（环境科学专业论文）高效絮凝性基因工程菌的构建.pdf

a b s t r a c t a b s t r a c t m i c r o b i a lf l o c c u l a n t s ，o rm b ff o rs h o r t ，i sai l e wt y p eo ff l o c c u l a n t sw i t ht h e c h a r a c t e r i s t i co fs a f e t y , h i g he f f i c i e n c y , b i o d e g r a d a t i o n ，n oe n v i r o n m e n tp o l l u t i o n , e t c m b fh a sb e e na p p l i e dw i d e l y 、加lt h eg r e a tp o t e n t i a li nt h ef i e l d so fm e d i c i n e f o o d p r o c e s sa n dm i c r o b i o l o g i c a lf e r m e n t a t i o n t h eg o a lo ft h i se x p e r i m e n ti st oe x t r a c th i g he f f i c i e n tf l o em i c r o b es t r a i nb yg e n e t i c e n g i n e e r i n gt e c h n o l o g y t h ef i r s ts t e p ：e x t r a c tg e n o m i cd n af r o ms a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a ea n df l o c c u l a t i o ng e n eb yp c r t e c h n o l o g y ；t h es e c o n ds t e p ：c o n n e c tf l 0 1 g e n ef r a g m e n tw i t hp h y 3 0 0 p l ko f e c o l ib yr e s t r i c t i o ne n z y m ec o n n e c t i o n t e c h n o l o g yt of o r mi n t or e c o m b i n a n tp l a s m i d ；t h et h i r ds t e p ：t r a n s f e rt h er e c o m b i n a n t p l a s m i di n t oe c o l id h 5 af o ra m p l i f i c a t i o n ；t h ef o r t hs t e p ：e x t r a c tr e c o m b i n a n t p l a s m i dp h y 3 0 0 p l k - - f l 0 1f r o me c o l ia n dt r a n s f e rt h e mi n t ot h ef i n a lh o s tc e l l b a c i l l u sp o l y m y x a a f t e rf i l t e ra n da p p r a i s a l ，o b t a i n i n gt h eg e n ee n g i n e e r i n gb a c t e r i a b p 4 13 。 a f t e ra b s t r a c t i n gr e c o m b i n a n tb a c i l l u sp o l y m y x ab p 413 ，t h eb i o l o g i c a la c t i v i t yh a s b e e ne x a m i n e d t h et e s ts h o w st h a tt h er e c o m b i n a n tb a c i l l u sp o l y m y x ab p 413h a v e s t r o n ga d a p t a b i l i t yo fg r o w t hc o n d i t i o n f o rp h ，i tc a l lb eu s e dt op h5 o 一9 o ；f o r t e m p e r a t u r e ，t h eb e s tt e m p e r a t u r ef o rg r o w t hi s3 0 ca sw e l la si n2 0 a n d4 0 ；f o r o s m o t i cp r e s s u r ei tc a l ls u s t a i ng r o w t h i n gi n10 s o d i u mc h l o r i d ea n di n2 0 s a c c h a r o s e t h ef o c c u l a t i n gr a t eo fr