r e g i o n f l a n k i n gt h ei n s e r t i o n r e v e a l e dt h a tt h em i n i m ut r a n s p o s o nh a di n s e r t e di u t od i f f e r e n tg e n e s ( 1 w d t = t ，j p h z f l 、p a o l 7 1 a n d p a 0 4 1 3 ) i nf i a g e l l a rm o t i l i t yd e f i c i e n tm u t a n t s ，t h ef u n c t i o no f p a o i7 1i se n t i r e l yn o v e l t h ec o m p l e t en u e l e o t i d es e q u e n c e o f p a o l 7 1w a sd e t e l m i n e d ，m e a n w h i l e ，w es u b s t a n t i a t e d t h ef u n c t i o no fp a 0 1 7 1 t h r o u g hg e n e t i cr e c o m b i n a t i o na n dg e n e t i cc o m p l e m e n t s w i m m i n s m o t i l i t yo ft h ep a o l 7 tm u t a n tw a sf u l l yc o m p l e m e n t e da n ds w w m i n gm o t i l i t yo ft h ep a 0 1 7 1 m u t a n t w a , s p a r t l yc o m p l e m e n t e d w h e n p a 0 1 7 1 w a s p r o v i d e d a p a o 7 1 m u t a n t w a sc o n s t r u c t e d b yg e n er e p l a c e m e n t i n t h e 产a e r u g i n o s a p a o i s t r a i n ，m o t i l i t ya s s a y s h o w e dt h a t p a o i p a 0 1 7 1 m u t a n t l o s s t h e s w i m m i n g m o t i l i t y m e d i a t e d b y f l a g e l l u m f l a g e l l a e x m n i n a t i o nw a sp e r f o r m e du s i n ge l e c t r o n m i c r o s c o p y p a 0 1 7 1m u t a n tc 5 4e o l l t a i n s f l a g e l l u n l , j u s tl i k ew i d et y p es t r a i np a 6 8 ，s u g g e s t i n gt h a tp a 0 1 7 1i sp r o b a b l yar e g u l a t i o ng e n e w h i c hc o n t r o l f l a g e l l a rm o t i l i t yo fp , a e r u g i n o s a t h i ss t u d yi sf i r s tt i m et os h o wi n 0 1 7 1i s r e q u i r e d 轴f m o t i t i t y o f f l a g e l l a o f p a e r u g i n o s a k e y w o r d s ：m u t r a n s p o s i t i o nc o m p l e x ；p s e u d o m o n a s a e m g i m ) s a ；f l a g e l l u m ；s w i m m i n gm o t i l i t y ； s w a r m i n gm o t i