毕业论文--大豆拟茎点霉属的发酵培养及其代谢产物的活性鉴定.docx

目录第一章 前言1第1节 大豆拟茎点霉属的研究概况1第2节 分离纯化技术4第3节 结构分析技术5第4节 研究目的与意义、路线和方法6第二章 大豆拟茎点霉属的扩大与发酵培养9第1节 大豆拟茎点霉属的扩大培养9第2节 大豆拟茎点霉属的发酵培养9第三章 大豆拟茎点霉属代谢产物的提取纯化11第1节 代谢产物的分离11第2节 大豆拟茎点霉属代谢产物的萃取11第3节 提取物分离纯化12第五章 结构鉴定15第1节 实验材料15第2节 实验仪器15第3节 结构分析15结 论16讨 论17致 谢18参考文献1920中文摘要大豆拟茎点霉属是寄生于大豆体内的一类内生真菌，它可引起大豆多种病害，例如大豆种腐病，它影响了大豆正常的生长，导致大豆产率下降，引起严重的经济损失。但同时，大豆拟茎点霉属作为植物的一种内生真菌，可以与植物相互作用。它可分泌出抗生素、植物毒素等代谢产物，这些代谢产物在农业生产、医学医药方面起着重要的作用。目前，对于拟茎点霉属的研究多集中于研究其危害、致病机理与防治的方面上，在对代谢产物的研究很少。在已经发现的代谢产物中，大多数都具有抗菌抗肿瘤等生物活性。大豆拟茎点霉属作为同一科属，可能具有类似的生物活性。大豆是常见的农作物之一，容易提取出丰富的拟茎点霉属，并且研究的成本较低。本文是以天然产物化学的理论作为研究基础，主要使用微生物的发酵培养技术，分离纯化技术和结构分析鉴定技术，对大豆拟茎点霉属的代谢产物进行分析研究。将从大豆分离出的拟茎点霉属进行大规模发酵培养以得到足够的菌丝与菌液，在通过硅胶、凝胶、反向等色谱柱对菌丝菌液进行分离纯化，并使用质谱，核磁等设备对纯化后的产物进行结构鉴定和生物活性的研究。最终，通过分离纯化后得到一种化合物细胞环孢素A（cyclosporin A），查阅文献得到缓解移植手术后的排异功能的作用。关键词：大豆拟茎点霉属；代谢产物；发酵培养；生物活性AbstractPhomopsis longicolla is a class of endophytic fungi that is parasitic in soybeans. It can cause a variety of diseases such as soybean rot, which affects the normal growth of soybeans, resulting in a decline in soybean yield and a serious economy loss. But at the same time, the soybean stem is an endophytic fungus that can interact with the plant. It can secrete antibiotics, phytotoxin and other metabolites. These metabolites in agricultural production, medical medicine plays an important role. At present, the study of the Phomopsis longicolla is more focused on the harm research, pathogenesis and prevention, while few in the study of metabolites. Most of the metabolites that have been found have antibacterial and antineoplastic biological activities. As the same class, Phomopsis longicolla may have similar biological activities. Soybean, as one of the common