（无机化学专业论文）金属配合物与dna的相互作用.pdf

摘要 小分子化合物与生物大分子相互作用的研究已经成为了化学生物学中重要的研究课 题。d n a 是生物体中重要的一类生物大分子，对生命遗传密码的翻译、 转录、复制 起着非常重要的作用，一方面，d n a 靶向化合物成为很重要的核酸探针选择对象；另一 方面，临庆上使用的许多抗癌药物都以d n a 为作用靶点。为了进步探索和认识d n a 的 性质、结构、行为、形态、揭开生命的奥秘，人们研究了大量小分子与d n a 之间的作 用，并且许多小分子现已成功地用作d n a 足迹试剂，定位碱基错配试剂，以及结构探针。 小分子与d n a 的相互作用的研究不仅有利于探索和开发新的核酸探针，而且有助于从 分子水平上了解抗癌药物的作用机理，为设计临床上更为有效的抗癌药物提供理论指导。 本文在此基础上采用光谱法、凝胶电泳、电化学、圆二色谱等方法研究了抗肿瘤药物维 甲酸和桑色素金属配合物与d n a 的相互作用。 本论文主要由以下三部分组成： 1 全反式维甲酸稀土配合物与d n a 的相互作用 利用光谱法、凝胶电泳和粘度法研究了两种稀土配合物维甲酸合钇( i i i ) 、维甲 酸合钐( i i i ) 与d n a 的相互作用。发现维甲酸合钇( i i i ) 是种有效的d n a 切割试剂， 在生理条件( p h 近中性，温度3 7 ) 下，0 0 1 r a m 钇( i i i ) 配合物与3 7 r a m 质粒p b r 3 2 2 d n a 反应2 小时后超螺旋构型几乎完全消失。且钇( i i i ) 配合物切割活性优于配体维甲酸， 这可能是维甲酸合钇( i i i ) 配合物的抗肿瘤活性优于配体的原因之一。通过改变切割体 系的离子强度，p h ，加入羟基自由基捕捉剂，发现d n a 的切割对离子强度，p h 表现出 很强的敏感性，但几乎不受羟基自由基的影响，由此可见，反应没有产生羟基自由基。 同时，我们通过e b ( 溴化乙锭) 荧光探针竞争实验和粘度实验发现：这两种配合物使 e b d n a 体系的荧光强度降低，d n a 的粘度增加。钐( i i i ) 配合物能使圆二色谱中d n a 的负峰发生较大变化，d n a 热变性温度升高。据此推断，这两种稀土配合物维甲酸合钇 ( i i i ) 、钐( i i i ) 主要以嵌入方式与d n a 作用，这种作用方式可能是该配合物对h l 6 0 、 e j 癌细胞瘤株有较强抑制作用的又一原因。 2 全反式维甲酸过渡金属配合物与d n a 的相互作用 本章利用光谱法、凝胶电泳、粘度和电化学方法研究了两种维甲酸过渡金属配合物 维甲酸合镍( i i ) 配合物、维甲酸合铜( i i ) 配合物与d n a 的相互作用。发现镍( i i ) 、 铜( i i ) 配合物在生理条件( p h 近中性，温度3 7 ) 下，能有效切割质粒p b r 3 2 2d n a ， 但铜( i i ) 配合物的切割活性远低于镍( i i ) 配合物。同时发现镍( i i ) 配合物切割活性 优于配体维甲酸、金属离子n r 以及上一章报道的维甲酸合钇( 1 1 1 ) 。维甲酸合镍( i i ) 配合物对浓度依赖性很强，对时间依赖性并不是非常强，配合物可能是通过氧化机理切 割d n a ，但通过加入羟基自由基捕捉剂，镍( i i ) 配合物对d n a 切割活性几乎不受羟 基自由基的影响，由此可见，维甲酸合镍( i i ) 对d n a 的切割不是由羟基自由基引起的。 另外，改变切割体系的离子强度，p h ，发现d n a 的切割对离子强度表现出很强的敏感 性，而维甲酸合镍( i i ) 配合物对d n a 的切割几乎不受p h 影响( p h = 6 9 ) 。 另外，以荧光法、粘度法和电化学方法研究了全反式维甲酸合铜( i i ) 配合物与d n a 的作用。结果表明，它与e b 存在激烈的竞争反应，使e b d n a 体系的荧光强度降低。 i 。对铜( i i ) 配合物和铜( i i ) 配合物d n a 的荧光猝灭作用符合s t e r n v o l m o r 方程，并得 到相应的猝灭常数分别为k s v = 1 1 8 l t o o l 和k s v = 7 。5 l t o o l ，说明在d n a 存在下i 对 铜( 1 i ) 配合物的猝灭减弱。d n a 加入前后铜( i i ) 配合物峰电流和电位的变化以及使 d n a 粘度的增大，证明了该配合物与d n a 是以嵌入方式结合。 3 桑色素合钴配合物与d n a 的作用 本章采用光谱法、粘度法和电化学方法考察了桑色素合钻配合物和d n a 的作用。 并与文献报道的桑色素合铜( i i ) 、桑色素合锌( i i ) 与d n a 的作用方式进行了比较。发 现桑色素合钴( i i ) 与d n a 作用时的荧光光谱性质类似于铜( i i ) 、锌( i i ) 配合物，但 电有许多差异。钴( i i ) 配合物对e b d n a 复合物荧光光谱的影响很小，而铜( i i ) 、锌 ( i i ) 配合物对e b d n a 复合物荧光光谱的影响较大。