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毕 业 论 文（设计） 题 目 竹叶中多糖的提取方法研究 指导老师 汪 洪 专业班级 食品营养与检测112 姓 名 戴晓鹏 学 号 20117100203 2014年5月28日浙江经贸职业技术学院毕业论文（设计）摘要：本研究以竹叶为研究对象，通过单因素试验和正交试验观察了温度、时间、固液比、提取次数对多糖提取率的影响，比较了水提、超声波提取和微波提取三种提取方法对竹叶多糖得率的影响。结果表明，水提最佳浸提参数：温度80，时间90min，固液比1:25，浸提次数3次。超声波提取最佳浸提参数为：温度70，时间20min，固液比1:20，浸提次数3次。微波提取最佳浸提参数为：微波功率500W，固液比1:15，时间2min，浸提次数3次。最佳提取工艺方法是超声波提取，条件是温度70，时间20min，固液比1:20，浸提3次。关键词：水提；超声波；微波；沉淀； 提取次数 1目 录引言11材料与仪器21.1实验材料21.2实验试剂21.3实验仪器22 实验方法32.1竹叶多糖提取工艺流程32.2样品中多糖含量的测定32.3浸提条件对多糖提取效果的影响42.3.1单因素试验42.3.2浸提工艺正交试验42.3.3不同浸提方法的比较研究52.4分析方法53 结果与分析53.1 单因素试验结果53.1.1温度对多糖得率的影响53.1.2时间对多糖得率的影响63.1.3固液比对多糖得率的影响63.1.4提取次数对多糖得率的影响73.1.5乙醇浓度对多糖得率的影响83.2正交试验93.2.1水提工艺正交试验效果93.2.2超声波提取工艺正交试验结果103.2.3微波提取工艺正交试验效果113.3竹叶多糖不同提取方法的比较效果12结论12参考文献13III引言多糖又称多聚糖(polysaccharide)，由单糖聚合而成，是聚合度大于10的极多性复杂大分子，分子量一般为数万，数十万到数百万，也有报道甚至达上千万,是生物体内普遍存在的一大类生物大分子1。多糖按其来源不同，可分为真菌多糖、植物多糖、动物多糖、藻类地衣多糖、细菌多糖等5大类。现代研究表明多糖具有促进机体免疫力、抗菌、抗病毒、抗寄生虫、抗肿瘤、抗辐射、抗衰老、抗炎、降低血脂以及改善动物生产性能等一系列作用，其中多糖的主要功能是免疫调节，因此又叫免疫活性多糖2。20世纪90年代后，多糖及其复合物的分离纯化、组分测定和结构分析有了长足进步，同时由于细胞生物学和分子生物学的发展，研究发现了糖类化合物特别是糖复合物上的糖链参与了各种生命现象的调节，如细胞识别、粘连与融合、信号传达、免疫与应答、细胞转化和分化等都离不开糖链的参与3。由于糖复合物的种种功效，其研究也成为生命科学研究领域的新热点,具有重要的开发潜力和广阔的开发前景。竹子是禾本科( Gram ineae ) 竹亚科(Bambusoideae)多年生常绿植物, 有着复杂的次生代谢。因竹叶含有许多对人体具有重要作用的活性物质, 所以竹叶在中国具有悠久的食用和药用历史, 本草求真、本草逢原等古代医学著作均有大量记载。据记载, 竹叶性淡、微涩、寒, 味甘、苦, 具有清热利尿, 明目解毒及止血的功能。主治烦热口渴, 小儿发热, 小儿疳积, 热病不眠, 口舌生疮, 目赤肿痛, 疥癣, 疮毒, 咽喉炎, 外伤出血等症4。20 世纪80 年代, 就有从竹叶中提取食品防腐剂、杀菌剂和叶绿素等研究报道。近年来有学者在竹叶提取物中又发现了其他对人体有益的活性物质, 包括黄酮类化合物、酚酸类化合物、生物碱、生物活性多糖、氨基酸肽类、蒽醌类、萜类内酯等 , 人们对竹叶提取物中黄酮类化合物的存在及其生物活性、生物活性多糖等有效成分比较关注, 了解竹叶提取物的有效成分及其应用现状对合理利用与开发竹产业具有重要意义5。