crops, is easy to extract rich phytophthora, and the cost of research is low.In this paper, the theory of natural product chemistry is used as the research basis. The fermentation technology, separation and purification technology and structural analysis and identification techniques of microorganisms are used to analyze the metabolites of Phomopsis longicolla. A large-scale fermentation of the Phomopsis sp. from the soybean was carried out to obtain sufficient hyphae and bacteria solution. The mycelia were separated and purified by various chromatographs. The purified cells are purified by mass spectrometry. The product is identified for its structural identification and biological activity. Finally, after the separation and purification we get a compound cell cyclosporin A (cyclosporin A), and access to literature to alleviate the role of rejection after transplantation.Keywords: Phomopsis longicolla; metabolites; fermentation; biological activity第一章 前言第1节 大豆拟茎点霉属的研究概况拟茎点霉属是隶属于半知菌亚门（Deuteromycotina）、腔孢纲（Coelomycetes）、球壳孢目（Sphaeropsidales）、球壳孢科（Sphaeropsidaceae）的重要真菌，其有性态为间座壳属（Diaporthe）1。拟茎点霉属种类丰富，分布广泛，是重要的植物病原菌。大豆拟茎点霉属就是寄生于大豆中的一类拟茎点霉属，可以引起大豆种腐病，使大豆发生溃烂、叶枯、茎烂等多种症状。2-3但拟茎点霉属作为植物的一种内生真菌，产生的代谢产物可与植物中的一些列生理生化现象具有一定的相关性。在拟茎点霉属中，某些寄生在其他植物上的种具有药用价值和经济价值，如宋鑫明等人在红树尖瓣海莲的内生真菌Phomopsis longicolla HL-2232中，已经发现其某些代谢产物对癌细胞有抑制作用4。在拟茎点霉属中，还有部分种为非致病性植物内生真菌，这些繁多种类的真菌，其形态也各异，影响广泛，有重大的经济价值和研究价值，而且，目前对于该属的内生真菌代谢产物的研究很少，大多数研究的是其对植物的致病机制、分子生物学方面的研究，所以具有很大的研究价值。大豆拟茎点霉属已从大豆中分离出来，进行培养，通过发酵大量培养，可产生含量及种类较多的代谢产物，对这些产物进行分离纯化、结构鉴定，推测其可能的生物活性并进行活性鉴定。在此之前，已有不少人对该属的内生真菌研究过其生物活性，在一些要药用植物中，部分抗菌抗炎抗肿瘤等药用价值来源于拟茎点霉的代谢产物。在药用植物红树尖瓣海莲的内生真菌Phomopsis longicolla HL-2232中，宋鑫明等人通过活性追踪的方法，从一株药用红树尖瓣海莲的内生菌中分离其代谢产物，发现了10种化合物，分别是5个生物碱类化合物、1个色原酮类化合物和4个甾醇类化合物。