l i t y 南开大学硕l ：毕业( 学位) 论文 铜镣假华胞菌鞭焉逡动相关基斟的功能研究 h u 舌 1 1 铜绿假单胞菌及其致病性 铜绿假单胞菌( t b e u d o m o n a s a e r u g i n o s a ) 属缎单胞菌属，蕊兰氏阴性菌，又名 绿脓杆菌，它是种广泛分布于自然嚣及f 常人皮肤、肠道和孵吸道的条俘致病菌， 能使昆虫、动物、植物致痫( f t a r u n u ra n da r t h u r2 0 0 0 ) ，在临床上，它能引起黼m 病、 骂、聚、皮驳及软缀织、黉及关节、，0 悫羧秘呼蔽系绞等夔感染( m a n d e le ta i 1 9 9 5 ) ， 是人类的三大致病菌之( s t o v e re l ；a 1 2 0 0 0 ) ，怒日i 起肺炎的酋要致病菌( l i l i e h o j o ta l 。2 0 0 2 ) 。由于其具有形戏生物被摸( 麓庆伟等1 9 9 7 ) 等多重耐芬机到，耐药率寿， 常在临床上q | 起顽固性、难治性感染，成为临床治疗的棘手问题。 1 。1 1 生物学性状 始攒患铙下锈绿酸攀魏蘸菡钵舔瞒镱围，呈蠹楞狻，大小为t + 6 7 2 。2 9 0 4 2p r n ，排列不规律，呈现不同层次，疏密不均的分布状态。菌体一端一般有一根鞭罨，运动 透浚。无蒡腿，米波型莹撩有多糠葵袋藏糖萼，具有摭吞噬撵用。在普通培养蕊上生 长良好，专性需氧。菌蒋形念不一，多数直径2 3 m m ，边缘不憋齐，扁平澡涧。在 衄琼脂平板上形成透明溶血l 环。液体培养呈混浊生长，并有菌膜形成。 铜绿假单胞菌具有众多毒力因予，包括与细胞膜相连的鞭琵、i v 型菌毛、蒲毛、 = 推菌毛支持物、藻酸盐和脂多糖，胞蚓分泌物为内谶豢、外毒索a 、弹性蛋白酶、胶 艨酶、鼹觚鹣、绿脓索等，鲡圈l 。镧绿镁单麓蘸麓产生两种永溶佳色素：一种楚绿 脓索，为蠊绿色的吩嗪类化合物，无荧光性，具有抗幽作用。另种为荧光索，呈绿 色e 绿玻素只煮绿稼抒蘸产生，兹有诊黢熬义。但广泛整矮奏效撬生素磊簿选出熬交 异株常丧失其合成能力。 南开大学硕_ ：毕业( 学位) 论文铜绿假单胞卣鞭毛运动相关基因的功能研究 图1 铜绿假单胞菌的毒力因子 铜绿假单胞菌分解蛋白质能力甚强，而发酵糖类能力较低，分解葡萄糖，产酸不 产气，不分解甘露醇、乳糖及蔗糖，能液化明胶。分解尿素，不形成吲哚，氧化酶试 验阡陛，可利用枸椽酸盐。绿脓杆菌有菌体0 抗原和鞭毛h 抗原。0 抗原含有内毒素 和原内毒素蛋白质两种成份。原内毒素蛋白质是一种高分子、低毒性，免疫原性强的 保护性抗原，不仅存在于不同f f i l 清型绿脓杆菌中，而且广泛存在于假单胞菌属的其他 细菌以及肺炎杆菌、火肠杆菌、霍乱弧菌等g 一细菌中，是一种良好的交叉保护抗原。 1 1 2 致病性 铜绿假单胞菌做为呼吸道感染的重要条件致病菌，自然界广泛存在，正常人皮肤 肠道和呼吸道都有存在。铜绿假单胞菌是医院内感染的主要病原菌之一，感染可发生 存人体任何部位和组纵、常见于烧伤或创伤部位、中耳、角膜、尿道和呼吸道。也可 引起心内膜炎、胃肠炎、脓胸甚至败血症。患代谢性疾病、血液病和恶性肿瘤患者， 以及术后或某些治疗后的患者容易感染此菌。铜绿假单胞菌可以通过交叉感染、环境 污染、医源性感染、内源性感染等方式造成机体感染，尤其是患有其它基础疾病患者 磷器文学骚+ 攀渡( 拳擅3 掩文嘲趣鞭挚胞蓥鞭壤运动辐关基剧鼬驹能研究 的f 呼吸滋感染，导致p aj j i 缸炎( m a y e ra n dz i n n e c1 9 8 5 ) 。铜绿假胤菌在医院感染t 的 蹩要牲不仅畿理褒惑染骢怒鐾土，幽j i 铡绿啜单魏撼本赛县枣天然黝螽天获锶灼霸g 药 性，耐药发蕊迅速，蠡噩它裁往缭治疗皇潜寒霹难( 黎羧玲等1 9 9 6 ) 。 1 2 生秘救摸与致癀憋 锈燎豫单艟菡在掭臻上荔遥感罐潦茬感染瀚蹩要蒙霞懋冀爨产生室翰袭膜 ( b i o f il m ) ，有生物被腆的细菌具有极强的抗药性及抗吞噬、抵趟化作用。生物被膜 港逡是1 9 7 8 霉鑫c o s t e r t o n 蓄竟茇虢势舞塞爨( c o s t e r t o ne ta 1 ；1 9 7 8 ) 。生凌 被膜是包娩于细菌微菌辫液面的种移糖蛋白复合物，它足由一种或多种单将杂聚组 菠，主要袋分跫已薅。