钴( i i ) 配合物与d n a 的结合常 数为2 o 1 0 3m o 低于e b 与d n a 的结合常数和桑色素合锌( i i ) 、铜( i i ) 与d n a 的结 合常数。钴( i i ) 配合物的电化学行为与铜( i i ) 配合物相似，在d n a 存在时配合物的 峰电流下降，而峰位不变，不同于锌配合物，d n a 的加入不仅引起桑色素合锌( i i ) 配 合物峰电流的下降而且使其峰位明显正移。钴( 1 1 ) 配合物使得d n a 的粘度有所增加。 这些都说明钴( i i ) 配合物与d n a 的作用弱于锌( i i ) 配合物，分子可能嵌入较浅，作 用较弱，这可能是相同配体的锌( i i ) 配合物在某种条件下抗肿瘤活性高于钴( i i ) 配合 物的原因。 关键词；金属配合物，d n a ，桑色素，全反式维甲酸 a 。b s t r a c t t h en a t u r em a dd y n a m i c so fb i n d i n gs m a l lm o l e c u l e st ob i o p o l y m e r sr e p r e s e n t sa n a r e ao f a c t i v ei n v e s t i g a t i o n s t u d i e sd i r e c t e dt o w a r dt h ed e s i g no fs i t e - a n dc o n f o r m a t i o n s p e c i f i c r e a g e n t sp r o v i d e dr o u t e st o w a r dr a t i o n a ld r u gd e s i g na sw e l la sam e a n s t od e v e l o ps e n s i t i v e c h e m i c a lp r o b e so f p o l y m e rs t r u c t u r e d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d ( d n a ) i s ak i n do f k e yb i o l o g i c l a r g em o l e c u l e ，i tp l a y sv e r yi m p o r t a n tr o l e i nl i f eg e n e t i cc o d e i n t e r p r e t a t i o n ，t r a n s c r i p t i o n a n dc o p y ，i ti st h ep r i m a r yt a r g e tm o t e c u l ef o rm o s to fa n t i c a n c m a n da n t i v i r a lt h e r a p i e s a c c o r d i n gt ot h ec e l lb i o l o g y t h ei n v e s t i g a t i o no f i n t e r a c t i o no fd n aw i t ho t h e rm o l e c u l e si s o f g r e a ti m p o r t a n c ei ne l u c i d a t i n g t h es t r u c t u r eo fd n aa n dt h e i rf u n c t i o n s i ti sa l s oh e l p f u lt o u n d e r s t a n ds o m ed i s e a s e sa n dt h em e c h a n i s mb yw h i c hs o m em e d i c i n e s ( e s p e c i a l l ya n t i t u m o r d r u g s la c t i nt h i st h e s i st h er e s u l t so fi n t e r a c t i o no fs o m ea n t i t a m o rc o m p o u n d s 谢t hd n a w e r er e p o r t e d t h i st t l e s i sc o n s i s t so f t h r e es e c t i o n sa sf o l l o w s ： f i r s t ，f l u o r e s c e n c es p e c t r a l ，a g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i s ，v i s c o m e t r i ca n dc d ( c i r c u l a r d i c h r o i s m ) w e r eu s e dt os t u d yt h ei n t e r a c t i o no f t h ea n t i t u m o rc o m p o u n d sy ( r a ) 2 a c 8 h 2 0 a n d s