原核生物RNA的转录PPT课件.ppt

基本概念 原核生物转录起始 RNA聚合酶 启动子 转录的基本过程 真核生物转录起始 RNA聚合酶 启动子 转录的基本过程 真核生物转录后的加工 原核生物与真核生物mRNA的特征比较 RNA合成与DNA合成异同点 1 第一节若干基本概念 2 基因表达的第一步 以D S DNA中的一条单链作为转录的模板 在依赖DNA的RNA聚合酶的作用下进行的 模板单链DNA的极性方向为3 5 而非模板单链DNA的极性方向与RNA链相同 均为5 3 书写基因序列时 仅写非模板序列 可不注明极性方向 3 RNA的转录包括promotion elongation termination三过程 从启动子 promoter 到终止子 terminator 称为转录单位 transcriptionalunit 转录原点记为 1 其上游记为负值 下游记为正值 4 转录的不对称性 在RNA的合成中 DNA的二条链中仅有一条链可作为转录的模板 称为转录的不对称性 编码链与模板链 与mRNA序列相同的那条DNA链称为编码链 将另一条根据碱基互补原则指导mRNA合成的DNA链称为模板链 5 模板链并非永远在同一条单链上 6 第二节原核生物的转录 一 原核生物转录的分子基础 二 转录的起始 延伸 三 转录的终止 四 转录的抗终止 7 一 原核生物转录的分子基础 一 RNA聚合酶 1 E coli的聚合酶负责所有mRNA rRNA和tRNA的合成 一个E coli细胞中约有7000个RNA聚合酶分子 任意时刻大概有2000 5000RNA聚合酶在合成RNA 2 E coli的全酶是一个质量约465kD的分子 由两个 亚基及一个 因子所组成 其中 亚基构成了核心酶 加上 因子之后便构成了全酶 即 全酶 核心酶 因子 8 9 1 亚基的功能 当噬菌体T4感染E coli时 宿主 亚基被糖基化修饰 修饰导致了原来被全酶所识别的启动子亲和力下降 这就提示 3 各亚基的功能 亚基在启动子识别中起作用 10 亚基的作用 位于前端的 因子使双链解链为单链 位于尾端的 因子使单链新聚合为双链 11 2 亚基 重复使用 Reusable 使Holo enzyme识别启动子 并与模板链结合 RNA链合成达8 9个碱基时 因子释放 离开核心酶 由核心酶负责延伸 因子能够保证细菌RNA聚合酶稳定地结合到某个特异的 唯一的DNA启动子上 12 例如 正常情况下负责大多数基因转录的是 70 但 32和 E在环境变化 热激 时被表达 28用于正常生长时鞭毛基因的表达 在大肠杆菌中 存在多种 因子 不同的 因子可以识别不同的启动子序列 从而可以启动不同基因的表达 13 大肠杆菌的热激应答基因的表达的调控是通过 32实现的 温度升高时 32数量增加 而温度恢复 32活性降低来完成诱导 32合成的基本信号是温度增加导致未折叠蛋白质 部分变性蛋白质 在细胞内累积 另一组热调控基因的表达是由 E因子控制 它负责对比 32更剧烈的温度变化应答 它是由热变性蛋白质的积聚所诱导的 大肠杆菌细胞含有少量 54 当培养基中缺乏氮时被激活 在这些情况下 基因被开启以便利用可替代氮源 14 因子 促进RNApol NTP RNAelongation 完成NTP之间的磷酸脂键的连接 与Rho 因子竞争RNA3 end 15 因子 强碱性亚基 促使RNA聚合酶与有义链 sensestrand 的结合 16 总结 HoloEnzyme含有的功能位点 sensestrandDNAbindingpoint DNA RNAhybridsite D S DNAunwindingpoint D S