九微生物生物转化PPT课件.ppt

第九章甾类激素的微生物转化 1 第一节概述 甾类激素是指分子结构中含有环戊烷多氢菲核的一类药物 甾体化合物的基本结构见图9 1 甾类激素根据其生理活性可分为肾上腺皮质激素 性激素和蛋白同化激素三大类 在医学上应用非常广泛 用于风湿性关节炎 控制炎症 哮喘病 皮肤病 避孕 利尿等各方面的治疗上 对机体起着非常重要的调节作用 2 早期甾类激素药物的生产主要靠化学合成 脱氧胆酸 醋酸可的松甾体激素类药物生产新的途径 微生物转化 少根根霉及黑根霉能使黄体酮转化成11 羟基黄体酮 收率达85 3 细菌 酵母 霉菌和放线菌的某些种类都可能使甾类化合物的一定部位发生有价值的转化反应 微生物转化已成为甾体工业中不可缺少的部分 在生产中常采用化学合成与微生物转化相结合的办法 4 微生物转化在生产工艺上有如下特点 可减少化学合成步骤 简化生产流程 缩短生产路线 能提高产物的收率和产品质量 降低成本 可进行化学法难以实现的反应 微生物转化避免和减少了强酸 强碱或化学有毒物质 改善了生产环境 5 第二节微生物转化反应类型 对甾体激素药物合成比较重要的主要有 氧化反应 其中氧化反应又包括甾体骨架上的羟基化和脱氢 生成双键 甾醇氧化成甾酮 支链降解作用以及D环的切断和D环开裂形成内酯环等 还原反应水解反应 6 一 羟化反应通过微生物羟化酶能非常专一地选择某个碳位置上将某空间位置上的氢取代氧化成原来空间构型的羟基 7 1 C9 羟化 8 2 C11 羟化 9 10 11 C11 羟化是微生物转化的特有反应 人体内的酶也不能将甾体C11 羟化 在C11 羟化菌株中 以黑根霉为最好利用微生物转化的方法实现 C11 C16 C17 和C19 位的羟化反应 这些也是制药工业中很有价值的反应 12 二 环氧化反应用微生物转化法在甾体母核上引入环氧基团的反应 13 三 脱氢反应 当抗炎甾体激素等药物的母核C1 C2位置导入双键后 其抗炎作用会成倍增加 14 15 化学法脱C1 C2氢是采用二氧化硒法 由于硒在生产中难以除尽会使产品中带有少量对人体有害的物质 所以采用微生物转化脱氢是甾体抗炎激素药物合成中不可缺少的一步 微生物对甾体羟化与脱氢能力是相反的 细菌的脱氢能力比真菌大 特别以棒状杆菌和分枝杆菌活力最大 球形芽孢杆菌 诺卡菌对可的松和皮质醇也有较高的脱氢活力 16 四 还原反应微生物催化的还原反应有各种类型 有的是甾类化合物上的醛或酮基被还原成伯醇或仲醇基 也有的是甾类核的A环或B环中的双键被加氢还原成饱和键等 17 五 水解反应微生物进行的水解反应包括脱酰化反应 环氧化物的水解反应等 18 第三节甾类激素的生产工艺过程 甾体的微生物转化和一般的氨基酸 抗生素的生产不同 发酵的产物不是目的产物 而只是利用微生物的酶对甾体底物的某一部位进行特定的化学反应来获得一定的产物 整个生产过程 微生物的生长和甾体的转化完全可以分开 20 一般先进行菌的培养 在菌生长过程中累积甾体转化所需要的酶 然后利用这些酶来改造分子的某一部位 为了获得较多的酶 首先需保证菌体的充分生长 但微生物的生长与酶的生产条件不是完全一致的 21 一 甾类激素生产的原料早期合成甾类激素的起始原料大多来自动物的胆甾醇 胆酸等 因这些原料的来源少 含量低 成本高 不能满足生产的需要 因而促使从植物中寻找起始原料并获得成功 已经大量投产的甾类原料 胆固醇 胆酸 薯蓣皂苷配基 穿龙薯蓣和盾叶薯蓣 豆甾醇 澳洲茄碱等 22 二 甾类激素的微生物转化生产流程 甾体的微生物转化通常分两个阶段 第一阶段是生长阶段 第二阶段是转化阶段 23 24 大多数甾体化合物难溶于水 通常是先把底物溶于有机溶剂 如丙酮 乙醇 甲醇 浓度在2 时对微生物无毒性 或用表面活性剂 如吐温80 来提高基质溶解度 甾体氧化需要较大的通气量 一般1 0 8 vvm 甾体加入的速度随菌种转化能力和基质的性质而定 一般浓度约200 800mg L 采用基质的定期加入和连续加入的办法来解决基质或产物的毒性问题 25 转化时间随菌种而异 一般范围在12 72h 转化后的产物大多不溶于水 所以采用溶剂萃取法进行提取 如果产物分泌在发酵液中 则发酵滤液采用离子交换树脂吸附法吸附甾体化合物 洗脱后 减压浓缩进行结晶 26 二 甾体微生物转化方式进行微生物转化反应可以利用不同形式的微生物细胞 如菌体培养物 静止细胞悬液 孢子悬液 混合培养物 固定化细胞或固定化酶等 静态菌体悬液优点 能自由地改变反应液中的基质和菌体量的比例 与生长培养法相比一般能缩短反应时间 在转化生长物中杂质较少 分离提纯比较容易等 27 混合培养混合培养进行反应是将具有1 2脱氢能力和11 羟化能力的微生物并用进行转化反应 可省略抽提操作 28 29 30 第四节氢化可的松的制备 氢化可的松又称为皮质醇 化学名称为11 17a 21一三羟基孕甾 4烯 1 20 二酮 其结构式为 31 氢化可的松为皮质激素类药物 具有影响糖代谢 抗炎 抗毒 抗休克及抗过敏等作用 主要用于肾上腺皮质功能不足和自体免疫性疾病 应用于某些感染的综合治疗 消化性溃疡病 骨质疏松症 精神病 重症高血压患者忌用 充血性心力衰竭 糖尿病 急性感染病慎用 由于氢化可的松疗效确切 为重要的甾体激素类药物之一 在国内生产的激素类药物中产量最大 32 1 反应原理 33 2 工艺过程 将犁头霉菌接种到土豆斜面培养基 28 培养7 9天 成熟孢子用无菌生理盐水制成孢子悬液后 种子培养基用葡萄糖 玉米浆 硫酸铵等配制 pH值为5 8 6 3 接入孢子悬液后 在通气搅拌下28 培养28 32h 待培养液菌浓度达到35 以上 无杂菌污染 即可转入发酵罐 34 将玉米浆 酵母膏 硫酸铵 葡萄糖及水投入发酵罐中搅拌 用NaOH调整物料pH值到5 7 6 3 加入O 03 豆油 灭菌温度120 通入无菌空气 降温至27 28 接入犁头霉孢子悬浮液 通气搅拌发酵28 32h 用NaOH调pH值到5 5 6 0 投入发酵液体积0 15 的莱氏化合物S 氧化48h后 取样做比色试验检查反应终点 35 到达终点后滤除菌丝 滤液用树脂吸附 然后用乙醇洗脱 洗脱