m ( r a ) 2 a c 4 h 2 0 ( r a = r e t i n o i ca c i d ，) w i t h d n a t h er e s u l t si n d i c a t et h a tt h e y ( r a ) 2 a c 8 h 2 0c a nm o r ee f f e c t i v e l yp r o m o t et h ec l e a v a g eo fp l a s m i dd n a t h a na l l - t r a n s r e t i n o i ca c i da tp h y s i o l o g i c a lp ha n dt e m p e r a t u r e ，w h i c hm a yb et h eo n eo fr e a s o n sw h yt h e i n h i b i t o r ye f f e c to fy ( r a ) 2 a c 8 h 2 0o nh u m a n b l a d d e rl i n ee jc e l l si sm u c h g r e a t e rt h a nt h a t o fr e t i n o i ca c i d w ei n c r e a s e di o n i cs t r e n g t ha n dc h a n g e d p h o fr e a c t i o ns y s t e m sa n da d d e d r a d i c a l s c a v e n g e r sa n df o u n dt h a t t h ep r o c e s so fp l a s m i dd n a c l e a v a g ei s s e n s i t i v et o i n c r e a s i n gi o n i cs t r e n g t ha n dc h a n g i n gp h ，a n dt h e s er a d i c a ls c a v e n g e r sa l m o s td oa n ye f f e c t o nt h ed n a c l e a v a g e r e a c t i o n t h ea b o v er e s u l t s s u g g e s tt h a tt h ec l e a v a g eo fd n ab y y ( r a ) 2 a c 8 h 2 0w a s n o t p r o d u c e d d i f f u s i b l eh y d r o x y lr a d i c a l sv i a t h ef e n t o nr e a c t i o n o nt h es i d e w ei n v e s t i g a t e dt h ei n t e r a c t i o no f y ( r a ) 2 a c 8 h 2 0a n ds m ( r a ) 2 a c 4 h 2 0 w i t hc a l f t h y m u sd n ab ym e a n so ff l u o r e s c e n c es p e c t r o s c o p y , v i s c o m e t r i ca n dc d ( c i r c u l a r d i c h r o i s m ) t h er e s u l t ss h o w t h a tt h ee m i s s i o ns p e c t r a li n t e n s i t yi sd e c r e a s e da n d t h ev i s c o s i t v o fd n ai si n c r e a s e db ya d d i n gt h et o wc o m p l e x e s ，i n c r e a s i n gf l u o r e s c e n c ei s s e e nf o rt h e c o m p l e x w i t hd n a a d d i t i o n t h ed e n a t u r e dt e m p e r a t u r eo fd n a i si n c r e a s e da n dt h en e g a t i v e s p e c t r ao f t h ec do fd n a i sc h a n g e db ya d d i n gy ( r a ) 2 a c 。