鼠肝星状细胞分离方法汇总.doc

1、 大鼠原代肝星状细胞的分离培养方法汇总：方法一雄性SD大鼠，体重400500g。操作步骤1.大鼠以戊巴比妥钠麻醉，同时皮下注射5000U肝素钠抗凝；2.皮肤常规消毒后打开腹腔，钝性分离门静脉及下腔静脉；3.以16号套管针作门静脉插管，37灌注D-Hanks液，10ml/min至肝脏充盈，剪开下腔静脉放血后结扎。立即打开胸腔，以16号套管针作上腔静脉插管，形成门静脉-上腔静脉循环；4.以0.1链霉蛋白酶E 5mL/min灌注3-4分钟，0.03型胶原酶5ml/min灌注3-4分钟；5取出肝脏，去肝包膜，用眼科剪剪碎。加入链霉蛋白酶E至终浓度为0.006、DNA酶至终浓度为10pug/ml。375C02孵箱内消化30分钟；6.过200目筛网，培养液洗4次，将细胞铺于制备好梯度的细胞分离管中，对照管中加入等量培养液;7.4 800g平抛离心30分钟。吸取1.040密度层的上层细胞，培养液洗2次；8.加入五血清RPMll640培养液，于375C02孵箱孵育15分钟：吸取细胞悬液，在6孔板中以含20胎牛血清的RPMl1640培养。24小时后换液，此后每3天换液1次。方法二：动物雄性纯种Wistar大鼠，体重400-500g，普通饲料喂养。操作步骤1.大鼠用戊巴比妥钠麻醉，无菌操作下打开腹腔；2.经门静脉肝素化，取出肝脏，灌流液灌注10-20分钟(37)，至肝细胞略显黄色；3.链霉蛋白酶E溶液(0.02)反复灌注10-20分钟(4041)，胶原酶溶液反复灌注10-15分钟(404l)，至肝组织完全软化；4.两液合于器皿中，钝性撕碎肝组织，置三角烧瓶内37C下振荡消化20分钟，三层纱布过滤；5.无钙培养液洗2次，将细胞悬液加至三层非连续密度梯度最上层(从下至上为1.080、1.058、1.053)，再在上面加一层无钙培养液，16000rmin离心30分钟(20)；6.轻轻吸取上层培养基与1.053层之间的细胞，细胞经无钙培养液洗2次后，调成(1-5)XlO5/ml浓度，接种于50ml培养瓶(内含20小牛血清的RPMl1640培养液)；7.培养28h后换含新鲜10小牛血清的RPMl1640培养液，以后每隔34天换液1次。试剂：胶原4、DNase1、DMED、胎牛血清、Percoll、链酶蛋白酶2、 分离当日氯胺酮0.2ml/100ml体重、甘肃150U肌肉注射麻醉3、 严格消毒，置于无菌超净台，仰卧位固定4、 取大十字切口，上至剑突，下至耻骨联合，左右至两侧腋中线，皮瓣外翻，显露腹腔所有脏器。5、 将小肠翻至鼠体左侧，可见肝门出门静脉由脾静脉和肠系膜静脉汇合而成，在双侧肾静脉上方游离肝下腔静脉。6、 肝上游离肝膈面，下压肝脏剪短镰状韧带至肝上下腔静脉。7、 将9号输液针插入肝门静脉，动脉夹固定，转动灌流泵。同时迅速钳夹肝上下腔静脉，剪开事先游离好的肾静脉肝下腔静脉，开始原位灌注。8、 首先使用加葡萄糖1g/L、甘肃500U/L的D-Hanks也200ml，经水浴加热到39，流苏20ml/min，尽量将肝脏内淤积的红细胞冲出，9、 使用酶灌注液0.05mol/L Ca2+、0.05%胶原4、D-Hanks液100ml，流速5ml/min，消化肝脏。10、 20min后使用无菌剪刀将肝组织剪下放入洁净的培养皿，进入细胞室。11、 在培养皿中去除肝包膜，将肝脏粉碎成糊状，放入0.05%胶原4、0.001%DNase1和5.3%FCS-HI的PBS中，37水浴摇动30min，使肝组织充分得到消化12、 将消化好的肝组织用200目筛网过滤，未通过的肝组织用玻璃注射器针芯研磨，与培养液冲洗。13、 滤过好的肝组织放入50mlFalcon离心管中，加入培养液只50ml，20100g离心5min，去除大部分肝实质细胞14、 上清液转入另一离心管中350g离心10min15、 去沉淀重悬于50ml培养液中，再次350g离心10min16、 沉淀重悬于16ml的PBS中，分两份分别加入已铺好梯度的Percoll顶层17、 Percoll的密度梯度分3层：由上至下依次为：20% 1.012g/ml 20ml35% 1.014g/ml 15ml50% 1.018g/ml 10ml18、 铺好后4900g离心30min，轻轻取出，不要摇动液面，可见20%层中间有一混浊带19、 用16号针头插入液面下此处抽吸约10ml放入离心管20、 及培养液至50ml，900g离心10min，沉淀重悬于10ml混合培养液中，加胎牛血清21、 细胞计数，台酚蓝判断活力液体配制：1、 预灌注液：葡萄糖1g/L、HEPES2.38g/L的D-Hanks，pH7.2-7.4，过滤除菌2、 链酶蛋白酶（现用现配）：链酶蛋白酶50mg，D-Hank50ml3、 胶原酶（现用现配）：胶原酶12.5mg，D-Hank50ml4、 震荡液（现用现配）：链酶蛋白酶40mg，D-Hank50ml5、 Nycodenze液：10.387%和18.8%两种浓度分离方法1、 