通过对这些化合物进行细胞毒活性实验发现，这些代谢产物13具有一定的细胞毒活性，其中，化合物1对乳腺癌细胞有较高的阳性，化合物3对肺癌的抑制能力较强。再对这10种化合物进行7种供试致病菌(Micrococcus tetragenus, Escherichia coli, Staphylococcus albus, Bacillus cereus, Staphylococcusaureus, Micrococcus luteus, Bacillus subtilis)的抑制进行活性测试，发现除了化合物6对大肠杆菌（Escherichia coli）具有比较弱的抗菌活性，其他或何物在20g/mL的浓度均不显示抑制作用。5图1.1 化合物110的结构在青梅树皮中发现的内生菌株Phomopsis sp IFB-E060中提取分离除了一种新的细胞松弛素，SHEN Li等人通过硅胶、凝胶、反向和高效液相色谱的方法对IFB-E060固体培养物进行分离纯化出5中化合物，并鉴定出为18-甲氧基细胞松弛素J（1），细胞松弛素H（2），（22E，24S）-脑磷脂醇（3），麦角固醇（4）和烟酸（5）。6通过使用人癌细胞系SMMC-7721作为靶的MTT法在体外进行的细胞毒性试验证明，化合物1可以以10gm L-1抑制细胞生长24.4，细胞松弛素H（2）具有15.0gm L-1的IC 50值。作为阳性对照共同测定的5-氟尿嘧啶对10gm L-1的相同SMMC-7721细胞系具有28.7的抑制率。7-9图1.2 化合物15黄丽杰等人在拟茎点霉属S4菌株发酵产物对核盘菌有较强的抑制作用，能有效抑制其菌丝生长和菌核形成。10以拟南芥为材料，研究内生真菌拟茎点霉属（Phomopsis sp.）S4菌株发酵产物对植物抗病相关基因PDF1.2和PR-1表达水平的影响，并通过盆栽试验评估其对菌核病的防治作用，借助扫描电子显微镜观察S4菌株发酵产物对核盘菌侵染拟南芥的影响。11结果显示，S4菌株发酵产物可以诱导拟南芥抗病相关基因PDF1.2和PR-1持续增量表达。除了提高植株抗性，S4菌株发酵产物对菌核病有一定的防治效果，能致使核盘菌丝出现皱缩、塌陷等畸形现象，且预防效果明显优于治疗效果。提前喷洒S4菌株发酵产物能对核盘菌菌丝造成更大程度的损伤，在更大程度上阻碍其侵染进程. 本研究表明，拟茎点霉属S4菌株发酵产物能诱导被病菌侵染的植株产生更强的抗性反应，并且对菌核病有一定的防治效果。12-14这些研究成果都表示，在拟茎点霉属的代谢产物中，会产生某一种或几种化合物具有抗菌或抗肿瘤的药用作用。目前，对大豆拟茎点霉属主要研究方向是对其的致病性研究和防治方向，对其代谢产物的研究很少，而在其他植物中发现拟茎点霉属的代谢产物中，发现了具有抗菌抗肿瘤等生物活性，并且还具有细胞松弛素。第2节 分离纯化技术2.1 大孔吸附树脂柱色谱大孔吸附树脂是一种不含有交换基团并且具有大孔结构的一类高分子吸附树脂，它具有良好的大孔的网状结构和较大比表面积，这种结构可以使水溶液中的有机物有选择性地被物理吸附。它的吸附作用是依靠它与被吸附的分子间的范德华力，通过巨大的比表面积进行物理吸附，并使有机物可以通过一定的溶剂进行洗脱而达到分离纯化等不同的目的。它的吸附实质上是一种物体高度分散或表面分子手里不均等原因而产生的表面吸附的现象，这种性能是由于范德华力与生成的氢键的结果，同时树脂的多孔结构也具有筛选的作用。影响吸附的因素很多，主要是溶质的极性与分子大小、溶剂的溶度和Ph等。通常条件下性质稳定，不溶于水、碱、酸和有机溶剂，也不和它们发生化学反应。2.2硅胶柱色谱硅胶色谱是根据不同的物质在硅胶上的吸附力不同而使物质分离，在一般情况下，硅胶对极性较大的物质容易吸附，极性较弱的物质不易吸附，即整个过程是吸附到解除吸附、再吸附、再解除的过程。2.3凝胶柱色谱凝胶色谱是根据物质的分子大小不同而进行分离，又称分子筛过滤。