8 h 2 0 t h ea b o v er e s u l t ss u g g e s t t h a tt h et o wc o m p l e x e sc a nb i n dt od n a m a i n l yb yi n t e r c a l a t i o n ，w h i c hm a y b et h eo t h e r r e a s o nt h a tt h ec o m p l e xc a ni n h i b i tt h eh l 一6 0 、e jc a n c e rc e l l s e c o n d ，t h e i n t e r a c t i o n so ft h e c u ( i i ) ，n i ( i i ) c o m p l e x e s w i t ha l l - t r a n sr e t i n o i ca c i d ( c u ( r a ) 23 h 2 0 ，n i ( r a ) 2 3 h 2 0 ) b e t w e e n d n ah a v eb e e ns t u d i e d u s i n ga g a r o s eg e l e l e c t r o p h o r e s i s w ef i r s t l y f o u n dt h e n i ( r a ) 2 3 h 2 0 a n d c u ( r a ) 2 3 h 2 0c o m p l e x e s c a l l p r o m o t e t h e c l e a v a g e o f p l a s m i d d n aa t p h y s i o l o g i c a lp h a n d t e m p e r a t u r e t h e n i ( r a ) 2 3 h 2 0c o m p l e xc a nm o r ee f f e c t i v e l yp r o m o t et h ec l e a v a g eo fp l a s m i dd n a t h a n c u ( r a ) 2 3 h 2 0c o m p l e x ，y ( r a ) 2 a c 8 h 2 0c o m p l e x ，a l l i r a n sr e t i n o i ca c i da n dn i ”，a tt h e s a m ec o n d i t i o n s ，a n dt h ee f f i c i e n c yo fd n a c l e a v a g eb yn i ( r a ) 2 3 h 2 0c o m p l e xw a sr a t h e r h i g ha n d t h er e a c t i o nt i m ew a s v e r ys h o r t ，w h i c hm a y b et h eo n eo fr e a s o n s w h y t h ei n h i b i t o r y e f f e c to f n i ( r a ) 2 。3 h 2 0o nh u m a nb l a d d e rl i n ee jc e l l si sm u c hg r e a t e rt h a nt h a to fr e t i n o i c a c i d o t h e r w i s e ，w ei n c r e a s e di o n i cs t r e n g t ha n dc h a n g e dp ho fr e a c t i o ns y s t e m sa n da d d e d r a d i c a l s c a v e n g e r s a n df o u n dt h a tt h ep r o c e s so fp l a s m i dd n a c l e a v a g e i ss e n s i t i v et o i n c r e a s i n gi o n i cs t r e n g t hb u tt h ep h h a v ea l m o s tn o te f f e c to nt h ec l e a v a g eo f d n a ，a n d t h e s e r a d i c a l s c a v e n g e r sa l m o s tn oa n ye f f e c to nt h ed n ac l e a v a g er e a c t i o n t h ea b o v er e s u l t s s u g g e s tt h a tt h ec l e a v a g eo fd n ab yn i ( r a ) 2 3 h 2 0w a sn o tp r o d u c e dd i f f u s i b l eh y d r o x y l r a d i c a l sv i at h ef e n t o nr e a c t i o n i na d d i t i o n ，w eu s e dt o s t u d yt h ei n t e r a c t i o n so ft h ec u ( r a h 3 h 2 0c o m p l e xb e t w e e n d n a b yf l u o r e s c e n c es p e c t r a l ，v i s c o s i t ym e a s u r e m e n t sa n de l e c t r o c h e m i c a lm e t h o d s t h e r