多糖具有多种生物活性,某些多糖不但具有抗癌、抗病毒、抗衰老等作用,还是理想的免疫增强剂。因此,关于多糖的研究具有十分重要的意义。但是竹叶中的多糖的提取受很多因素的影响，本文就是根据温度、时间、固液比对多糖的提取率影响做了一些研究。1材料与仪器1.1实验材料样品为3-5片毛竹（采于台州天台），分别从毛竹冠的上、中、下部采集，混合后洗净，低温烘干，粉碎后贮于磨口瓶中备用。 1.2实验试剂95%乙醇（工业酒精），乙醚、丙酮、苯酚、浓硫酸等均为分析纯试剂，购于公司。水为蒸馏水。1.3实验仪器磁力搅拌器（上海维菱科学仪器有限公司）；分光光度计（752N上海精密科学仪器有限公司）；分析天平（SPS202F梅特勒-托利多称重设备系统有限公司）；冷冻干燥仪（1-2LD德国ALPHA公司）；超声波清洗器（KQ-500DA昆山市超声仪器有限公司）；粉碎机（河北齐家务科仪厂）；旋转蒸发仪（RE-52AA上海亚荣生化仪器厂）；微波炉（WP800格兰仕）；电热恒温鼓风干燥箱 (DHG一9246A上海精宏试验设备有限公司)；高速离心机(DL-5型上海安亭科学仪器厂)；高效外循环浓缩设备（SJN，天津隆业设备厂）；2 实验方法2.1竹叶多糖提取工艺流程图2.1竹叶多糖提取工艺流程2.2样品中多糖含量的测定准确称取竹叶磨碎样5.0 g加100 mL蒸馏水提取，提取液减压浓缩到10 mL，加4倍于浓缩液体积的95乙醇沉淀1224 h，4000 r/min离心，取沉淀，定容到250 mL，取0.5mL用硫酸-苯酚法测定多糖含量，按公式计算多糖得率。 多糖得率()=CV/W100 c：根据吸光度值由回归方程计算的多糖浓度值 v：多糖溶液体积w：竹叶样品千重.2.3浸提条件对多糖提取效果的影响2.3.1单因素试验.温度对多糖得率的影响准确称取竹叶磨碎样5.0g，加200mL蒸馏水，分别在40、60、80、100，提取2.0h，提取液浓缩至10mL，加4倍体积95的乙醇沉淀1224 h，4000r/min离心，取沉淀，沉淀定容到250mL，硫酸-苯酚法测定多糖含量。 .浸提时间对多糖得率的影响准确称取竹叶磨碎样5.0 g ，加200mL蒸馏水，按确定的温度，分别浸提15 min、30 min、60 min、90 min、120 min、150 min，其他操作如，硫酸-苯酚法测定多糖含量。.固液比对多糖得率的影响准确称取竹叶磨碎样5.0 g，以确定的温度和时间，按固液比l:5、l:10、1:20、1:30、1:40提取，其他操作如，硫酸-苯酚法测定多糖含量。 .浸提次数对多糖得率的影响准确称取竹叶磨碎样5.0g，按上述试验确定的温度、时间，分别浸提1次、2次、3次、4次，每次固液比为1:30，其它操作如，硫酸-苯酚法测定多糖含量。 .乙醇浓度对多糖得率的影响准确称取竹叶磨碎样25.0g，按80，固液比1：30，浸提60 min，将浸提液平均分成5份，提取液浓缩到l：2(竹叶质量：浓缩液)，以终溶液中乙醇的不同浓度沉淀1224 h，4000 r/min离心取沉淀，定容到250mL，硫酸苯酚法测多糖含量，计算得率。 2.3.2浸提工艺正交试验按L9(34)正交表分别采用水提、超声波浸提、微波浸提，对竹叶多糖提取工艺参数进行试验，用硫酸一苯酚法测定多糖含量。表2.1水提L9(34)正交试验因素水平表温度A/时间B/min固液比C 提取次数D170301:151280601:202390901:253表2.2超声波提取L9(34)正交试验因素水平表温度E/时间F/min固液比C提取次数D150101:151260201:202370301:253表2.3微波提取L9(34)正交试验因素水平表功率G/W时间H/min固液比C提取次数D120011:151230021:202350031:2532.3.3不同浸提方法的比较研究准确称取一定量的竹叶样品，先分别预浸30 min，再参照以上正交试验结果，分别浸提，苯酚-硫酸法测定多糖含量，分析试验结果。