e c o m b i n a n tb a c i l l u sp o l y m y x ab p 413i s1 6 3 t i m et h a nt h eo r i g i n a lb a c i l l u sp o l y m y x a r e c o m b i n a n tb a c i l l u sp o l y m y x ab p 413c a n s y n t h e s i z ec e l lw a l lp r o t e i nw h i c hi st h em a i nc o m p o n e n to ff l o c c u l a t i o n k e yw o r d s ：f l o c c u l a t i o n ，f l 0 1 ，r e c o m b i n a n tp l a s m i dp h y 3 0 0 p l k f l 0 1 ， b a c i l l u sp o l y m y x a i i 南开大学学位论文版权使用授权书 本人完全了解南开大学关于收集、保存、使用学位论文的规定， 同意如下各项内容：按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版 本；学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并采用影印、缩印、 扫描、数字化或其它手段保存论文；学校有权提供目录检索以及提供 本学位论文全文或者部分的阅览服务；学校有权按有关规定向国家有 关部门或者机构送交论文的复印件和电子版；在不以赢利为目的的前 提下，学校可以适当复制论文的部分或全部内容用于学术活动。 学位论文作者签名：夕枣磷札 渺孑年5 月弓旧 经指导教师同意，本学位论文属于保密，在年解密后适用 本授权书。 指导教师签名：学位论文作者签名： 解密时间：，年月 日 各密级的最长保密年限及书写格式规定如下： 南开大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，进行研究工作 所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文的研究成果不包含 任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的作品的内容。对本论文所涉 及的研究工作做出贡献的其他个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本学 位论文原创性声明的法律责任由本人承担。 学位论文作者签名： 杰水 1 ) 一占年5 月3f 日 第一章前言 第一章前言 第一节絮凝剂的概念及分类 絮凝剂又称沉降剂，作为一类可使液体中不易沉降的固体悬浮微粒( 粒径 1 0 。3 l o t i n ，如固体悬浮物、胶体粒子、不沉降物和可溶性物质等) 凝聚、 沉淀的物质，在废水处理、发酵工业后处理、食品加工、土木疏浚工程等领域 应用广泛【1 5 1 。 随着科学技术的发展和环境保护的需要，特别是对于水资源的利用，已成 为世界性的重大课题。在当今环保产业技术领域中，水处理药剂与材料是当前 水工业、污染治理与节水回用净化处理工程技术领域中应用最广泛，用量最大 的特殊产品。范畴主要包括三大类药剂产品：即各类型絮凝剂、蚀阻垢剂与消 毒杀生剂。水处理的方法有很多：絮凝沉淀法、吸附法、生化法、离子交换法、 化学氧化法、电渗析法等【6 ，1 7 1 。其中应用最广泛、成本最低的处理方法是絮凝沉 淀法。絮凝沉淀技术是目前国内外普遍使用的一种水质处理的前置单元操作技 术，是一种既经济又简便的水处理技术j 。絮凝剂的选择是该工艺的核心和关键 部分，其性质直接影响絮凝效果的好坏。絮凝剂的种类繁多，随着科学技术的 发展，絮凝剂逐渐从单一化向多样化转变。 按组成、性质，絮凝剂可大致分为无机、有机、微生物絮凝剂和复合型絮 凝剂四大类。 1 1 1无机絮凝剂 无机絮凝剂是最早使用的一种絮凝剂，它应用范围非常广泛。按分子量的 大小可分为低分子絮凝剂和高分子絮凝剂两类： 无机低分子絮凝剂，是传统无机絮凝剂，为低分子的铝盐和铁盐，其作用 机理主要是双电层吸附【9 】，铝盐中主要有硫酸铝( a i ( s 0 4 ) 3 1 8 h 2 0 ) 、明矾 ( a 1 2 ( s 0 4 ) 3 k 2 s 0 4 2 4 h 2 0 ) 、铝酸钠( n a a l 0 3 ) 。铁盐主要有三氯化铁( f e c l 3 6 h 2 0 ) 、 硫酸亚铁( f e s 0 4 6 h 2 0 ) 和硫酸铁( f e 2 ( s 0 4 ) 3 2 h 2 0 ) 。这类絮凝剂腐蚀性强，易造成 设备的腐蚀，而且处理后水的色度比较高，a 1 3 + 在水中的高残留量会导致二次污 第一章前言 染；无机低分子絮凝剂的优点是经济、用法简单，但用量大、残渣多。絮凝效 果比高分子絮凝剂的絮凝效果低。 无机高分子絮凝剂是2 0 世纪6 0 年代以来在传统的铁盐和铝盐基础上发展起 来的一类新型水处理药剂。其絮凝效果好，价格相对较低，已逐步成为主流絮 凝药剂。