生秘技壤楚予搬凝获状态，可镙护麴蔼兔照拭蓥药物黝馋用，因 此生物被麟缁菌镁难滴滁( c o s t e l t o ne ta 1 1 9 9 5 ，1 9 9 9 ，2 0 0 i ) 。 生物被麒作为一种群敞可以保护绷菌免受机体免疫系统或抗鲻药物的杀灭。具悴 藐菱洼瓤爱奁予：器残生赣被骥戆鏊蘸分滋丈耋蕊藻魏囊，蒸酸赫本龛终灸一静撬豢， 刺激机体产生抗体，这般抗体不能渗八被膜内部清除感染，却与中性粒细胞绺台，沉 羧褒霪絷帮整爱冀蘩避，葶 起麦量漤溅爨遂浸溺，造壤舞零缝竣臻餐：生翰羧骥粥毖 继续向周围环境缓慢地释放浮游菌，引超反复性惑激。在m a h ( m a h a n d0 o o t t e2 0 0 t ) 艇报道中，生物被膜中细菌产生的生理适应过稷才是使生物被膜产生抗性的艨凶。 这些雾蟪拣生素羲霞懿袭裂竣变鼠捺溪漤蕊皇长逮攀，蘩鏊多斡蕊戆藤努簿露游鉴邃 表达，自脚修饰和降解半宄生索分子【： 勺黼量的增加以及抗生素作用位点的改变( a n w a r e t a ! ，1 9 8 9 ，h o y | e a n d c o s t 雠o n1 9 9 i ，v e r g e r e s a 稿b 1 a s e r | 9 9 2 ) 。 生物被膜可能采取辫种机箭来逃避抗生素的作糟。 其巾蕈串规割是抗生索难以穿遂生物被貘。组成生物被膜纂艘的聚台物髓够魁止 挽生素鹃扩散，面虽蔽擘三綮在生蘧液簇中游扩惑遮浚要 e 在东串矮德多。热慕抗生素 分子在q ：物被膜外层：兜滞的速度大予扩散的速度，道坚固的防线将被建斑j 起来。 舅一瓣瓣簿皇黎鼓黢霹羲圭素熬羝蕊嚣杰静羰滋舞塞，餐袋生戆蓑蓑黎骜鬃基 毒开大学疆 擎韭( 学位) 论文 锅绿经蕈魏麓鞭毛运象相关蔟瓣瓣瑰麓磅究 承受誊营养状况的限制，因此他们或者是生长缓慢或者足处二：! ：饥饿状态。由于杀菌类 巯生豢哭箨霆予我落活跃麴缨萤，蠢挖这些生长缓疆或者麓箨盘生氏熬缨_ | l 鏊对这些撬 生素分予都不敏感( m a ha n d0 o o t l e2 0 0 1 ) 。 1 。3 生物被膜形成的分子机镧 生物被膜形成的分子机制，网内尚未见牛h 关报道，在最近的t 多年时间早，t 物 羧簇鹣辍箕重要的冁床意义弓| 越了簿努一些辩攀家戆重褪，使谴爨涉是魏领域送行瑟 究。随潜些1 7 生物被膜形成相关的分子生物学和遗传学的信息的逐渐被发现，人们 对生物羧壤形成黪过联遣持有不瓣瓣礁点，始s a u e r 等( m a t t i c k2 0 0 2 ) 将生物披膜 的形成分为可逆性附着，不可邋附着，突变一1 ，突变一2 和播散五个阶段。但多数 科学家倾向于将铡绿假单胞菌生物被膜的形成机理分为兰步：个体细胞在网体表面的 蔽辫；徽蔻落酶形成；最终分纯成包被寿多糖蛋自囊篾龠镑静藏熬被貘( 礤o r e s 2 0 0 2 。0 t o o l ea n dk o t e r1 9 9 8 ) 。我们将前两步定义为生物被膜形成的早期，最后 步旅必生物被摸的成熟期。 1 3 1 生物被膜形成的早期 pa e r u k i n o s e l 3 煮拳端单缀鞭毛和数棂饶予继照溻帮的l v 型蘩毛。二二誊作为运 动“器官”，使pa e “磐j ，7 0 能转移自身，寻求台适的生存环境，避开有害物质。 困刚，二者还参与了生物被膜的形成。 k o l t e r 弱穗静溺豢搜矮传统转座子技术，建立铜绿缓擎耀蔼、荧光稷壤胞菌和丈 肠杆菌的突变文库，并使用塑料微孔板法从突变文库中筛选不能起始生，物徽膜形成的 萤撩，发理了嚣堪突变子，一缀是鞭毛运动煞力丧失鹣突变予，它饲不戆镶鳋遗结 合到翅料微孔板。卜* ，另一组是i v 型菌毛运动能力丧失的突变予，相差显微镜观察发现， 这种突变子只能形成单层细胞，不能发育成微菌落。从丽不能起始生物被膜蛉形成 瞪lo r e s2 0 0 2 ，a n w a re ta i 。1 9 8 9 ，h o y l ea n dc o s t e r t o n1 9 9 1 ) 。 南最。夫警硕士莩鼗( 学位) 谴文 锈绿程挚簸蓥鞭毛运蘑鞫关蘸溺静功髓研究 进一”步的研究表明，在附着到固相表确f 之前，铜绿假单胞菌借助鞭毛的游泳运动 s w i m m i n g m o t i l i t y ) 溢羞鋈| 程袭露游动，魏好豫蔗为了羧弱一个翕适懿起始凄戆位 置u 进行着搜索。