2.4分析方法使用MicrosofI Excel 2000和The SAS system for Windows 70(简体中文)，对数据进行分析。3 结果与分析3.1 单因素试验结果3.1.1温度对多糖得率的影响由图3.1可知，在40至80的温度范围内，随着提取温度的升高，多糖得率增加，当温度为80时，多糖得率达到最大值，之后有所下降，可能是过高的提取温度，会造成糖苷键的断裂，使多糖分解，导致得率降低，结果表明，采用80的提取温度效果较好。图3.1 浸提温度对多糖得率的影响3.1.2时间对多糖得率的影响由图3.2可知，随着浸提时间的延长，多糖得率增加，在60min时达到最大值，之后开始下降，可能是在80的提取温度下，过多延长提取时间会造成糖苷键的断裂，使多糖分解，导致得率降低，因此，竹叶多糖的提取时间采用60 min为佳。 图3.2浸提时间对多糖得率的影响3.1.3固液比对多糖得率的影响由图3.3可知，在固液比1：5至1：40的范围内，随着固液比的增大，溶质的扩散动力增加，易于从材料中扩散到提取液中，多糖得率不断增加；当固液比达到1:30时，多糖已基本溶出，内外浓度达到平衡，继续增加固液比，多糖得率增加不明显，而且会增加杂质的浸出率，同时也会增加后续加工成本，综合考虑各方面因素，1:30的固液比提取竹叶多糖，效率较高，且成本较低。 图3.3浸提固液比对多糖得率的影响此外，工业化生产中，固液比受容器容积、搅拌状况、提取液理化性质等限制，考虑到节能，其不能太大，增加固液比虽然得率可能会有小幅度的增加，但会增加后续工序的处理量，目的产物的损失也相应增加，且能耗增大；固液比太小，提取又不完全，综上所述，对于小试规模时，固液比选用1：30较为合适，对于中等或大规模多糖提取工艺，固液比的确定将更为复杂，有待于讲一步研究。3.1.4提取次数对多糖得率的影响从表31、图34可以看出，竹叶多糖前两次提取的得率占总得率的92.49，其中以第1次提取的得率最高，占总得率的80.67：多次提取可以增加多糖得率，提取两次以后继续增加提取次数，多糖得率有所增加，但效果不明显。这可能是由于多次提取时每次加入新鲜溶剂，在浓度差推动下，颗粒层中多糖扩散到液相，从内到外，液固间形成无数个平衡，随着液相浓度增加，扩散推动力减小，经过一段时间后，液固两相达到或接近平衡，此时只有更换溶剂才能继续提取，因此增加提取次数会对得率产生影响，但随着提取次数的增加，固相中多糖含量明显下降，导致溶液浓度很低且杂质浸出率增加，2次提取以后多糖得率效果不明显，故竹叶多糖的提取次数选择2次为佳。表3.1浸提次数对多糖得率的影响提取次数12345浓度（ug/ml）94.94013.9125.4523.0082.068得率0.5050.0740.0290.0160.011百分率/%80.67011.8204.6302.5601.760 图3.4浸提次数对多糖得率的影响 3.1.5乙醇浓度对多糖得率的影响从图3.5可以看出，随着乙醇浓度的增加多糖得率相应增加，当乙醇浓度达到80时多糖得率达到最大值，随后由于溶剂总量不断增大，多糖溶解增多，反而不利于沉降，从而影响多糖得率，故竹叶多糖的提取以80乙醇浓度为佳。 图3.5乙醇浓度对多糖得率的影响3.2正交试验3.2.1水提工艺正交试验效果通过对水提工艺中提取次数、温度、时间和固液比进行多重比较，由表3.2 SAS统计数据分析结果可知，影响竹叶多糖提取率因素的主次关系为：提取固液比对多糖提取率影响最大，其次为提取次数，温度和时间的影响相对较小。其最佳浸提组合80下，浸提90min，固液比1：25，浸提3次，在最佳条件下，多糖得率为0.661。