在日本、西欧和中国，目前都已有相当规模的无机高分子絮凝剂的生 产和应用， 其产量约占絮凝剂总产量的3 0 - - 一6 0 1 0 】。近年来，我国高分子絮 凝剂的发展趋势主要是向聚合铝、铁、硅及各种复合型絮凝剂方向发展，并已 逐步形成系列：阳离子型的有聚合氯化铝( p a c ) 、聚合硫酸铝( p a s ) 、聚 合磷酸铝( p a p ) 、聚合硫酸铁( p f s ) 、聚合氯化铁( p f c ) 、聚合磷酸铁( p f p ) 等；阴离子型的有活化硅酸( a s ) 、聚合硅酸( p s ) ；无机复合型的有聚合氯 化铝铁( p a f c ) 、聚硅酸硫酸铁( p f s s ) 、聚硅酸硫酸铝( p f s c ) 、聚合氯 硫酸铁( p f c s ) 、聚合硅酸铝( p a s i ) 、聚合硅酸铁( p f s i ) 、聚合磷酸铝铁 ( p a f p ) 、硅钙复合型聚合氯化铁( s c p a f c ) 等。 1 1 2 有机高分子絮凝剂 有机高分子絮凝剂是2 0 世纪6 0 年代开始使用的第二代絮凝剂。与无机高分 子絮凝剂相比，有机高分子絮凝剂用量少，絮凝速度快，受共存盐类、污水p h 值及温度影响小，生成污泥量少，节约用水。强化废( 污) 水处理，并能回收 利用。但有机和无机高分子絮凝剂的作用机理不相同，无机高分子絮凝剂主要 通过絮凝剂与水体中胶体粒子间的电荷作用使电位降低，实现胶体粒子的团聚， 而有机高分子絮凝剂则主要是通过吸附作用将水体中的胶粒吸附到絮凝剂分子 链上，形成絮凝体。有机高分子絮凝剂的絮凝效果受其分子量大小、电荷密度、 投加量、混合时间和絮凝体稳定性等因素的影响。目前有机高分子絮凝剂主要 分两大类，即合成有机高分子絮凝剂和天然改性高分子絮凝剂。 合成有机高分子絮凝剂以聚乙烯、聚丙烯类聚合物及其共聚物为主，其中 聚丙烯酰胺类用量最大，占有机高分子絮凝剂的8 0 左右。目前，国内外有关阳 离子型合成高分子絮凝剂的报导比较多主要是季胺盐类、聚胺盐类以及阳离子 型聚丙烯酰胺等，其中研究与应用最多的是季胺盐类。它们均己研制成功并在 工业水处理中得到了广泛的应用。龙柱等人利用协同增效原理将聚和氯化铝与 有机合成高分子复合，制得一种新型有机无机复合高分子絮凝剂，处理造纸废 2 第一章前言 水，效果优于单独使用聚和氯化铝。由于有机合成高分子絮凝剂的生产成本高， 产品或残留单体有毒，使其广泛应用受到限制。 天然高分子絮凝剂的使用远小于合成的有机高分子絮凝剂，原因是其电荷 量密度较小，分子量较低，且易发生生物降解而失去其絮凝活性。而经改性后 的天然有机高分子絮凝剂与合成的有机高分子絮凝剂相比，具有选择性大、无 毒、价廉等显着特点。这类絮凝剂按其原料来源的不同，大体可分为淀粉衍生 物、纤维素衍生物、植物胶改性产物、多糖类及蛋白质改性产物等【1 1 1 。由于天 然高分子物质具有分子量分布广、活性基团点多、结构多样化等特点，易于制 成性能优良的絮凝剂，所以这类絮凝剂的开发势头较大，国外已有不少商品化 产品。我国天然高分子资源较为丰富，但相对而言，我国在这方面研究还开展 得较少。 1 1 3 微生物絮凝剂 微生物絮凝剂是一种高效、无毒、无二次污染、能自行降解、使用范围广 的新一代絮凝剂，详细内容参考本章第二节。 1 1 4 复合型絮凝剂 近年来研究人员发现在处理废水等复杂、稳定的分散体系时，复合絮凝剂 表现出优于单一絮凝剂的效果。从化学组成上来看，其大致可以分为无机有机 复合絮凝剂、微生物无机复合型絮凝剂和复合型微生物絮凝剂。 无机有机复合絮凝剂具有适应范围广，p h 值适应性大，对低浓度或高浓度 水质、有色废水、多种工业废水都有良好的净水效果，而且污泥脱水性好等特 点。其复配机理主要与协同作用有关。一方面污水杂质为无机絮凝剂所吸附， 发生电中和作用而凝聚；另一方面又通过有机高分子的桥连作用，吸附在有机 高分子的活性基团上，从而网捕其它的杂质颗粒一同下沉，起到优于单一絮凝 剂的絮凝效果。 董军芳等人把微生物与硫酸铝复配使用，比单用其中任何一种絮凝剂的絮 凝效果都要好【l2 1 。但目前未见把这两种絮凝剂做成复合絮凝剂对实际废水进行 处理的实例。 复合型微生物絮凝齐1 ( e o m p o u n dm i c r o b i a lf l o c c u l a n t s ，简称m b f ) 是由哈尔滨 第一章前言 工业大学马放教授率先提出的，即采用廉价底物经过多株菌混合发酵后制得的微 生物絮凝剂，发酵过程中采用的菌种取自活性污泥和土壤，分离筛选出的4 株絮凝 率较高的菌株经鉴定均为芽孢杆菌属。把其中任意两株混合培养之后，发现f 2 和 f 6 发酵液的絮凝率较原来的其中一株菌均有提高，因此这两株菌成为后续发酵的 主要菌种。通过摇床试验确定了制取该絮凝剂的发酵条件并就其对源水的处理 效果作了测定，研究出效果良好的絮凝剂【l3 1 。 4 第一章前言 第二节微生物絮凝剂 1 2 1微生物絮凝剂的概念与特点 微生物絮凝7 i j ( m b f ) 是一种具有安全、高效、可生物降解、无环境污染等特 点的新型絮凝剂【l4 1 。它可以克服无机絮凝剂( 如铝盐对人体有害，而铁盐过多 会使水体颜色加深，造成二次污染) 和有机高分子絮凝剂( 大多数有致畸、致 癌、致突变作用) 自身固有的缺陷。