然后借助鞭毛成i v 型菌毛吸刚到同相表面( f 1 0 r e s2 0 0 2 ，v e i 、g e r e s a n db l a s e r 、1 9 9 2 ) ，并开始分裂、增殪。当缡藏在菲生物表蕊形成了肇层膜之厉，它 们并没有在固相表蕊静f 二，而怒继续移动。这时，细菌不话依赖鞭毛介哿的游泳运动 ( s w i m m i n gm o t i l i t y ) ，而是依赖于t v 型菌毛的伸展和收缩，推动或牵引自身在固相 表嚣遴 亍位置移动，这释运动，称为躇行运动( t w i t c h i n gm o t i l i t y ) ( s t o v e xe t a 1 2 0 0 0 ) 。细菌通过这种运动发商成微菌落。在铜绿假单胞菌中，由i v 型菌毛介导的 蹭行运动要毖鞭鼍贪导的游泳运动慢1 0 0 倍，遴一步熊硬究表嘤，细蔫强青在与其它 细胞接触的时候才会通过蹭行运动进行运动，这表明了这种运动是一种群体行为 ( l a m b e r ge ta 1 2 0 0 2 ) 。除了鞭罨和i v 型菌毛之外，细胞表面蛋白粘附索和脂多糖也 奁维穗秘嗣据表瑟豹相互捧蠲中起侮弼( s a m b r o o ke ta l1 9 8 9 ) 。瑟多糖韵改变能够 改变蜊菌的粘刚行为，尤其是铜绿假单胞菌，它能够产生两种脂多糖( a 和b 带) ，失 去b 繁耱多糖匏突变予与野生受鞠魄减少了麓= 东表露的暇嚣、| ，露对巯水表嚣戆吸醚 则得到增强( s m it ha n di g t e w s k i1 9 8 9 ) 。外部环境的刺激( 主要是营养状况) 和生 物信号分子在诱发生物被膜的起始形成中也起着薰露的作用( s a m b r o o ke t a l ，1 9 8 9 ) 。 1 3 2 被膜的成熟期 徽蘩落缀萤煞续努裂繁建，当生茛裂一定缨慈蜜凄时，激涯缨馨数薰感受系统 ( q u r u ms e n s i n gs y s t e m ) 使之产生信号因予，这些信号因子在细胞之间进行信息交 流，协调某些特定熬圈的表达。 镧绿饭单瞧蓠有两个半独立的蘑数量感受系统：7 a s r - l s s i 系统翻拍，牙嘶j ，系 统。在第一个系统中，日s ，基因的产物催化a - 1 信号n 一( 3 一o x o d o d e c a n o y l ) 一l - h s l 熬尹：鬟三，a 一l 与转录溺节髫子l a s r 稳互 乍髑，激活系列蒸嚣包蕤7 a s i 囊身、撵 翌奎篓塑兰兰兰! 兰簦! 篓奎 望篓茎兰望孽望墨垩堡塑墨鎏塑塑望墼塑塑 性蛋内酶基因l a * a 、a 船和次级系统的r f l l r 的表达；在髂二个系统中，产物r h i 簧导矗2 信号争b u t y r y ll - h s l 瓣食或，嚣者又激活一系列鏊委葭表达，毽话会成 鼠李脂的鼠李脂酰转移酶基因r h l a 、r p o s 摹蚓( r a s h i da n dk o rn b e r g2 0 0 0 。h a r t z e l l a n dg o u d e r i a n1 9 9 5 ) 。在这些信号申，a i t 楚形成芷常翦娥熬兹生物被膜所必需静 ( r a s h i da n dk o r n b e r g2 0 0 0 ) ，a i 一2 尉是蹭行运动所必需的( m c c e a r ya n dz u s m a n 1 9 9 0 ) 。伴随着这酬个信号的产生，引发了琴列特定基因的表达，和些毒力因子 瓣产生。最遥赫瑟究发现，勇耱信号c ；- h s i 。在豪餐皱膜发育鼹蚕弱除羧，表达量 也有懿蒋的差别( m a r t i ne ta 1 1 9 9 5 ) 。 尽管数鼙感受傣号在诲多种缨薄瓣生骛被膜辫或过程中怒蓑重要豁诈臻，但它并 不是罐熏要的效应方式。生物被膜分化成熟并不一定需要种遗传程序，事实上， 受群落中营养分布状况所影响的察种细胞适应过程私生长徽环才是导! 皴生物被膜分 纯成熟静主要黎因。在一定翦象静下，皇浆被瓣耦关群落会戮藤所有哥糍瓣适应视戮 和相应的网络调节滞动( 包括数燃感受系统) ( c r o f te ta l ，2 0 0 0 ) 。 越2 销绿僚萃照萤钛浮游缨鼹爨或熬生狻旋濮彤戏过程模式辫 鞭毫 紫色) 参与嵇附过程，型潦毛( 黑色) 参与了在匐相表掰的蹭行运动和在肇层菌体 表面微黼落的形成过樱nl - a s i 一依赖的数量感受信垮灞发形成厚而麓度分化的成熟拳物被腠。 