它的优点是所使用的凝胶是多行载体，吸附能力小，不带电荷，使用的条件温和，不需要有机溶剂，对于高分子的物质有比较好的分离效果。实验所使用的是Sephadex LH-20，全程是羟丙基葡聚糖凝胶，是Sephadex G-25经过羟丙基化后得到的产物。分子较大的物质由于不能通过凝胶内部通道，会直接通过凝胶之间的缝隙首先被洗脱下来，而分子小的物质会不断穿过凝胶内部，路程较长，并且受到凝胶内部的阻力，因此洗脱下来的时间较长。Sephadex LH-20价格较高，但适合用有机溶剂去分离嗜脂性的分子，可非常经济地大规模纸杯天然产物，并且极少需要再生，可多次反复使用。2.4反相色谱根据流动相和固定相的相对极性，液相色谱可分为正相色谱和反相色谱，当流动相的极性大于固定相时，称为反相色谱。反相色谱柱效率高，分离分离较强，是液相色谱中使用最广泛的之一。2.5薄层色谱薄层色谱（TLC）是通过涂布在支持板上面的支持物作为固定相，以适合的溶剂作为流动相，对混合物进行分离的技术。它是利用不同成分对同一种吸附剂的吸附能力不同，在流动相流过固定相的过程中，通过连续的吸附、解吸、再一次吸附、再解吸，从而达到了分离的目的。实验用薄层色谱是以硅胶作为固定相，其原理主要是吸附力与分配系数不同是混合物分离。当溶剂顺着固定相移动时，由于各组分在溶剂中的溶解度不一样，以及固定相对不同组分的吸附力不同，最终将混合物分离形成一系列的斑点。Rf是溶质移动的距离与溶液移动的移动的比例，表示了物质移动的相对距离。各种物质的Rf值随着不同的固定相、流动相、温度等条件的不同而不同，在同一条件下，每种化合物的Rf值是一个特定的值。展开后，通过显色来分辨出是否达到分离效果，主要方法有光学检出法、显色剂法、蒸汽显色法等。通过显色，不同物质颜色不同，通过颜色及其深浅达到定性定量的目的。第3节 结构分析技术3.1紫外光谱紫外光的波长范围为10-380nm，一般在10-200nm称作远紫外区，这种波长会被空气肿的氧、氮、二氧化碳及水所吸收，只能在真空中进行研究；在200-380nm为近紫外区，是一般的紫外吸收光谱区域；波长在400-750nm的为可见光谱，一般紫外吸收光谱将出现在光的紫外区和可见光区。紫外光谱的原理是分子中的电子跃迁，即从基态跃迁到激发态，当电子跃迁的能量足够小，就会落到近紫外-可见光区，此时就可通过紫外灯或者肉眼观察到。当分子中存在共轭键时，在紫外光下会发出荧光。3.2红外光谱红外光谱利用分子中价键的伸缩及弯曲振动在4000-625红外区域引起的吸收，而测得的吸收图谱。当一束含有连续波长的红外光通过物质的时候，物质的分子中某个基团的震动频率或者转动频率与红外光的频率一致时，分子就可以吸收能量，有基态震动能级跃迁到较高能量的震动能级，而该处的波长的光就被物质所吸收。实质上，红外光谱就是一种根据分子内部的原子间相对震动与分子转动等信息确定物质的分子结构与化合物的分析方法。3.3质谱法质谱法主要就是通过不同分子m/z（质量电荷比）的不同，通过电场（或电磁场）将他们区分开，对信号进行探测。使样品中各组分电离生成不同荷质比的离子，经加速电场的作用，形成了离子束，进入质量分析器，利用电场和磁场使之发生相反的速度色散离子束中速度较慢的离子通过电场后偏转大，速度快的偏转小；在磁场中离子发生角速度矢量相反的偏转，即速度慢的离子依然偏转大，速度快的偏转小；当两个场的偏转作用彼此补偿时，它们的轨道便相交于一点。与此同时，在磁场中还能发生质量的分离，这样就使具有同一质荷比而速度不同的离子聚焦在同一点上，不同质荷比的离子聚焦在不同的点上，将它们分别聚焦而得到质谱图，从而确定其质量。质谱法可以提供离子碎片和分子离子峰，得到化合物的分子量，从而求出分子结构式。3.4核磁共振波普核磁共振是利用强磁场的存在中，某些元素的原子核能量本身所具备的磁性将其分裂成两个或者两个以上的量子化能级。在吸收了合适的频率的电磁辐射下，可以在所产生的磁场下诱导能级间发生跃迁。因此，这种带有核磁性的分子院子在磁场中，核吸收从能量较低的基态想较高能级跃迁时两个能极差能量所产生出的共振谱，可以用来测定分子中某些原子的类型，数量及其相对位置。