徽生物絮凝剂是某些种类的细菌、放线茵、 霉菌、酵母等在特定培养条件下，其生长代谢至一定阶段产生的具有絮凝活性 的代谢产物，是一类天然高分子絮凝剂【l5 1 。其主要活性成分是具有两性多聚电 解质特性的蛋白质、多塘、核酸类生物高分子化合物：它们通过其电荷性质和 高分子特性在液体介质中起电荷中和、吸附、桥联、网捕等作用，使胶体脱稳、 絮凝沉淀、固液分离。由于能产生絮凝作用的微生物种类多、生长快、易于采 取生物工程手段实现产业化，目前，微生物絮凝剂已经开始广泛应用于废水处 理、食品工业、生物制药等领域。由于其可以生物降解，最终实现无污染排放， 因此越来越受到人们的关注。因此，微生物絮凝剂是一类极具发展前途的水处 理药剂。 与无机或有机高分子絮凝剂相比，微生物絮凝剂具有许多独特的优势与特 占 j 、 1 ) 微生物具有比表面大、转化能力强、繁殖速度快、易变异、分布广等特 点，且生物絮凝剂的来源广，这样生物絮凝剂的生产周期会非常短且效率高。 2 ) 高效。同等用量下，与现在常用的铁盐、铝盐、聚丙烯酰胺相比，微生 物絮凝剂对活性污泥的絮凝速度最高，而且絮凝沉淀物容易过滤。 3 ) 无毒。微生物絮凝剂为微生物菌体或菌体外分泌的生物高分子物质，属 天然有机高分子絮凝剂，它安全无毒。 4 ) 可消除二次污染。微生物絮凝剂是微生物的分泌物，自然不会危害它自 身，不会影响水处理效果，且絮凝后的残渣可被生物降解，对环境无害，不会 造成二次污染。 5 ) 应用范围广泛，脱色效果独特。微生物絮凝剂能处理的对象有活性污泥、 粉煤灰、木炭、墨水、泥水、河底沉积物、高岭土、印染废水等。而且，生物 5 第一章前言 絮凝剂对悬浊液絮凝速度快、用量少，对胶体、溶液均有较好的絮凝效果，对 富含有机物的屠宰废水和血水也有较好的去色效果。 6 ) 价格较低。无论从生产成本还是处理技术总费用，微生物絮凝剂的价格 都低于化学絮凝剂的价格。不足之处是，微生物絮凝剂的效果容易受到有毒物 质的干扰；因此，被处理的废液中必须无妨害菌体生长的因素。 1 2 2 微生物絮凝剂的种类 1 按化学组成分类 ( 1 ) 蛋白质：a s p s o j a e a j 7 0 0 2 合成的絮凝剂的主要活性成分是蛋白质和己糖 胺；生物絮凝剂n o c 1 也是一种蛋白质，并且该蛋白质分子中含有较多的疏水氨 基酸。( 2 ) 多糖：目前已经鉴定的生物絮凝剂有很多种属于多糖类物质。a l c a l i g e n e s c u p i d u sk t 2 0 1 代谢产生的a 1 2 0 1 即是一种由葡萄糖、乳糖、葡糖醛酸和乙酸( 摩 尔比：6 3 4 ：5 5 5 ：1 o ) 组成的生物絮凝剂；p a e c i l o m y c e ss p i 1 产生的p f 1 0 1 絮 凝剂则是由氨基半乳糖以( 1 ，4 ) 糖苷键相连而成的粘多糖【l6 1 。( 3 ) 脂类：k u r a n e 首 次从r e r y t h r o p o l i ss 1 的培养液中分离到了一种脂类絮凝剂，这是目前发现的唯 一的脂类絮凝荆1 7 1 。絮凝剂分子中含有葡萄糖单霉菌酸酯( g m ) ，海藻糖单霉菌 酸酯( t m ) ，海藻糖二霉菌酸酯( t d m ) 3 种组分。( 4 ) d n a - 高分子量的天然双链 d n a 是p s e u d o m o n a sc 1 2 0 菌体细胞凝集的直接原因。光合细菌r b o d o v u l u m s p p s 8 8 的絮凝活性与该菌分泌到胞p i - 的d n a 亦直接相关。此外，某些菌的代谢 物p h b ，聚y 谷氨酸，多聚磷酸盐，谷氨酸棒杆菌合成的多聚半乳糖醛酸等 在特定条件下亦具有较强的絮凝活性【l 8 1 。 2 按生物絮凝剂的来源分类 ( 1 ) 禾l j 用微生物细胞壁提取物的絮凝剂：絮凝酵母的絮凝机理就在于细胞外 壁的甘露聚糖与细胞表面蛋白结合引起细胞凝集【1 9 】。另外，酵母细胞壁的葡聚 糖，n 一乙酰葡萄糖胺，丝状真菌细胞壁多糖等对许多微生物细胞及其它带负 电荷的粒子都具有极强的絮凝力。( 2 ) 利用微生物细胞代谢产物的絮凝剂【2 0 】： z o o g l o e ar a m i g e r a 的胞内聚合物p h b ，s a a r a n a v e n t r i c u l ie c - - 1 产生的附着于细胞 外表面的胞外纤维都是这些细胞具有絮凝活性的直接原因。 目前国内外学者研究开发的生物絮凝剂大多属于脱离菌体细胞游离于发酵 液中的絮凝物质( 女1 k u r a n e 开发的n o c 1 ；t a k a g i 研$ i j 的p f 1 0 1 等) 。与细胞的内 6 第一章前言 源代谢物相比，此类生物絮凝剂往往因为具有更为广阔的应用领域而受到重视。 1 2 3 微生物絮凝剂的分子组成与性质 近年来，国内外研究者借助各种技术手段对多种絮凝剂的组成与性质进行 了较为详细的分析。现将部分生物絮凝剂的分子组成与性质归纳如图1 1 所示。 