表3.2水提工艺正交试验结果A温度/B时间/minC固液比D提取次数得率/%170301:1510.283270601:2020.541370901:2530.654480301:2030.593580601:2510.473680901:1520.566790301:2520.587890601:1530.572990901:2010.449T11.4781.4631.4211.205T21.6321.5861.5831.694T31.6081.6691.7141.819K10.4920.4880.4740.402K20.5440.5290.5280.565K30.5360.5560.6890.606R0.0520.0680.2150.204注：得率为两次测定的平均值 3.2.2超声波提取工艺正交试验结果超声波提取是利用其产生的强烈振动、高的加速度、强烈的空化效应、搅拌作用等，加速药物有效成分进入溶剂，从而提高浸提率，缩短提取时间，节约溶剂。由表3.3正交试验SAS统计数据分析的试验结果可知，提取次数对提取率影响最大，其次为温度和时间，固液比对提取率相对影响较小。超声波最佳浸提组合为70下，浸提20min，固液比1：20，浸提3次，在这种条件下，多糖得率为0.708。但因为时间和固液比对提取率的影响较小，考虑到后续加工的成本问题，建议采用l:15的固液比，浸提10min。表3.3超声波提取工艺试验结果E温度/F时间/minC固液比D提取次数得率/%150101:1510.234250201:2020.474350301:2530.531460101:2030.625560201:2510.303660301:1520.479770101:2520.543870201:1530.695970301:2010.403T11.2391.4021.4080.940T21.4071.4721.5021.496T31.6411.4131.3771.851K10.4130.4670.4690.313K20.4690.4910.5010.499K30.5470.4710.4590.617R0.1340.0240.0420.304注：得率为两次测定的平均值 3.2.3微波提取工艺正交试验效果微波提取是利用微波的穿透性能够透入基质内部形成内热源，利用其加热的选择性，使细胞内各细胞器升压，细胞壁破裂，使目标成分从细胞中释放出来并溶解于溶剂中，其能在较小的固液比下得到较高的提取率，从而达到低耗高效的目的。由表3.4正交试验SAS统计数据分析结果可知，微波功率和提取次数对提取效果的影响最大，其次为时间和固液比。其最佳浸提组合为在微波功率500W的条件下，按固液比l：15，提取2min，浸提3次，在最佳条件下，多糖得率为0.655。表3.4微波提取工艺试验结果G功率/WH时间/minC固液比D提取次数得率/%120011:1510.198220021:2020.371320031:2530.444430011:2030.429530021:2510.371630031:1520.514750011:2520.470850021:1530.655950031:2010.421T11.0131.0971.3670.990T21.3141.3971.2211.355T31.5461.3791.2851.528K10.3380.3660.4560.330K20.4380.4660.4070.452K30.5150.4600.4280.509R0.1770.1000.0490.179注：得率为两次测定的平均值 3.3竹叶多糖不同提取方法的比较效果由表3.5的试验结果可知，微波浸提2 min的多糖提取率与水提相当，超声波浸提的提取率明显高于水提和微波浸提，分别提高12.2和13.3。由此可见，超声波法和微波法在竹叶多糖的提取中具有提取效