百 街开大学硕1 ：毕业( 学位) 论文铜绿假学胞菌鞭毛运动相关基因的功能研究 综合i i 述研究结果，生物被膜的形成过程可以用一个模式图来表示。见图2 。 由图可见，鞭毛所介导的运动在被膜形成的早期，起着至关重要的作用。但目前，对 具体的分子机制还缺乏详细的研究，诸如生物被膜通常是在条件恶劣的环境f 形成 的。而鞭毛作为细菌的运动器官，本来可以转移自己，寻找更适合自身生存的环境， 它们为何放弃浮游生活，而是固着于固相表面或组织细胞表面? 嘲着细菌之间进行了 怎样的信息交换才开始向生物被膜发育? 具体哪些基因的开肩与关闭参与了被膜形 成的早期? 1 _ 4 铜绿假单胞菌鞭毛的结构与运动能力 铜绿假单胞菌有三种运动方式，一种是在半固体培基( 1 蛋白胨，0 5 n a t l ，0 3 琼脂) 的较厚的水膜上，依靠鞭毛的泳动，产生可见的生长圈，称为泳动能力( s w i m m i n g m o tj 1 i t y ) ：一种是蜂群运动能力( s w a r m i n gm o t i l i t y ) ，是在一种半固体培基( 0 5 琼脂8 克升酵母膏，5 克升葡萄糖) 的较薄的水膜上，由于培养基限制了其氮 源和碳源，而表现出一种化学趋向性，使菌体变长并出现多个鞭毛，形成放射状的生 长圈( k s t i e re ta 1 2 0 0 0 ) ；另一种是由t v 型菌毛介导的蹭行运动( t w i t c h i n g i n o t i l i t y ) ( r a s h i da n dk o r n b e r g2 0 0 0 ，d a s g u p t ae ta 1 2 0 0 0 ，e e l d m a na n db r y a n 1 9 9 8 ，a r o r ae ta 1 2 0 0 1 ，w i ls o na n dd o w l i n g1 9 9 8 ，d o w l i n ge ta 1 i 9 9 7 ) 。前 两种运动主要是由鞭毛介导，由一系列相互作用的基因来控制。 鞭毛是细菌最主要的运动器官，主要出鞭毛丝、钩形鞘和基体三个部分组成 ( b a r d ye ta 1 2 0 0 3 ) ，如图3 。鞭毛丝直径大约2 0n m ，由鞭毛蛋白聚合而成管状。 钩形鞘是螺旋状的，以锐角弯曲成“钩”状伸出外膜。在鞭毛钩和基体间有鞭毛杆支 持，革兰氏阳性菌的基体由两个蛋白盘状物构成，革兰氏阴性菌的基体由四个蛋白盘 状物构成，分别称为l 环( 连在细胞外壁层l p s 部位) 、p 环( 连在内壁的肽聚糖部 位) 、s 环( 与周质空间相连) 和m 环( 嵌入在细胞膜上) ，如图3 。鞭毛能够快速旋 鸯拜夫学硬主事鼗 ，3 7 。c 水浴过夜，其间时不时摇一下，馒鲞自酶k 能充分水解蛋白； 5 ) 每营拥3 2m t 等体软豹t r is 锪帮苯酚氯仿混合滚，到烈掇荡，1 4 0 0 0g ，离心 2 0m n ，取 相； 6 ) 重复用泐氯仿抽提3 次( 此时蛋囱层应该几乎消失) ，取上相； 7 ) 臃2 倍体积( 约4m 1 ) 无东乙醇，魇玻璃棒攫蹬沉淀，7 鳓乙簿洗一次，尽羹弄 得干些，真空干燥( 尽量抽干，以后好溶一些) ； 8 ) 凌撼予纛豹d n a 滚在2m y l e s 溶液孛( 5 0 0 撼t r i s h c i ，p h 8 + 0 ，5 me d r a ，s 0 穗 n a c ) ，每管加入1 5 u1 r n a s e ( 1 0 m g m 1 ) ，3 7 水浴1h ； 9 ) 2m 7 r r i s 饱和苯酚氯仿抽提蛋白， 4 0 0 0g ，离心1 0m i n 取上清( 如果獭自多， 应多掬撬次) ； 1 0 ) 取上清，加2 倍体积的无水乙醇( 约4 m 1 ) ，一2 0o c 槲d 、时，1 4 0 0 0g ，离心 l o m i n ； 1 1 ) 沉淀用7 0 乙醇洗两次，干燥后溶于适量的t e 中，并用琼脂糖凝胶电泳大致测定 d n a 浓度。 离= = 走擎磺量擎整( 学箍) 论文锾绿糕挚藏藕鞭毛运动稳关基蕊懿功慧簿 究 2 2 3 2 p u c l 9 质粒的大量提取 1 ) 肽耘鳝鞠线乎援上雾l 褒单拿蘩落，蔹穗到2 0 0 融j1 - b c o th 圭蓦养基( 5 0pg m la m p ) 中，于3 7 | 。