灌注：乙醚麻醉，碘伏消毒大鼠腹部，U形打开腹腔暴露肝脏，门静脉插管，预灌注液39灌注20ml/min至肝脏完全变白，输液管前段一1ml肝素稀释液代替，40链酶蛋白酶液和37胶原酶液5-10ml/min离体循环灌注各30min2、 再次消化：将肝脏移入超净工作台已硅化的培养皿中，去除被膜，小剪刀剪碎，倒入有震荡液的硅化三角瓶中，水浴摇床震荡30min（200-250次），向三角瓶内加入4的DMEM20ml、DNase5ml，加D-Hank至45ml，充分轻轻吹打，离心弃上清，再重复1遍，弃上清，加DMEM约7.5ml，混匀悬液3、 密度梯度50ml离心管，先加10.387%Nycodenze10ml，再将吸管深入到试管底部慢慢匀速加入18.8%的Nycodenze10ml，再在液面上缓慢加入细胞悬液20000r/min 离心25min 10加速离心后，可见上面的一层白色细胞层为未活化的星状细胞，小心吸出至2个15ml的离心管内4、 洗涤提纯HSC向离心管中加入新的DMEM至12ml，充分吹打混悬，洗涤3次，用喊20%胎牛血清的DMEM悬浮，40g离心，弃沉淀。5、 培养方法取1滴悬液至计数板上，盖上盖玻片，在倒置显微镜下观察技术细胞1106接种于6孔板，12h后换液，以后每3天换一次6、 细胞活率鉴定台酚蓝拒染实验：取2滴细胞悬液加2滴0.4%台酚蓝，混匀，3min内计数活细胞数7、 HSC纯度鉴定Desmin和GFAP免疫细胞组化鉴定在接种细胞前向培养孔内滴入1滴无菌PBS，将用多聚赖氨酸（细胞专用）包被的无菌盖玻片放入孔内，使其紧贴培养板，然后以1105接种，24h后将盖玻片取出，4丙酮固定15min，自然风干，行desmin和GFAP免疫组化双抗单染色8、 HSC自然活化形态学观察刚分离出的HSC边界清楚，细胞圆形，透亮，折光性强培养数小时后，见细胞部分贴壁，24h后细胞体积稍增大，折光性较前减弱48h后见细胞开始伸出伪足，有的呈梭行，有的蝌蚪形7d后细胞变长，胞体较大，呈现典型的纤维细胞样，14d后，细胞全部活化一种改良方法分离大鼠肝星状细胞1、 大鼠用氯胺酮100mg/kg腹腔注射麻醉，腹部备皮75%酒精消毒3次，倒U剪开腹壁充分暴露肝脏及门静脉，18套管针内静脉穿刺并保留置管，先后用20ml注射器抽吸无消化酶喊125U/ml甘肃的37D-Hank和无甘肃的37Hank，经门静脉在体灌洗肝脏，同时剪断下腔静脉放血，肝脏灌洗至流出液无血迹，肝脏变灰白，保留置管迅速游离肝脏，离体后的肝脏在超净工作台先用喊0.05%胶原酶、0.1%连蛋白酶的37Hank25ml从门静脉和肝静脉处用注射器反复灌注消化至肝脏软化。去除肝脏包膜和纤维组织，加入含0.05%DNase1的37Hank25ml磁力搅拌30,min，消化后的肝组织液200目筛网过滤得到粗细胞液，加入DMEM终止消化，500r/min 5,min低速离心去除沉淀肝细胞及细胞碎片，上清液用4 12%Nycodenze连续梯度4 3200r/min 17min分离不同比重细胞，小心吸取界面最上层的HSC，4DMEM1500r/min5min洗涤细胞，细胞用含20%胎牛血清的DMEM悬浮。分离后的HSC接种于细胞培养皿，3d7d分别进行desmin SMA免疫荧光。小鼠的肝细胞培养没有尝试过，我自己一直是做大鼠，方法还是比较成熟，成功率一般在80以上，附上步骤，希望能对你有所帮助：1.Wistar大鼠，体质量180220 g，普通块料喂养，随意饮水，室温1 822 ，每目光照1 21 4 h，术前禁食12 h2.IV型胶原酶、地塞米松、胰岛素及HGF为Sigma公司产品；RPMI1640培养基为Gibco公司产品3.大鼠用20 g/L戊巴比妥钠溶液腹腔注射麻醉(30 mgkg)，同时腹腔内注射肝素钠溶液200 U消毒皮肤后，取正中切口进入腹腔显露门静脉后在距肝门2 cm处插入18号导管，导管与一次性输血器相接，后者连接输液瓶（如果不好放置，可以改用50ml注射器，但要注意控制好速度），先以30mLmin的速度输注无钙镁的Hanks液(含EDTA 1 mmolL)200 mL，夹闭肝上下腔静脉，在肝下下腔静脉插入16号导管放出积血积液，再输注含0.5 gL IV型胶原酶的Hanks液100 mL，输注速度为15 mLmin，取下肝脏,置于含4 Hanks液的平皿中，去除肝包膜及血管，钝性撕裂肝组织(注意：千万不要用剪刀剪碎，会损伤细胞)，多层纱布过滤，制成细胞悬液，将此悬液以100目及200目不锈钢网过滤，以500 -1000rpm离心2 min,弃上清，以4 Hank液清洗并离心3次，用4 g/L台盼蓝进行染色判断细胞活率，用血细胞计数板计数细胞浓度并计算细胞产量5.将分离、纯化的肝细胞用合成培养基(含RPMI 1 640 80 mL，新生小牛血清20 mL，HGF 5 ugL，地塞米松l0 -7molL、牛胰岛素10 -8molL，青霉素100 kUL