DNArewindingpoint 17 18 总结 大肠杆菌RNA聚合酶的组成分析 19 RNA聚合酶与DNA聚合酶的区别 20 二 启动子 1 启动子的发现方法 21 大肠杆菌RNA聚合酶全酶所识别的启动子区 22 通过比较不同基因的启动子序列 发现细菌具有四个保守位点 起始位点 10区 35区以及 10和 35区之间间隔距离 2 原核生物启动子的特点 1 起始位点通常 90 都是嘌呤碱基 该碱基左右两侧的碱基通常是C 左侧 T 右侧 即 组成CAT序列 启动子定义 指能被RNA聚合酶全酶识别 结合并启动基因转录的一段DNA序列 23 2 在起始位点上游 在几乎所有的启动子中都可以发现一个6bp的区域 六聚物的中心通常靠近起始点上游的10bp 该区称为 10区 它的同源序列为TATAAT 可被总结为如下形式 T 80 A 95 T 45 A 60 A 50 T 96 其中 数字表示碱基出现最大频率的百分数 该区又称为PribnowBox 10序列中开始的高度保守的TA和最后一个几乎完全保守的T是最重要的碱基 24 3 TTGACA区 大肠杆菌启动子中另外一个保守区是以起始位点上游 35bp为中心的 称 35区 其共有序列为TTGACA 各碱基出现的频率为 T 82 T 84 G 78 A 65 C 54 A 45 其中括号数字表示该碱基出现的频率 该区又称为SextamaBox 25 4 在90 启动子中 35和 10区之间的分隔距离在16到18bp之间 其中最适距离为17bp 这个距离对于启动子启动基因表达效率是最佳的 个别例外的可以小于15或者大于20bp 尽管间隔区的真实序列并不重要 但间隔距离大小可以保持两个区恰当的距离 从而使两个区适合于RNA聚合酶的几何结构 所以可以增加启动子的启动效率 26 原核生物启动子的结构 27 典型启动子的结构 35 10转录起点TTGACA16 19bpTATAAT5 9bp 28 3 SextamaBox与PribnowBox的功能 2 10区序列的突变不影响转录闭合复合体的形成 但是其向转录开放复合体的转变变慢 1 两个区功能的研究方法 利用碱基突变来验证序列功能 该结果表明 10区序列组成了启动子的 解旋域 Unwindingdomain 29 3 35区序列的突变使转录闭合复合体的形成速度减慢 但并不抑制其转变为转录开放复合体 因此 35区序列的功能是为RNA聚合酶的识别提供信号 因此 可以将 35区序列看作是 识别域 Recognitiondomain 30 2019 12 27 31 32 4 Promoter与 factor间的作用 二者结合的专效性决定了某个启动子是strongpromoter还是weakpromoter 33 34 二 原核生物基因转录的起始过程 1 全酶结合到启动子序列上 形成一个闭合 Closed 的二元复合物而开始反应 2 与酶结合的一小段DNA序列的 溶解 导致了闭合复合体转变为开放 Open 复合体 对于强启动子来说 闭合复合体向开放二元复合物的转变是不可逆转的 一 转录的起始 35 3 第三步是最开始的两个核苷酸之间的连接 在它们之间会形成一个磷酸二酯键 这样 所产生的三元复合物 Ternarycomplex 就包括RNA DNA 聚合酶 4 当起始过程完成后 聚合酶释放出 因子而转变为核心酶 后者和DNA 新生RNA组成延伸三元复合物 接下来加入的前九个核苷酸 聚合酶是一直不移动的 产生一条短RNA链 直到九个碱基为止 九个碱基中的任何一个加入后 聚合酶都有释放RNA的可能性 导致流产起始 Abortiveinitiation 