c ，2 0 0r p m 培养过夜。 2 ) 将麓液分装入2 5 0m l 离心管 h 1 2 0 0 0r p m ，4 。c ，离心1m n ，收集菠体： 3 ) 渊t 0 0m ls t e ( 1 0 0m mn a c l ，t 0n 粥t r is c 1p i t8 。0 ，1 m me d t a ) 洗涤菌体， 将菌体沉淀打散，4 。| c 1 0 0 0 0 ：f p m 离心lm i n ，收集菌体： 4 ) 穆藩体沉淀悬浮予2 5m l 溶液l ( 5 0m 雏g l u c o s e ， l o 潮e d t a2 5 m mt r i s 。c 1 ， p 1 1 8 0 ) 中，振荡混匀； 5 ) 然屡加入5 0m l 瓣溶液i l ( 0 。2mn a o i t ，1 s d s ) ，充分漫襄混匀厝，在球上放 管5m in 至溶液清亮，此时蓠体已裂解； 6 ) 加入3 7 5 m l 溶液h i ( 3 mk a c ，5 m 乙酸，p 1 1 4 8 ) ，温和震荡混匀后，冰浴1 0 m i n ； 7 )1 2 0 0 0r p m ，4 。c 离心2 0 m i n ，霞爱纱布遗滤浚集圭：溘液，海l 二渚液巾翻入8 0 强l 的舜丙醇，室激放置1 0m i n ； 8 ) 1 2 0 0 0r p m ，室激离心1 5m i n ，弃上渣，收集沉淀，期逡潼靛7 0 乙醇( 约2 0m 1 ) 洗涤沉淀，洗涤两次，弃上清，在真空裂中抽干： 9 ) 干燥后的质粒沉淀加5m 1 t e ( 1 0m mt r i s c 1p i t 8 0 ，1m me d t a ) 溶解，分装到 2 个i 1 豫l 离心管中，每警确1 2 0 plr n a s e ( 1 0m g m l ) ，3 7 。c 承浴下反应th 以一卜； 1 0 ) 瘸等 搴较憝t r i s 键秘苯酸氯仿挞捷蘸次，疑上渍渡； 1 】) 7 j n 入2 倍体积( 5 m 1 ) 无水冷乙醇，混匀，于一2 0 。c 放鬣3 0 m i n ；1 2 0 0 0 r p m ，4 。c 禽心1 0m i n ：弃上潼，将质粒沉淀用5m 1 的7 0 l 醇洗两次；在真空泵中抽干， 溶予适量豹髓中。取1 s ul 疆粒在0 8 菇瀚骧l 旨糖凝胶 ：电泳，以d l l 5 0 0 0 散d n a 含鼹标准，对斌粒进行大致的定量。 2 。2 。3 3p u c l 9 载体夔陵裁缝滤镯酶漩纯及碱经磷酸酶鲶壤 蠢开大学赣士年韭( 学 奇- ) 沧文锕绿锻攀艴藏鞭毛运动糟芙蘸强扮功能矮究 p u c l 9 用限制性内切酶b a z k l i 酶切处理，在5 0ul 反应体系中，加入5 1 t1 的1 0 酶贸缓狰滚，5 pl l m g m l 戆b s a ，适量的p o c l 9 最粒薏j 3p1 狠毒l 经内切酶，羚 加d d h 2 0 至5 0u1 。于3 7 。c 保温2h 厉，6 5 。c 灭活b a m h i1 5m i n 。每管* b ) j n1 5 0 lt f ( p 1 1 8 ，0 ) ，毒瘸等体积瓣苯黔畿仿抽提一次，翅1 1 0 体彀的3m o l t 。n a a c ( p h 4 8 ) ，2 倍体积的无水乙醇，一2 0 中放黼3 0r a i n ，1 2 0 0 0r p m 离心1 0m i f l ，d n a 沉淀用7 0 乙醇洗涤两次，毖空采中抽干。溶于少量的t e ( 1 0 m m t r i s ，l l c l ，1m me d t a ，p h 8 0 ) 缓冲滚中。为提高逡接效率，丽器强小弱碱性磷酸单繇酶( c i a p ) 去狳线形纯鹃p u t l 9 分子5 ，端的磷酸。具体方法按照厂家提供的说明书进行。在1 0 0 ul 反应体系中， 据j 久1 0 pl 懿i o x 酶甥缓冲滚，逡量嚣p u c l 8 屡羧农2 1 1l 隈到性杰叨黪，羚燕1 0 趟 t r is c 1 ( d 1 18 o ) 至1 0 0 “l 。3 7 。c 水浴酶切4 0m i n 。补加t e ( p h7 ，5 ，1 0 ：1 ) 1 0 0 pl ，加2 pl 0 5me d t a ( 终浓度至5m me d t a ) ，7 5 。