e s u l t si n d i c a t et h a tt h ee m i s s i o ni n t e n s i t yw a sq u e n c h e da sc u ( r a ) 2 3 h 2 0w a sa d d st ot h e e b - d n as y s t e m t h ev i s c o s i t yo fd n a i si n c r e a s e db ya d d i n gc u ( r a h 3 h 2 0 q u e n c h e d f l u o r e s c e n c ef o rc u ( r a h 3 h 2 0c o m p l e xw h e ni a d d e d b u ti nt h e p r e s e n c eo fd n a t h e e f f e c to fi o nf l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yb e c o m e ss m a l l e rt h a nt h a to f c u ( r a ) 2 - 3 h 2 0c o m p l e xi n t h ea b s e n c eo fd n a t h ea d d i t i o no f d n a ( d n a c o = 2 0 ) c a u s e st h ec u r l - e n to fa n o d i c p e a kt od e c r e a s ea n dt oh a r d l y , t h i r d ，a b s o r p t i o na n de m i s s i o ns p e c t r a ，v i s c o m e t r i ca n de l e c t r o c h e m i c a ls t u d i e s h a v e b e e nc a r r i e do u to nt h ei n t e r a c t i o no fc oc o m p l e x ( c o l 2 3 h 2 0 ，l2 m o r i n ) w i t hc a l ft h y m u s d n a ，i nt h ep r e s e n c eo fd n a ，t h ec o m p l e xe x h i b i t sa h y p o c h r o m i s mi nt h e “u v i s s p e c t r a a n dal a r g ee n h a n c e m e n ti ne m i s s i o ns p e c t r as u g g e s t st h a tt h ec o m p l e xb i n d st od n av i aa w e a k p a r t i a l i n t e r c a l a t i o n ，r e v e a l e d b yc o m p e t i t i v e e x p e r i m e n t s ，v i s c o s i t y a n d b y e l e c t r o c h e m i c a ls t u d i e s t h eb i n d i n gc o n s t a n ti s2 o 1 0 3m a t2 0 。c b o t hz n l 2 3 h 2 0a n d c o l 2 3 h 2 0c o m p l e x e sh a v et h es a m em o l e c u l a rs t r u c t u r e ，z n l 2 3 h 2 0s h o w st h es p e c t r a l c h a r a c t e r i s t i c sa n de l e c t r o c h e m i c a lb e h a v i o r sw h i c ha g r e e sw i t ho b s e r v a t i o n sf o ro t h e ri nt h e p r e s e n c ea n da b s e n c e o fd n a ，w h e r e a st h ec o l 2 3 h 2 0c o m p l e xs h o w sf ll i t t l ed i f f e r e n t s p e c t r a lc h a r a c t e r i s t i c sa n de l e c t r o c h e m i c a lb e h a v i o u rt ot h a to fz n l 2 3 h 2 0 ，w h i c hs u g g e s t s t h a tt h e r ei sal i t t l ed i f f e r e n c eo ft 1 1 ei n t e r a e t i o nb e t w e e nd n aa n dt h e s et w oa n t i m e r s t h e a f f i n