核磁波谱图主要是氢谱图和碳谱图，可以提供化合物中氢原子与碳原子的的类型、互相连接方式、数目、周围化学环境以及构象、构型等结构信息。第4节 研究目的与意义、路线和方法4.1 大豆拟茎点霉属的研究目的与意义植物内生菌是在植物的体内具有稳定的生存空间，它不容易受到外界环境的影响，可在植物的体内独立分裂繁殖，因此，成为了在生物防治中具有潜力的微生物农药。植物内生菌的种类多，寄生于不同宿主植物会产生不同代谢产物，同一植物的不同部位也会产生不同代谢产物，例如生物碱、甾体、萜类等，这些代谢产物通常具有抗菌、抗肿瘤、杀虫等生物学活性，这为新药的研制开辟新的方向。15代谢产物是微生物在代谢活动产生的，满足自身生长和繁殖所需要的化学物质，初级代谢产生的代谢产物基本种类相似，维持微生物正常的生命活动。16而通过次级代谢合成的次级代谢产物，往往具有较复杂的结构，且具有一定的生物活性，但对生物的生理生化活动无明显作用。因此，对次级代谢产物的研究成为植物产物研究的重点。大豆拟茎点霉属寄生于大豆内，可引发大豆茎枯病，引起严重病害，如幼苗坏死，植株的茎及茎与分枝连接部分退绿、干枯，并形成病斑，严重时还可引起大豆种腐病，一旦种子感染后，会使种子的活力降低、腐烂以致发芽率降低，17还会引起种子籽粒褪色，影响种子外观质量，除此之外，还会引起种子内营养质量下降，造成严重的经济损失。18-20某些细菌或真菌对植物或动物生长造成严重危害，通过使用在拟茎点霉属的代谢产物中提取出来的具有抑菌活性的产物，可抑制生物体内有害菌的生长，从而使生物可以健康生长。而具有抗肿瘤活性的化合物，是目前药物开发的一个重点。如果在大豆拟茎点霉属中发现具有抗肿瘤活性的化合物，可通过化学合成或转基因的手段大量生产，用于新药的合成开发。而且大豆成本较低，对于新药的开发具有经济价值。对于拟茎点霉属来说，前人主要研究其对寄主的发病机制，及如何防治有致病机制的拟茎点霉属，在代谢产物方向研究较少。通过对大豆拟茎点霉属的研究，可能发现新的化合物及具有药用价值或经济价值的化合物，可能其抗菌抗肿瘤的方面优于之前的所发现的化合物，可在前人的研究基础之上进行补充。大豆作为世界上主要的油料作物，来源广泛，在体内寄生的拟茎点霉属代谢产物如果具有药用价值和经济价值，可减少经济成本，大量生产，推动新药的发展。4.2研究路线和方法4.2.1实验路线：菌株活化菌株进行扩大培养菌株进行发酵培养分离纯化产物将纯化后的产物进行结构鉴定进行活性鉴定4.2.2实验方法：将菌株接种在扩大培养基中进行扩大培养；菌种扩大培养后在转至发酵培养基中进行发酵培养；培养完后的菌株将菌液与菌丝体进行分离；使用不同的色谱柱，用不同的有机溶剂进行分离纯化，对于菌丝体，在粉碎干燥后进行处理；使用质谱、核磁等技术对纯化后的化合物进行结构鉴定；使用纯化后得到的化合物通过查找相关文献确定其生物活性。第二章 大豆拟茎点霉属的扩大与发酵培养再给菌种进行发酵培养产出代谢产物前，需要将菌株进行扩大培养。只有产生足够多的菌种才能分装在更多的发酵培养基中进行发酵。扩大培养使用的培养基使用的葡萄糖蛋白胨液体培养基，可以提供真菌在对数生长期使所需的营养与能源。第1节 大豆拟茎点霉属的扩大培养1.1 实验仪器玻璃棒、500mL锥形瓶、电磁炉、超净工作台、电子天平（上海精密仪器有限公司）、漏斗、摇床、无菌通风橱（北京成威仪器有限公司）、高压蒸汽灭菌锅1.2 实验试剂水、葡萄糖、蛋白胨1.3 实验材料实验室所得到的一株大豆拟茎点霉属菌株1.4 培养基配制菌种培养基配方是1L水中加入15g葡萄糖与15g蛋白胨，加热溶解。溶解好的培养基分装在500mL锥形瓶中，每瓶加300mL培养基然后用培养基用封口膜封好，放入高压灭菌锅中灭菌，设定为121，20min。1.5 扩大培养在超净工作台里，用接种针挑取培养皿上的菌丝放入两瓶液体培养基中，封口。接种完的锥形瓶放在25、150r/min的摇床培养两天。等培养基中出现大量菌丝体后，再在无菌条件下分装在剩下的培养基中进行扩大培养，在25、150r/min的摇床中培养一周后就可以进行发酵培养。