相对分子 絮凝剂产生菌的名称絮凝剂名称组成结构属性 质量 r h o d o c o c c u s e r y t h r o p o u n o c 1 多肽、脂质糖蛋白类 s 8 5 半乳糖胺、2 3 乙酰基、5 7 0 a 甲酰基，氮化半 p a c e c i l o m y c e ss p i - i p f 1 0 l3 1 0 5枯多糖类 乳糖胺 蛋白质、己 2 0 9 的半乳糖、0 3 葡糖胺、3 5 3 2 - 酮葡糖酸、糖、2 一葡糖、 h s p e r g i l l u ss o j u e a j 7 0 0 2 2 l o s 2 7 5 蛋白质酮酸的聚合 物 主要组成为多肽，含2 5 6 甘氨酸、1 3 8 丙氨酸、 n o c a r d i aa n e r u e u l df i x蛋白质类 1 2 3 丝氨酸 a l c a l i g e n e sc u p i d s a l 2 0 1 4 2 5 糖、3 6 3 8 半乳糖、8 5 2 的葡糖醛酸、1 0 3 2 1 0 6 多聚糖类 k t 2 0 l的乙酸 3 i0 5 a s p e r g i l l u s p a r a s i t i c u s a h u 7 1 6 5 半乳糖胺，5 5 6 5 的氮未取代的半乳糖胺残基 多糖类 1 1 0 6 葡楠，半乳塘，琥珀酸，丙酮酸物质的量比为 r 3 m x e dm c r o b e sa p l 0 3 2 1 0 6酸性多糖 5 6 ：1 ：o 6 ：2 5 a n a b e n o p s mc i c u l a r i t e p c c 6 7 2 0 丙酮酸、蛋白质、脂肪酸杂多糖类 定性分析表明含有氨基厶糖、糖醛酸、中性糖、蛋 a r c u a d e n d r o n ，s p t s - - 4 9杂多糖类 白质 s p o r o l a c t o b a c i l l u ss p 核益白 a e r o m o n a ss p 核蛋白 a n a b a e n as p p c 一1 中性糖、糖醛酸、蛋白质多聚糖蛋白 p s e u d o m n a ss p a 一9 9 酸性蛋白，少站半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖酸r e 糖蛋白 e n t e r o b a c t e r s p b y - 2 9 半乳铺醛酸、葡萄糖、半乳精、戊醛糖 2 5 1 0 6 酸性多聚糖 k l e b s i e l l ap n e u m o n i a e5 6 0 4 半乳糖、2 5 9 2 葡萄糖、l o 9 2 半乳糖醛酸、 多聚糖 h 1 2 3 7 l 甘露糖、3 3 7 葡萄糖醛酸 k l e b s i e l l as p s i ! 半乳糖：葡萄糖：甘露糖= 5 ：2 ：l ( 物质的景比) 2 1 0 6 酸性多聚糖 p e s t a l o t i o p s i ss p p e s t a n 葡萄糖：葡( 萄) 糖脓：葡萄糖醛酸：鼠李糖 多聚糖 k c t c 8 6 3 7 p = 1 0 0 ：3 5 ：1 6 ：1 3 ( 物质的量比) x a n t h o m o n a 8 黄原胶 葡萄糖：甘露糖：半乳糖：海藻糖= 8 ：4 ：2 ：l ( 物质的量 b a d l l u ss p d p - 1 5 2d p 1 5 2 2 1 0 6多聚糖 比1 表1 1生物絮凝剂组成、相对分子质量、结构属性 2 1 】 某些生物絮凝剂的分子组成会随培养条件的改变而发生变化。m y c o b a c t e r i a 和n o c a r d i a 合成的絮凝剂分子中霉菌酸的碳链长度及不饱和度会随培养温度的 7 第一章前言 变化而变化；r h o d o c o c c u sr h o d o c h r o u s 贝, l jr j 够通过改变培养基中的碳源而改变含 霉菌酸的絮凝剂的分子结构。由此，k u r a n e 1 7 1 曾设想，利用微生物的这一特性 可以为通过改造分子结构，构造更高活性的生物絮凝剂提供了有利条件。 1 2 4 微生物絮凝剂的作用机理 对于游离于产生菌胞外的絮凝剂的絮凝机理，目前较为普遍接受的是“桥联 作用”机理。该学说认为，大分子生物絮凝剂的絮凝过程是几个物理化学过程共 同作用的结果： ( 1 ) 吸附架桥作用：絮凝剂大分子借助离子键、氢键和范德华力，同时吸附 多个胶体粒子，在颗粒间产生架桥现象，从而形成一种网状三维结构沉淀下来( 图 1 2 ) 。l e v y 以吸附等温线和电位测定证明环圈项圈藻p c c 6 7 2 0 所产絮凝剂对膨润 土絮凝过程确以“桥联”机制为基础【凋。 高分子聚合物胶体脱稳胶体 斌+ 伶一嚼k o 严 脱稳胶体絮凝体 图1 1高分子聚合物的吸附架桥机理 j i a b i l l e 2 3 】研究了细菌多糖絮凝粘土的机理。比较不同的酸性多糖的絮凝能 力发现：加入盐减弱了多糖与胶体颗粒的静电排斥作用。多糖上正电荷量，特 别是其在多糖上的分布位置决定了架桥作用的大小和聚合物的张力( 多糖上正电 荷之间的静电斥力使得链条伸展开) 。羟基可以提高多糖的絮凝效果；同时又研 究了在不同p h 值下多糖的絮凝能力：酸性多糖通过在粘土小板的两性表面上发 生的静电作用而吸附。而中性多糖则通过弱静电作用发生吸附。