i t yo f t h ec o m p l e xc o l 2 3 h 2 0i sw e a kt h a nt h a to f z n l 2 ，3 h 2 0 ，w h i c hm a y b et h eo n eo f r e a s o n s w h yb o t hz n l 2 3 h 2 0 a n dc o l z 3 h 2 0c o m p l e x e se x h i b i t e dd i f f e r e n ta n t i t u m o u r a c t i v i t y k e y w o r d s ：m e t a lc o m p l e x ，d n a ，m o r i n ，a l l - t r a n sr e t i n o i ca c i d i 塑l 萋壁鳖塑童i 丝錾l 鍪i 鍪i 鎏薹鍪鲨鐾鏖i 燮鳖i 鋈塑鎏薹鋈! 鐾- i ! 萋丝篓i 塑幽塑塑 第一章绪论 1 1 引言 众所周知，核酸是生物体重要的遗传物质、遗传信息的携带者和基因表达的物质基 础，它在生物的生长、发育和繁殖等活动中起着十分重要的作用。许多小分子能与核酸 发生相互作用，破坏其模板作用，使核酸链断裂，进而影响基因调控和表达功能。小分 子不仅可以作为生物探针，还可以核酸为靶目标作为抗肿瘤药物的母体，某些小分子与 核酸的加合物还是癌变的预警标示物。测定小分子与核酸相互作用的亲和力及键合选择 性有利于阐明小分子与核酸的选择键合作用以及理解其键合机理，进一步探讨小分子的 结构与核酸作用模式及其生物活性之间的关系，能够使人们从分子水平上理解某些疾病 的发病机理，并通过分子设计来寻找有效的治疗药物，对阐明抗肿瘤抗病毒药物的作用 机理、药物体外筛选、致癌物的致癌机理的研究都有非常重要的意义。 核酸主要分为脱氧核糖核酸( d n a ) 和核糖核酸( r n a ) 。人们研究小分子与核酸 相互作用时，对双螺旋d n a 、r n a 、寡核苷酸、三螺旋d n a 和单链d n a 均有研究。 其中d n a 靶向化合物是很重要的药物选择对象，临床上使用的许多抗癌药物都以d n a 作为主要靶点，通过与癌细胞d n a 发生相互作用破坏其结构，进而影响基因调控和表 达功能，表现出抗癌活性。一些抗病毒药物，如：治疗爱滋病的药物是以d n a 作为靶 目标的分子，此外一些致癌物也能与d n a 形成加合物，这种加合物也可能是癌变的预 警标志物。因此有关小分子与d n a 相互作用的研究，一直受到人们的关注。 1 - 2d n a 的组成与结构特点 自f m i e s h e r 从脓细胞和鲑鱼精子中提取出人类历史上第一个核酸制品一核素 ( n u c m n ) ，r a l t m a r m 提取出不含蛋白质的同类物质，并首次使用了“核酸”这一名称以来， 人类对于核酸的研究取得了一系列令人瞩目的成就 1 】。1 9 2 8 1 9 4 4 年期间g r i f f i t h ， d a w s o n 2 和q s w a l da v e r y 3 等证明了d n a 是遗传物质的基础，第一次向人们展示了 d n a 的生理功能。1 9 5 3 年，两个年轻的科学家w a t s o n c r i c k 发现了生命的奥秘d n a 的双螺旋结构，从分子水平上阐述了生命遗传信息，迈过了d n a 的半保留复制机理， 为现代分子生物学的发展奠定了基础，从此生物学进入了分子生物学的新时代。 1 9 7 5 年b e r g 建立了d n a 体外重组技术基因工程，使核酸的研究取得了突飞猛 进的发展，并逐步开始转向实际应用。所有这些划时代的发现，无不改变着人类的生活， 成为人类探索生命奥秘，创造巨大财富的有力武器。同时，有关生命遗传物质d n a 的 研究也就成为分子生物学和生物化学的重要课题。2 0 0 1 年2 月1 2 日，美、英、日、法、 西北师范大学化学4 匕：r - 学院专业：无机化学 薹夔燮壅鼗篷墼釜兰羔鎏遂釜薹薹鍪釜茎薹篓釜兰釜_ _ _ _ _ 釜茎：釜塑丝壅整鎏塑燮遵 德和中国科学家宣布共同绘制完成了人类基因组序列图。这是继发现d n a 结构之后生 命科学领域的又里程碑，标志着人类基因组时代的正式来临。 d n a 是由大量脱氧核苷酸组成的、极长的大分子，其中戊糖和磷酸基起结构作用， 而碱基则携带遗传信息。d n a 含有四种碱基，其中两种为嘌呤碱，即腺嘌呤( a ) 和鸟 嘌呤( g ) ，两种嘧啶碱是胸腺嘧啶( t ) 和胞嘧啶( c ) 。 胞嘧啶 o o o 鸟瞟呤腺嘌呤 d n a 存在a 型、b 型、z 型三种空间构型，d n a 结构是由两条反向平行的脱氧多 核苷酸链形成，其两条链之间的螺旋呈现两种凹形，其中条沟区较浅而另一条较深分 别称之为小沟、大沟。四种疏水性的碱基位于螺旋的内侧，带负电荷的、亲水性的磷酸 基与脱氧核糖单位处于外侧。d n a 结构的稳定性主要来源于三种力：一是互补碱基对之 间的氢键；二是碱基堆积力，由芳香碱基上的一电子之间的相互作用产生，是比较主要 的力；第三种力来自磷酸基上的负电荷与介质中的阳离子之间的静电作用力。 。寻9 ” 扎j 蚓 。一口，o 。”h j 料 。一p ，p 。