第2节 大豆拟茎点霉属的发酵培养2.1实验材料扩大培养后的大豆拟茎点霉属菌液2.2 实验仪器高压灭菌锅、电磁炉、ZHWY-211C恒温培养震荡器、超净工作台、锥形瓶、发酵瓶、天平3.3实验试剂葡萄糖、蛋白胨、酵母提取物、水、小米、玉米3.4 发酵培养实验采用液体与固体两种培养基，培养基配方为1L水中加入50g玉米、50g小米、5g葡萄糖、5g蛋白胨和5g酵母，加热煮沸10min左右。煮好后的培养基，用纱布过滤，每瓶发酵瓶大约装1.2L的液体，剩下的固体分装在锥形瓶内。用封口膜封口，放入高压灭菌锅内进行灭菌。培养基全部陪完后，在超净工作台中将扩大培养后的菌种分别倒入发酵罐与锥形瓶中。接种完后，静置在常温下等待菌种生长，1周后，再将发酵罐倾斜放置，发酵培养8个月。第三章 大豆拟茎点霉属代谢产物的提取纯化第1节 代谢产物的分离1.1前期处理将液体培养基中的发酵液用棉花进行过滤，使菌液与菌丝体分离，过滤重复3次，将固体与液体尽可能分离。固体培养基中用玻璃棒将里面的培养物掏出，和液体培养基分离出固体集中在一起，然后将其烘干。等水分都蒸干后，再用粉碎机粉碎，用工业乙醇浸泡半天，在将滤液与菌丝分离，再次浸泡，重复3次。1.2 发酵液分离1.2.1 大孔吸附树脂分离用棉花过滤后的滤液通过大孔吸附树脂，在此期间不断向柱子内补充滤液，保证柱子上部始终有滤液存在，不能使滤液流干。当滤液全部通过后，用蒸馏水洗脱，直到流出的水变得澄清，停止加水，此时滤液中的水溶物质已基本除去。停止加水后，当柱子上部的水流到接近大孔吸附树脂时，开始加入乙醇洗脱。当流出的液体开始有颜色后，收集洗脱液，在此期间不断添加乙醇，不能使柱子上部流干。当流出的乙醇变成澄清后，停止加乙醇。1.2.2 蒸发浓缩将用乙醇洗脱下来的洗脱液用旋转蒸发仪蒸发浓缩，直到乙醇全部蒸干，蒸发后的固体在用少量乙醇溶解后倒入干净的锥形瓶中，标记待用，乙醇回收。浸泡过菌丝的乙醇也用旋转蒸发仪蒸发浓缩，得到的固体用乙醇溶解后与液体的滤液得到的固体收集放在一起待用。第2节 大豆拟茎点霉属代谢产物的萃取2.1 实验材料、仪器与试剂2.1.1 实验材料：大豆拟茎点霉属发酵液提取物2.1.2 实验仪器：分液漏斗、玻璃棒、旋转蒸发仪、锥形瓶、真空泵2.1.3 实验试剂：乙酸乙酯、正丁醇、石油醚2.2 发酵液提取物的萃取将浓缩后的发酵液倒入分液漏斗，加入石油醚进行萃取，将分液漏斗用力震荡，然后将分液漏斗静置几分钟直至明显的分层现象，然后将石油醚相倒入一个锥形瓶，标记待用，萃取重复3次。再将石油醚萃取后的溶液使用乙酸乙酯进行萃取，把乙酸乙酯相收集放入锥形瓶中，重复3次。最后用正丁醇对乙酸乙酯萃取后的溶液进行萃取，收集正丁醇相，重复3次。2.3 萃取液浓缩蒸发将三瓶萃取液分别进行旋转蒸发，石油醚相标记为（C1），乙酸乙酯相标记为（C2），正丁醇相标记为（C3）。第3节 提取物分离纯化3.1实验材料、仪器与试剂3.1.1 实验材料：大豆拟茎点霉属发酵液萃取物3.1.2 实验仪器：Sephadex LH-20凝胶柱色谱、薄层色谱板、反相柱色谱、紫外检测灯、显色剂、ZF-6型三用紫外分析仪3.1.3 实验试剂：二氯乙烷、甲醇3.2 发酵液萃取分离纯化本实验主要采用柱色谱层析的分离纯化方法，对三个溶剂萃取后的溶质进行分离。将浓缩后的固体先分别都用少量丙酮溶解，再分别与适量100-200目的硅胶搅拌，混合均匀后加热，使溶解固体的丙酮挥发，保证硅胶完全干燥，这层硅胶作为硅胶色谱柱的样品层，三种萃取提取物分别进行上柱分离。硅胶色谱柱使用200-300目的硅胶进行干法装柱，使用量大约是样品的5倍。利用真空泵抽色谱柱进行压实，5分钟左右。在样品层上在覆盖一层较多于样品层的100-200目的硅胶。洗脱是使用二氯乙烷与甲醇作为洗脱剂，按照二氯乙烷：甲醇为二氯乙烷、100:1、50：1、25:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1、纯甲醇的顺序进行梯度洗脱。