聚合物表面强 8 第一章前言 烈的反应可增加絮体的粘性，从而增加了多糖在水溶液中的伸展度，为架桥提 供了条件。 微生物絮凝剂m b f a 9 2 4 】中含有较多的羧基和具有较大的分子量是其具有较 强絮凝性的主要原因。其产生的作用如下：絮凝剂分子中o h 、c o o h 、c o o 等基团与颗粒表面的h + 、o h 以氢键产生点吸附。絮凝剂m b f a 9 含有高于一 般微生物多糖的糖醛酸( 1 9 1 ) ，由于c o o 基的静电斥力作用，一方面使得分 子链具有较好的伸展性，另一方面，使m b f a 9 水溶性增强，这都有效地发挥了 吸附架桥的作用。 絮凝剂m b ft r j 2 1 为粘多糖类高分子絮凝剂【2 5 1 ，芒电位测定及氢键和离子键 检验结果表明，絮凝剂和碱泥之间的作用力为氢键；絮凝剂的热处理k 1 0 4 处理 表明，其活性成分为蛋白质和糖胺；絮凝过程中粒度分析表明，絮凝过程存在 架桥作用。其絮凝机理为：絮凝剂和碱泥在絮凝剂的活性部位_ 睹胺中的氨 基以氢键的形式结合，然后再经过架桥作用絮凝沉淀。 微生物絮凝剂c b f 2 6 】为多糖物质，含有c o o 和一c o o h ，通过鼍电位测定及 氢键和离子键检验，利用原子力显微镜观察，其絮凝机理为：通过搅拌作用， 布朗运动及范德华力作用下克服排斥力使c b f 与颗粒相互靠近，并且絮凝剂大分 子借助于离子键同时吸附多个无机或胶体颗粒，并在颗粒间产生“架桥”现象，形 成一种三维网块结构沉淀下来。 综上所述，可以认为，多糖类m b f 的絮凝机理为吸附架桥。羟基，羧基或 氨基等活性基团与颗粒以氢键、离子键结合是发生絮凝作用的关键。m b f 分子 量越大，在水中伸展性越好，絮体之间相互架桥作用就越强，最后形成网状结 构而下沉。其中，搅拌作用，温度，p h 值和离子强度等都是影响絮凝过程的因 素。 ( 2 ) 电中和作用：l e v y 在研究c y a n o b a c t e r i u mp h o r m i d i u ms t r a i nj 1 产生的絮 凝剂f j 1 时指出【2 2 1 ，在胶体颗粒的絮凝过程中，电中和效应也是不容忽视的。溶 液中带有多个电荷的多价电解质能够与颗粒表面带的相反电荷发生中和，从而 减弱颗粒间彼此的相互排斥力，促进颗粒的絮凝沉降，为絮凝剂的架桥提供了 有利条件。 污水中胶体粒子的表面通常带负电荷，当带正电荷的链状生物大分子絮凝 剂或其水解产物靠近胶体表面或被吸附到脱粒表面上时，将会中和脱粒表面上 的一部分负电荷，减少电斥力，从而使胶体间能发生碰撞而凝聚，当胶粒足够 9 第一章前言 大时，因重力的作用而沉降下来。大多数的m b f 由糖类物质组成，并呈负电性， 所以电中和作用在絮凝过程中起的作用比较小，但却不能忽视。通常在絮凝过 程中加入助凝剂c a 2 + ，压缩双电层，或调节p h 值减少m b f 和胶体颗粒之间的静 电斥力，而实现凝聚。 ( 3 ) 卷扫作用( 网捕作用) ：形成小粒絮体的絮凝剂在重力作用下沉降的过 程中， 犹如一个过滤网下降，迅速卷扫水中胶粒产生沉淀。卷扫作用基本是一种 机械作用。r 艾克斯则将絮凝剂的架桥絮凝反应过程归结为3 个阶段：聚合物 在液相中分散；聚合物于界面处吸附；a 界面处吸附的聚合物压缩而产生保 护作用或“胶溶作用”；b 部分覆有聚合物的颗粒相互碰撞，形成架桥。 其中，a 和b 互相竞争，二者竞争的结果取决于絮凝剂的浓度。当溶液 中聚合物浓度高时，会发生胶溶作用，以致无法实现架桥。艾克斯的架桥絮凝 反应过程从机理的角度对“絮凝剂的最适浓度”问题作出解释。 上面这三种絮凝机理学说，分别从不同角度考虑，都只能部分地解释微生 物絮凝剂的絮凝现象，其实微生物絮凝剂( m b f ) 的絮凝过程是非常复杂的， 通常是综合了吸附架桥、电中和、卷扫等作用。m b f 组成成份的差异会使得絮 凝效果及絮凝机理有很大的差别，而由多种菌株发酵而得的复合型微生物絮凝 剂，因菌株之间的协调作用出现了生态位分离而具有比单一菌株更高的絮凝活 性【l3 1 ，其组成成份较单株菌絮凝剂复杂，大量活性基团与颗粒相互作用，使得 絮凝机理更加错综复杂。如复合型生物絮凝剂h i t m 0 2 ，1 7 6 是多糖，5 4 是 蛋白质，它的絮凝机理综合了这三种作用 27 1 。首先，蛋白质是两性电解质，与 颗粒表面带的相反电荷发生中和作用，颗粒之间能够充分地相互靠拢，使得吸 引力成为主要作用力，排斥作用减弱，从而形成密实的絮体，促进颗粒的絮凝 沉降。然后，发酵液中的蛋白质、多肽、多糖等物质为半刚性长链大分子，投 加到水中充分伸展，具有较大空间体积，对水中悬浮粒子具有吸附架桥作用。 最后，形成一种三维网状结构的絮凝体，由于重力的作用下沉，犹如一个过滤 网，迅速网捕和卷扫水中的胶体颗粒，从而产生沉淀分离。 1 0 第一章前言 1 2 5 微生物絮凝剂的研究进展 1 国外微生物絮凝剂的研究现状： 2 0 世纪5 0 年代，人们就发现了能产生絮凝作用的细菌培养液。真正深入研 究，却始于1 9 7 6 年，j n a k a m u r a 等对能产生絮凝效果的微生物进行了研究。