“h j 捌 。一p 胪“ j 斟 d n a 一级结构上的一个小片段 1 3d n a 与其靶分子的作用方式 小分子与核酸结合的部位是核酸的碱基、 d n a 的双螺旋结构 磷酸骨架和戊糖环。核酸山平行堆积的碱 西北师范大学化学化工学院专业：无机化学 2 0 洲 。z工 桃 = i o 腺 k 胸 ：立壁耋燮i 篓! 瞳薹鲞i 簦重塑薹萋塑篓i l 鎏i 薹童塞| | | | | | 夔! 鏊薹鎏鎏鳖巡篓塑塑堕垂i 壁鎏 基、聚合的阴离子磷酸骨架以及两条核苷酸链形成的大沟、小沟组成小分子识别位点。 作用方式大致可分为三种：非共价结合、共价结合和剪切作用。近期研究表明，小分子 与d n a 相互作用形式还有“半嵌插结合”( h a l fi n t e r c a l a t i o n ) ，由于超分子化学的发展，分 子与核酸还涉及到长组装( 1 0 n gr a n ga s s e m b l y ) 。 1 3 1 非共价结合 非共价键最主要的是氢键、离子键、范德华 力和疏水作用等。虽然这些均属于弱作用键，但 在分子水平的生命现象中上述弱的作用键作用却 是一种决定性的因素，形成了核酸生物功能所需 要的空间结构。当然这种结合的程度和方式与具 体的环境条件有关。其主要包括三种不同的方式 即：静电作用、沟区结合和嵌插结合。d n a 与小分子作用的三种模式 1 3 l 1 静电结合( e l e c t r o s t a t i cb i n d i n g ) ，即分子通过非特异性的相互作用结合于带负电 荷的d n a 双螺旋外部。一般认为，静电结合没有选择性，作用于磷酸骨架 4 ，在药物 的应用上价值不大。但也并非如此，例如，t m p y p 金属卧琳带正电的侧链与d n a 磷酸 酯骨架问的静电作用对它能嵌入结合在g c 碱基之间起了必不可少的稳定作用，文献 5 认为，核酸分子表面有静电力形成的水化层中水分子排列与碱基有关。 1 3 。1 + 2 沟内结合( g r o o v eb i n d i n g ) ，即小分子与核酸的大沟或小沟的碱基对边缘直接作 用。通常非稠合的芳环体系能通过一定的旋转后结合在小沟中a t 富集区。近年发展起 来的反意寡聚核昔酸能按严格的碱基配对原则在双螺旋的核酸的沟中形成局部的三螺旋 结构，可以精确的识别核酸的特异性序列。因此如已知靶分子的核苷酸序列，有可能根 据寡聚核：旨酸的碱基序列直接写下抑制物的化学结构，这点有利于药物分子的合成。 1 3 1 3 嵌插结合( i n t e r c a l a t i v eb i n d i n g ) ，即碱基对之间嵌入平面的或几乎平面的芳香环系 统，这是芳环与碱基间的月m 体系、偶极偶极相互作用及疏水作用的结果，是药物分子 与d n a 发生作用的最重要的形式之一。当d n a 靶向分子嵌入d n a 碱基之间后，有的 可以直接抑制d n a 的复制、转录的功能；有的则经过进一步活化后，使d n a 断裂受损 进而影响其功能。 影响药物嵌插方式的因素最具影响的理论是两极互补理论 6 】。具体而言，其存在以 下影响因素 7 ： ( 1 ) d n a 的结构不同构型的d n a 与同一化合物作用时其键合方式可能会有所 不同。 西北师范大学化学化工学院专业：无机化学 一勰 # h 肼 ， ， 足蓄 ：立i 墅塑鐾l 鐾登! ! ! i 速童羹i 耋童i 兰鎏i 鐾鋈鳌! 薹墨主! i 薹鎏釜主羔薹薹i 銎煎! 璧叁塑萋! 羹蓬塑! 薹! 塑： ( 2 ) 化合物的形状化合物的形状与d n a 的匹配程度决定了药物与d n a 的作用 方式。采取刚柔结合的设计思路，即有嵌入d n a 碱基对之问的刚性平面为插入点，又 有与d n a 特异结合的柔性侧链作为导向连接结构，且末端具有能断裂d n a 的生物活性 部位的不同系列化合物，有利于限插作用。 ( 3 ) 插入基团化合物以嵌插方式与d n a 结合要求药物的插入基团要有较好的平 面性、适中的平面面积和疏水性。药物的插入配体的平面面积与插入强度成正比，但当 增大的面积与插入基团不在同一平面内而使空间位阻增大时，药物与d n a 的作用反而 会减弱。当插入基团相同，适当增加辅助支链的疏水作用，也可增强药物与d n a 的结 合 8 9 】。 ( 4 ) 取代基的差异当药物嵌入d n a 时，取代基空间位阻过大就会减弱这种作用。 虽然大的取代基不利于嵌入剂与d n a 相互作用的动力学因素但却有利于其与d n a 碱基 之问的堆积作用。一些非融合型链状芳环系统的嵌入剂分子的末端带有正电荷而与d n a 之间也有嵌入作用，这很象小分子与d n a 沟槽结合的模式。同一取代基，据不同的位 置时，生物活性不一样，而且取代基不同，药物的生物活性也会发生很大的变化。但是 与未取代的化合物相比，无论是亲电子基团还是斥电子基团的取代都会增强小分子与 d n a 的结合强度。 1 3 2 共价结合 共价结合包括与亲核试剂的作用和与亲电试剂的反应。主要表现为d n a 的烷基化 及d n a 的链间交联和链内交联等，与非共价结合相比，d n a 靶向分子与d n a 共价结 合的序列特异性识别能力要强的多。小分子与特定碱基作用并形成加合物，使d n a 双 链解旋并产生弯曲。