c ，1 0m i n 火活c i a p ，加 两倍体积( 约2 0 0 # j ) 苯酚氯镑赫提两次，淑上清翔入2 0 t ti 3 mn a a c ( p h7 0 ) 和4 5 0 “1 无水乙醇，冰上置2 0m i n ，离心沉淀，7 0 7 , 醇洗沉淀两次，真空泵抽千， 滚亍逑爨戆双蒸承中。 2 2 3 + d 突变子基因组d n a 的限制性内切酶消化和酶切后酶的灭活 使用限制性内切酶b a d t t 消化基因组d n a ，在5 0 计l 反应体系中，加入5 l 的 i 0 x 酶切缓冲液，5 h11 m g m l 的b s a ，适量的p o e l 8 蒺粒和3 h1 限制性内切酶， 补自i id d h 。0 至5 0 “l 。于3 7 。c 保温，因为基因组d n a 分予量大、浓度商，为使b a 时i i 酶韬完全，反应辩溪延长至酶锈过夜。在6 5 4 ct 5m i n 灭活b a 8 1 4 i 魏。每管季 鸯 1 5 0i 1 e ( p h8 0 ) ，再用等体积的苯酚氯仿抽提一次，加l 1 0 体积的3m o l 1 n a a c ( 硼8 ) ，2 镶体积的无水乙瓣，一2 0 中放置3 0m i n ，1 2 0 0 0g 离心t o m i n ，d n a 沉淀用7 0 乙醇洗涤两次，真空泵中抽干。溶于少量的t e ( 1 0m m t r i s h 瓯，11 1 1 me d t a ， p h 8 0 ) 缓冲液或d d h 。0 中。 2 2 。3 5 酶甥懿突黛子基因缝d n a 耧p o c 黉羧的连接反应 蠢开丈学颤i 率韭学经) 论文鞲绿簸荦耱蘧鞭毛运韵稳美箍强秘功毵疆究 使用t 4 连接酶连接酶切的突变子基因组d n a 和p u c 质粒。连接体系1 5l l 】，为 氆麴连接效率，蓄先将l | il 突变予纂嚣缝冀獗，1 0 pld d l t 2 0 季l l | ll p l j c l 9 混匀 ( p u c l 9 与运动能力缺陷型突变予鏊因组片断按适当的比例概匀) ，于4 5 。c 保温5 m i f l ， 两后邋速置于冰上冷却，搬1 5 # ll o x 连接酶缓冲液和1 。5 t 1 1 t 4 连接瓣，混匀1 4 保温过夜。将连接混合物用苯酚氯仿抽提一次，加2 情体积的无水乙醇沉淀丽， 7 0 己醇洗两次，抽干后将d n a 溶于5 ul d d i t 。0 - 1 全部用于一次电转化。 2 2 3 6 重盔藏粒鹣转佳 从过夜活化的l 8 平板，l 挑取单个菌落，接种到5m 1l - b r o t h 液体培养基中， 于3 76 c ，2 0 0f p m 壤养过夜； 1 ) 将过夜液体培养的d h 5n 拔1 接种量接种到2 0 0m ll - b r o t h 液体培养基中， 3 7 。c 2 0 0r p m 振荡培养； 2 ) 使滔7 5 2 努光光壤诗溅定缨麓培养秘在5 4 0r l t l l 薤静蹶光浚，在8 魏”为0 。5 左右 终止培养； 3 ) 健裂r p r l 6 4 1 9 转予在24 c 条舅二下，6 0 0 0r p m 离心l e 分镑，收集嫠髂； 4 ) 依次用存冰浴中预冷的等体积、1 2 体积的水和1 5 体积的甘油( t0 ) 重新悬浮、 洗涤菌体，24 c ，6 0 0 0r p m 离心l o 分钟； 5 ) 最蜃将菌髂溶予1m t1 0 曹油溶液中混匀； 6 ) 处理连接产物，乙醇沉淀( 步骤同质粒提取) ，最后5 1d i ) w 中； ? ) 凌感受悫鳃鼹分装残每1 0 0 # l ，与5 # l 逶滚产穆混匀，毒孥其魏入到预冷瓣0 。2 c m 电转化杯中，( 阴性对照只加感受态细胞= i ：f i 加连接产物) ； 8 ) 冰浴3 ( 】m in ，其闻分装并预瀑s o c 培养基； 9 ) 在b i o r a d 电穿孔仪上，设鬣电容2 5pf ，电阻2 0 0 欧姆，以及不同的电压进行电 击； l o ) 惫壶鑫将瞧转纯嚣系声天毫转化辍中啜盘，麴入嚣羲先3 7 。c 瀣滋静9 0 0 1 s o c 培葵 南开犬学醐土毕业( 学位) 论文 锕绿假单腿菌鞭亳运动相关基因的功轾研究 基中，3 7 。c ，2 2 5 转分，复苏1h ； 1 1 ) 将菌液涂布在l b 筛遮培养基( 含a m p1 0 0 ug m l ，k m3 0 ug m j ) t ，3 7 。