至今 发现的具有絮凝性状的微生物种类，有真菌、酵母菌、细菌、藻类等，由它们 产生的微生物絮凝剂类型很多，其中报道最多的主要有：酱油曲( a s p e r g i l l u s s s o j a e ) 产生的a j 7 0 0 2 絮凝剂例、红平红球菌s 1 ( i z h o d o c o c c u se r y t h v o p o l i s s p 1 ) 生 产的微生物絮凝齐u n o c 1 【2 9 1 、拟青霉菌i 1 ( p a e c i l o n u c e ss p i 1 ) 产生的微生物絮凝 剂p f l 0 1 等1 16 1 。其中n o c 1 是目前公认为最好的微生物絮凝剂，能高效地去除猪 尿和粪便等，这一研究表明微生物絮凝剂在废水处理方面实用性很强。1 9 8 5 年 h i r o n k i 、t a k a g i 等对分离出的拟青霉菌i 1 ( p a e c i l o m y c e ss p i 1 ) 所产生的微生物絮 凝剂p f d 0 1 的特性研究表明，它对各种微生物细胞都有絮凝沉淀作用，并可以除 去溶液中几乎所有的悬浮颗粒，包括有机物和无机物。因此，微生物絮凝剂非 特异性的絮凝和沉淀性能使人们越来越关注其应用于废水处理食品行业、生物 制药等方面的具大潜力。国外在微生物絮凝剂研究方面做了大量的工作，如朝 鲜、伊朗和日本就研究发现了一些新的絮凝剂产生斟3 2 1 ，其产生的微生物絮 凝剂有p y 9 0 、a s 1 0 1 、a 9 9 、d p 1 5 2 ，其中比较有代表性的是1 9 9 7 年s u h h h 等人发现的d p 1 5 2 絮凝剂，其首次发现杆状细菌也能产生絮凝剂。2 0 0 1 年， s h i h i l 等【3 3 j 再次发现了一株杆状细菌c c r c l 2 8 2 6 可产絮凝剂，并指出该絮凝剂 的分子量达2 x 1 0 6 ，最适环境为中性。2 0 0 3 年，新加坡国立大学的s d e n t 等【3 4 】从 土壤中分离出一株粘质杆状细菌，其研究了该菌产生的m b fa 9 的组成特性，其 用于处理淀粉废水可使s s 和c o d c r 分别降低8 5 5 和6 8 5 。1 9 9 9 年，关于糖类 以外微生物絮凝剂生产用碳源的第一篇报道【3 5 1 。来自日本国家人类与生物科学 技术研究工业科技机构，他们发现乙醇比葡萄糖和果糖可更有效地产生红平红 球菌s 1 絮凝剂。国外微生物絮凝剂的商业化生产上世纪9 0 年代就开始了。 2 国内微生物絮凝剂的研究现状 我国的微生物絮凝剂发展起步较晚，目前尚处于试验室阶段。上世纪9 0 年 代以来，国内有关的报道也日渐增多，但大多数还停留在菌种筛选阶段，成功 投入生产的报道尚很少。 第一章前言 我国近3 年在对微生物絮凝剂性能方面的探索主要有：程金平【3 6 j 等得出了絮 凝o t j m 1 的最佳絮凝条件；江南大学的h e n i n g ( 何宁) 【3 7 】从土壤中分离出一株谷 氨酸棒杆菌属( c c t c cm 2 0 1 0 0 5 ) ，其产生的m b f 分子量为1 0 5d a ；陈欢【3 副发现 了一种产生胞外多糖絮凝剂s c 0 6 的纤维堆囊菌( s p o r a n g i u mc e l l u l o s u m n u s t 0 6 ) ，s c 0 6 由葡萄、甘露糖和葡萄糖醛酸组成，其比例约为5 ：3 ：1 ，絮凝 活性依赖于阳离子存在，在p h 2 9 范围内絮凝活性稳定；湛雪辉【3 9 】等从污水中筛 选出菌株x h 1 ，其微生物絮凝剂絮凝率近8 6 ，最适p h6 5 7 5 、最适温度为3 0 ； 时红t 4 0 3 禾1 用筛选株t j 3 产生的微生物絮凝剂处理高岭土悬浊液，其絮凝率可达 9 2 4 。 我国科学工作者在对絮凝基因和转基因的研究方面也做了大量的工作，如 中科院微生物研究所的张博润【4 l 】就对酵母絮凝机理研究概况做了论述，何秀萍 对絮凝基团f l 0 1 g 的序列作了测定和分析，江南大学的李寅、何宁【4 2 , 4 3 等研究 了新型蛋白聚糖类生物絮凝剂r e a1 1 的合成途径。 微生物絮凝剂的应用方面的研究主要体现在利用微生物絮凝剂治理废水方 面，近3 年主要有：林俊岳等j 利用一株气单胞菌( a e r o m o n a s s p ) 产生的絮凝剂 a 2 ，可使洗毛废水的c o d c r 去除率达8 5 ，s s 去除率达8 8 ，水颜色由灰黑色 变成红褐液体；黄晓武【4 5 】从生活污水中筛选出霉菌h h e 6 ，其m b f 絮凝率9 8 ， 对城市污水处理浊度达8 8 以上，是一株很有应用前景的絮凝剂产生菌；况金蓉 m j 利用筛选菌产生的微生物絮凝剂处理石化废水效果也很好；邹启贤等【47 】发现 的微生物絮凝剂处理油田外排废水，可使废水f l 向c o d c r 从2 9 7 m g l 1 降至 1 3 4 m g l - 1 ；尹华等【4 8 】利用微生物絮凝剂产生菌a z o t o b a c t e rj 2 5 在味精废水中发 酵产生絮凝剂对石化废水处理效果最好，c o d c r 、s s 及色度的去除率分别为 6 6 7 、9 8 。