如顺铂中的p t 原子能够与d n a 小沟中同一条链上相邻鸟嘌呤 d ( g p g ) 1 的n 7 共价结合形成链内加合物，使d n a 双链解旋并产生弯曲。 1 3 3 d n a 断裂 d n a 修复、转录和突变是很重要的一个生物学过程。具有剪切作用的分子断裂d n a 的位点是由其与d n a 结合的选择性决定的。 b l m ( 博莱霉素) 是一种典型的d n a 切割化合物，其分子结构的特殊性使其能够 识别并结合在d n a 中5 - g c 37 序列的鸟嘌呤上，然后经一系列化学反应最终导致d n a 断链。这种双功能性对于设计人工核酸酶和发展有效的抗肿瘤药物都有非常重要的指导 意义。事实上，大量研究已根据这一原理把对d n a 具有剪切功能的分子与能对d n a 序 列进行特异性识别的分子接连起来，以台成序列特异性更高的人工核酸酶或抗肿瘤药物。 1 4 研究方法 西北师范大学化学化工学院专业：无机化学 4 耋i 塑盥蓬釜鎏童篷鏊塞鎏塑墓鍪蒌鋈錾! 鐾鋈蓬i 篓鎏i 鐾錾璧薹巡筮鳖塑萋塑塑茎丝塑 为探讨d n a 与其靶向分子问的相互作用与药物作用机理之间的联系，许多方法及 技术被引入此研究领域。 1 4 1 凝胶电泳 1 9 3 7 年，瑞典的t i s e l i u s 最早建立并使用电泳技术，成功地将血清蛋白分成血个主 要成份。目前，随着电泳技术的不断进步，它己成为生物化学、分子生物学和化学生物 学研究工作中不可缺少的工具，被广泛应用于生物大分子如蛋白质、酶、核酸的分离分 析和性质研究。在人工核酸切割试剂切割核酸的研究中，应用较为广泛的就是琼脂糖凝 胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳【1 0 。 1 电泳原理 在外电场的作用下，带电颗粒，如不处于等电状态的蛋白质分子，将向着与其相反 的电极移动，这种现象称为电泳( e l e c t r o p h o r c s i s ) 。生物大分子在一定的p h 条件下，可以 解离成带负电荷的离子，在电场中向正电极移动。在分子生物学领域，以琼脂糖为支特 介质的凝胶电泳是用于定量、分离、鉴定和纯化d n a 片段的主要方法，此法操作简便、 快速，一般用于分离l k b 以上的d n a 片段，也可分辨其它密度梯度离心等分离方法不 能分开的d n a 片段混合物。此外，可以直接确定凝胶中d n a 的位置。 2 影响电泳速度的因素 带电颗粒在电场中的泳动速度主要取决于它所带的净电荷量、颗粒的大小和形状a 当带电颗粒在电场中泳动时，受到两种方向相反的力的作用：电场力，摩擦力，而d n a 通过琼脂糖凝胶的电泳速率取决于以下4 个主要参数： 线状( o p ) 开环( o c ) 。 ( 4 ) 应用的电流在低电压时，线状d n a 片段的迁移速率与所用电压成正比。 但是当电场强度增加时，d n a 片段的迁移速率的增大是不同的。因此，琼脂糖凝胶的有 效分离范围随电压增大而减小。为了获得d n a 片段最大的分辨力，凝胶电泳不应超过5 伏厘米。 3 ，琼脂糖凝胶电泳的优点【1 1 】 西北师范大学化学化工学院专业：无机化学 二塑鲨鍪簦! 耋羹鎏j ! 薹鋈鎏夔鲨鲞鋈塑篓鳖逐篓鍪鲨塑鲨邈邈夔塑燮噬 ( 1 ) 区带均匀、整齐、分辨率高，重复性好。 ( 2 ) 透明而不吸收紫外线，可以直接用紫外检测仪作定量测定。 ( 3 ) 电泳速度快。 ( 4 ) 由于琼脂糖含液体量大，近似自由电泳，但样品的扩散速度比自由电泳小，对 于具体体系须选用合适的凝胶及电泳缓冲液体系。 电泳结束后，将凝胶在溴化乙锭溶液( 1 g m l ) 中染色3 0 分钟，此时溴化乙锭嵌 入到d n a 分子中，然后用3 0 0 n m 紫外光照射，溴化乙锭受激发后发出5 9 0 r i m 红色荧光， 这就可以直接检查d n a 片段，从而得知d n a 裂解情况。 凝胶电泳可以考察d n a 剪切或其它分子与双螺旋共价结合留下的永久性“痕迹”，研 究其它分子与d n a 作用的序列特异性；而对于多数与d n a 发生非共价结合的分子来说， 足印迹法及转录足印迹法是确定其结合位点的比较好的实验方法，其中转录阻断的方法 更易判断序列特异性较高的药物位点。 1 4 2 光谱法 1 4 2 1 紫外光谱法 d n a 与小分子相互作用的研究引起了人们的广泛兴趣，己有许多谱学技术被应用于 该领域的研究。由于核酸分子本身有光吸收活性，许多小分子与核酸结合后，对核酸或 小分子的吸收光谱都会引起变化。紫外可见吸收光谱法 1 2 一1 3 是研究小分子与核酸相互 作用机理的最常用、最方便的方法。含有碱基生色团的双螺旋结构d n a 分子，其u v 厂v i s 吸收光谱在2 6 0 n m 附近有一强的吸收峰，某些小分子如金属配合物亦有吸收谱带，可根 据相互作用前后d n a 或其它分子的吸收谱带的变化对二者相互作用模式进行判断。 i 对d n a 的吸收光谱来说，如导致分子的轴向变化即其构象变化，则产生减色效 应及红移现象，且作用越强减色效应越明显；如导致d n a 双螺旋结构的破坏，则产生 增色效应 1 4 】。 i i 对于金属配合物等小分子的特征吸收谱带。如该分子与d n a 发生