实验主要以乙酸乙酯部分为主要分离对象，将分离洗脱得到的溶液进行薄层色谱点样，最后得到3部分，分别标记为C2.1、C2.2、C2.3。将在薄层色谱上同一Rf值的溶液进行混合，然后使用Sephadex LH-20凝胶色谱将得到的三个部分再进行分别分离。3.3 C2.1部分将C2.1的样品收集后进行薄层色谱进行分离，通过凝胶色谱柱的流出液可分为3个部分，分别标记为C2.1.1、C2.1.2、C2.1.3。在分别对这三个部分的样品进行反复多次的凝胶色谱层析和反相色谱层析，但都没有得到比较纯的化合物或者得到的量很少，无法准确获得化合物信息，因此，放弃对其的研究。3.4 C2.2部分将C2.2的样品收集后进行薄层色谱进行分离，通过凝胶色谱后得到了4个部分，分别标记为C2.2.1、C2.2.2、C2.2.3、C2.2.4。对这四个部分进行反复多次的凝胶色谱层析和反相色谱层析，由于纯度不够而无法确定其分子式和分子结构，因而先暂停对这部分化合物结构的研究。3.5 C2.3部分将C2.2的样品收集后进行薄层色谱进行分离，通过凝胶色谱后得到了5个部分，分别标记为C2.3.1、C2.3.2、C2.3.3、C2.3.4、C2.3.5。对这五个样品进行反复多次的凝胶色谱与反相色谱后，在C2.3.4中得到了大量的高纯度化合物，标记为Sy-C4，在经过波普分析后可获得它的分子结构与分子量等信息，可成功地鉴定出该化合物。图4.1 提取物分离纯化流程图第五章 结构鉴定第1节 实验材料大豆拟茎点霉属分离纯化后得到的化合物第2节 实验仪器核磁共振仪、质谱仪第3节 结构分析对Sy-C4进行波谱分析，得到化合物Sy-C4是环孢素A(cyclosporine A)，分子量为1346，分子式C62H111N11O12。图5.1 Sy-C4分子结构式结 论Sy-C4鉴定后的分子结构如图，是细胞环孢素A（cyclosporin A），分子量1202，分子式C62H111N11O12，具有缓解心脏、肝和肾移植的排异反应，同肾上腺素一起使用还具有治疗免疫性疾病的功能。讨 论植物内生真菌种类繁多，作为多种天然产物的来源是主要来源之一。拟茎点霉属是具有很多不同种类的一类内生真菌，大豆拟茎点霉属主要寄生于大豆体内，可对大豆造成比较严重的伤害。目前对于拟茎点霉属的生物活性研究中，主要发现其代谢产物具有抗菌抗肿瘤等药用价值。本次试验中，在大豆拟茎点霉属的代谢产物中发现环孢素A是用于治疗肝脏、肾脏与心脏移植的抗排异反应，与肾上腺皮质激素一同使用，可用于治疗免疫性疾病。在实验过程中，也有许多难题，比如如何选择最佳培养基使菌种进行扩大培养与发酵培养，进行发酵过程中如何避免杂菌污染，分离过程中洗脱剂的种类与配比等问题。在试验中，有老师是实验室中师兄师姐的帮助下解决了不少，但还是有一些问题影响了实验的结果，部分化合物由于浓度和纯度的问题导致无法确定结构。在此次试验中，我学习到了微生物的扩大培养与发酵培养的操作方法，硅胶、凝胶、反向、薄层色谱等色谱柱的使用方法，学习到核磁共振氢谱图与质谱图的解读方法，熟悉天然产物提取分离与结构鉴定和活性研究的整个流程，学习到很多实验的技巧。致 谢这次的毕业论文是在指导教师张明哲老师悉心指导下所完成的，从设计的选题到完成，都是张老师给了我耐心的知道和细心的关怀，才使得我在试验中得以解决难题，完成实验。张老师严谨的治学精神与精益求精的工作作风以及严肃的科学态度，这些都是我所需要学习的。在这四年中，时光匆匆如流水般，吉林大学给了我良好的学习氛围，让我可以顺利的完成毕业实验，实验也少不了实验室老师、师兄师姐和同学们的帮助，在此，我要向实验中、学习中帮助过我的人表示衷心的感谢，谢谢你们这四年中对我的热情帮助。感谢张老师对我的辛勤栽培与孜孜不倦的教诲。四年来的学习中，所收获的不仅是更加专业的知识，而是在实验中、实践中培养的思维方式与表达能力。感谢吉林大学，感谢植物科学学院，感谢你们给我的细心的教导与栽培。参考文献1陆家云. 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