c 培养 1 6 1 8h ，筛选克陵乎。 2 2 3 7 克隆子的检测 ) p c r 捡溅 将得到的克隆子转按于固体l b 培养基过夜培养后，取少量菌液为模板，以转座 予两端的序列做引物( 引物1 ：5 _ g c a a c t g t c c a t a c t c t g a 一3 ，引物2 ： 5 一e g c t g g g t t t a t c g t c g a - 3 ) 进行p e r 葳应。反应条件为：先在9 4 。c 预变健1 5m i n ， 然后，9 4 。c 变性1m i n ，5 64 c i g 火4 5s e c ，7 2 。c 延伸1m i n ，共3 5 个循环，w 在7 2 延 幸 0r a i n 。0 8 毽璩l 蓦糖凝菠毫泳稔溅其爱秀够扩凄逛7 0 0 b p 涵爱豹背浚，阻 确定足否为阳性克隆予。 2 ) 质粒酶切检测 挑取上步筛选的阳能克隆子，按种到3m ll b r o t h 培养基中，过夜培养后，按 碱法( s a m b r o o ke ta 1 1 9 8 9 ) 小量提取质粒，并将质粒用b a 脚t i 酶切，用0 8 琼 蓦耱凝驳惫滚检验，鬻瞧壳隧予酶凌惹应该含有一令终2 7 k b 豹线影p u c l 8 繁帮籀应 的外源片断的带。挑选阳性克隆子送去d n a 测序。 2 2 3 8 转缝子插入使点侧翼的基因缌房剜分析 以人一f ：m u 转座予两端的反向序列做引物，测定转座子插入位点两侧的核苷酸序 列。插入位点的每一侧做个测序反应。测序采用s a n g e r 双脱氯末端终止法，使崩 a b i - - 3 7 7 x l 全自动溅序仪，测序弓l 物为p r i m e r l ：5 一g c 矗a c t 嚣e c a a e t e 下g a 3 ， p r i m e t 2 ：5 c g c t g g g t t t a t c g t c g a - - - 3 引物合成及测序反应均委托上海生二l 公司( s a n g o n ) 亮藏。测廖结果通过i n t e r n e t 阚上魏a s t 软件在g e n b a n k 数攥蓐巾 进行同源性检索，网址为h t t p ：w w w n c b i n l m n ：i h g o v 。熬因功能在铜绿假单 胞菌的基因级数据库q 一进行分析，网j ：| f ：为! ! q ；m 拦：2 塑! l ! 堡! ! ! 她：! 鲤。 南开人学倾卜毕业( 学位) 论文 铜绿假单胞菌鞭毛运动相关基冈的功能研究 2 2 3 9 突变子m u 单点插入的s o u t h e r n 杂交检测 将鞭毛运动能力缺陷型突变子的基因组d n a 分别用肋棚i 和k p n i 酶切，酶切届的 样品在0 8 的琼脂糖凝胶中电泳，电压4 v c m ，电泳时间1 1 5h 。电泳完成后将 琼脂糖凝胶浸入盛有0 2m o l 1 的培养皿中浸泡1 0m i n ，然后用去离子水漂洗，接 着将凝胶转移至盛有变性液( n a c l 1 5m o l l ，n a o h0 5m e l 。) 的培养删q ，浸泡 6 0m i n ，并温和振荡，使d n a 变性。变性完成后，将胶在去离子水中漂洗2 次，把胶 转移到盛有中和液( n a 9 11 5m o l l ，t r i sl m o l l ) 的培养皿中，于室温下温和 振荡，使之中和。3 0m i n 之后更换新的中和液，继续浸泡1 5r a i n 。 在此期间，根据凝胶的大小剪裁一张四周大于凝胶1h i m 的尼龙膜，将其正面朝 上浮在盛有去离子水的培养皿中使之从下至上充分渗透浸湿，再剪裁两张较凝胶稍小 的3m m 滤纸和一张大滤纸，在一个白磁盘中倒入适量的2 0 s s c 转膜缓冲液( n a c l3 m o t ，柠檬酸钠o 3m o l i ，p h 7 0 ) ，把一块玻璃板放在上面搭成平台。将大滤纸 平铺在平台上，用2 0 s s c 浸湿并使它的两端浸入盘中的转移缓冲液中。将中和后的 凝胶翻转，使其背面向上，放在平台上湿润的3m m 滤纸中央，以保鲜膜围绕凝胶周 同，防止液体白液池直接流至凝胶上方的纸层中。用2 0 s s c 浸泡尼龙膜至少5mj n ， 然后将尼龙膜正而朝下铺于凝胶上，尼龙膜上方放