3 、9 3 7 ；马放【1 3 】等首次提出了复合型微生物絮凝剂这一概念，即 采用廉价底物经过多株菌混合发酵后制得的微生物絮凝剂，并就其对源水的处 理效果作了测定；周旭【4 9 j 研究t p s e u d om o n a s s p g x 4 1 可以利用多种有机废水生 产微生物絮凝剂并着重考察了该菌种在鱼粉废水培养基中合成p s d 1 絮凝剂的 基本特性；张晓辉，龚文琪【5 0 】从某水质净化厂的活性污泥中分离筛选出的3 株絮 凝剂产生菌，其对高岭土和透辉石加工废水的絮凝效果较好，有可能作为新一 代絮凝剂用于建材非金属矿加工废水的处理；卢文玉【5 l 】等研究了内蒙天然碱碱 泥絮凝用微生物絮凝剂的最适宜产生条件【5 2 】并利用正交实验得出培养基成分最 佳配比。 1 2 第一章前言 微生物絮凝剂在食品和发酵、医药等方面的应用报道较少，袁其明、张怀 5 3 】 经研究分析得出微生物絮凝剂用于低聚木糖脱色的最佳用量；勒艳、白凤武m 】 等使用原生质融合技术得到既有良好的发酵性能又具有强的自生絮凝性能的融 合株s p s c ，其最适温度3 4 3 8 0 c ，耐受最高温度4 0 ，最适；p h3 5 , - 4 5 ；李东侠 等【5 5 采用酵母细胞自絮凝形成颗粒作用细胞固定化方法在有效容积1 5l 小型悬 浮床生物发应器中，研究了不同酒精废液循环比条件下的连续发酵供应过程， 并探讨了酒精精馏废液全循环的可行性；陈海昌等【5 6 】利用原生质融合技术培育 出了既有较高发酵度又有较强絮凝性的啤酒酵母f p 1 9 等。 1 2 6 微生物絮凝剂的应用 生物絮凝剂作为一类新型絮凝剂，其广谱的絮凝活性，可生物降解性及应 用安全性显示了它在水处理和其它相关工业等方面的应用前景。 1 在污水处理中的应用： 微生物絮凝剂在废水处理中应用范围很广，它可以应用于城市生活污水、 建材和焦化废水、畜产废水、食品工业废水、塑料工业废水、电镀废水等处理 中 5 卜5 9 1 。并且微生物絮凝剂在染料废水的脱色处理中效果非常好，用 p a l c a l i g e n e s8 7 2 4 菌株产生的絮凝剂对造纸黑液和氯霉素生产废水等颜色较深 的废水进行脱色处理，其脱色率可分别达到9 5 和8 。黄民生等在污水处理厂 的回流污泥中分离、筛选出了3 株絮凝剂产生菌，该菌株所产培养液可使土壤悬 浊液去浊率达9 9 以上，使碱性染料废水c o d 去除率达到7 0 左右，色度去除率 达9 2 左右。另有絮凝剂n o c 1 处理畜产废水1 0 m i n 后，t o c 和t n 的去除率分别 为7 0 和4 0 t , w j 。 2 重金属离子的富集和去除： b a c i l l u s c e r e u s 被成功地用于黄金、白钨矿以及其它矿物质等贵重稀有金属类 化合物的富集提取。除此之外，很多絮凝剂产生菌都具有吸附重金属离子的能 力，如处于非生长状态的z o o g l o e a1 1 5 能吸附高浓度重金属( c 0 2 + 、c u 2 + 、f e ”、 n i 2 + - ) ( 3 0 0 、8 0 0m g , l 1 ) ；有研究发现【6 l 】，颤蓝菌属产微生物絮凝剂能够除去水体 中m n 2 + 、p b 2 + 、c d 2 + 、c u 2 + 、z n 2 + 、c 0 2 + 、c ，和f e 3 + 。p 1 d e n i t r i f i c a n s 平l l z l f i l i p e n d u l a 也具有吸附多种重金属离子的能力。尽管目前此类文献报道仍然较少，但将生 物絮凝剂用于重金属的富集这一领域却具有很大的可开发空间。 第一章前言 3 乳化液中的油水分离： 向一些乳化液中投加特定的微生物絮凝剂，可在一定程度上使油水分离。 广泛产碱菌a l c a l i g e n e s l a t u s 的培养物能够在酸性棕榈油一水表面形成可见油层， 使下层清液中的c o d 降 氐2 1 5m g l 一，除油效果远高于有机、无机和高分子絮凝 剂 6 2 】。 4 给水和饮用水处理： 微生物絮凝剂用于净化饮用水的优点在于它不但用量少，而且去除水体浊 度效率高，沉淀物过滤性好。m i a g u i l a r 等【6 3 发现利用微生物絮凝剂处理河水和 湖泊水时，絮凝后所形成的胶团大、密实度高、沉降快，上清液的剩余浊度低， 对c o d 的去除率也远高于海藻酸钠明胶絮凝剂。更重要的是m b f 是一类天然高 分子有机物，经它处理后的水体对人体无毒副作用。 5 活性污泥沉降性能的改善： 活性污泥处理系统的效率常因污泥的沉降性能变差而降低，微生物絮凝剂 能有效地提高整个处理系统的效率。如将由红平红球菌制得的微生物絮凝剂 n o c 一1 加入到已膨胀的活性污泥中，可以使污泥容积指数从2 9 0 下降到5 0 ，并 且在污泥沉降性能得到恢复的同时不会降低有机物的去除效率畔】。 1 2 7目前微生物絮凝剂研究中仍存在的问题 毋庸置疑，微生物絮凝剂在处理废水方面有着突出的优越性，它的大规 模生产和应用将有广阔的市场前景。但是从规模化生产和废水处理角度看，目 前国内外的微生物絮凝剂研究还存在着如下问题： ( 1 ) 研究水平低。大多数学者从自然界筛选高效的絮凝剂产生菌，研究其 絮凝性能，而对优良的絮凝剂产生菌诱变育种和基因控制方面缺乏研究，且研 究停留在实验室阶段。 ( 2 ) 制备成本高