但流产起始之后聚合酶又开始合成第一个碱基 流产起始常常产生一系列短的寡聚核苷酸 2 9个碱基 36 总结 转录的起始 转录延伸之前 RNA聚合酶要经过数个步骤 闭合二元复合物转化为开放二元复合物 开放二元复合物再转化为三元复合物 37 二 起始过程中的RNA聚合酶的形态变化 1 当RNA聚合酶全酶最初结合到DNA上时 它覆盖了从 55到 20大约75 80bp的长度 38 2 伴随 因子的失去 聚合酶与 55到 35的结合也失去 仅剩下约60bp的DNA被聚合酶所覆盖 这说明 启动子的上游部分仅参与RNA聚合酶的起始识别 起始以后便不再起作用 39 3 当RNA链延伸到15 20个碱基时 酶会发生进一步的形态变化 转变成负责转录延伸的复合体 仅覆盖30 40bp长度 40 RNA聚合酶首先与 55到 20之间的区域接触 当 因子解离下来后 核心酶与 30左右的序列结合 接着核心酶向前移动 结构逐渐致密并最终形成延伸复合物 总结 转录起始过程中复合物的变化 象蠕虫一样移动 41 三 转录的延伸 因子释放后 进入链的延长阶段 1 RNA合成在一个 转录泡 Bubble 中进行 在转录泡中 DNA被瞬间分离成单链 其中一条被作为RNA合成的模板 当RNA聚合酶沿DNA移动时 空泡也随之移动 42 RNA链的延伸 3 5 RNA DNA杂交螺旋 聚合酶的移动方向 新生RNA 复链 解链 有义链 模板链 反义链 DNA 43 RNA链的合成方向5 3 各种结果表明 RNA DNA杂交区的长度在3 9个碱基对之间 44 所有核苷酸的合成都是从游离核苷酸的5 三磷酸基团与RNA链末端的3 OH之间的缩合反应 新加入核苷酸失去末端的两个磷酸基 和 其 磷酸基与RNA链形成磷酸二酯键 这个反应发生在催化位点 2 磷酸二酯键的形成 45 37 时反应速度约为每秒40个核苷酸 细菌RNA聚合酶 这与翻译的速度 每秒15个氨基酸 大致相同 RNA聚合酶控制着下一个核苷酸的加入 该酶可能仅当一个核苷酸与模板形成氢键互补配对时才允许磷酸二酯键的形成 如果该核苷酸与模板不匹配 则将其去除 接着另一个核苷酸加入 3 延伸的速度 4 核苷酸加入的控制 46 四 细菌RNA转录的终止 1 一旦RNA聚合酶开始转录 酶就沿模板向前移动合成RNA 直到遇到一个终止子 Terminator 聚合酶停止向正在生长的RNA链添加核苷酸 释放合成的RNA产物 从DNA模板上解离 终止子 是RNA聚合酶停止RNA转录的一段DNA序列 终止过程需要所有维持RNA DNA杂交的氢键断裂 然后DNA重新形成双螺旋 47 2 根据体外实验中RNA聚合酶是否需要辅助蛋白质参与终止 可将E coli中的终止子分为两种类型 在体外 没有任何其它因子参与 核心酶也能在某些位点终止转录 这些位点被称为 内源性终止子 Intrinsicterminator 因子依赖型终止子 体外需要 因子的辅助 突变实验显示体内该因子参与了终止过程 48 1 内源性终止子 A 终止子的结构特点 内源性终止子有两个明显的结构特点 一个二级结构中的发夹结构和转录单位最末端的连续约6个U残基的区段 这两个特点都是终止所必需的 发夹的基底部通常包含一个富含G C区 发夹和U区段的典型距离为7 9个碱基 有时U区段可以插有其它碱基 49 终止子内部包含能够形成7 20bp长度发夹结构区 茎环结构有富含尿嘧啶核苷酸的G C区 内源性终止子的结构 50 B 内源性终止子终止的机理 RNA聚合酶遇到发夹结构时 RNA转录产物合成速度会减慢 或者是暂停 正确位置的一段U残基是RNA聚合酶遇到发夹而暂停时从模板解离下来所必需的 rU dA RNA DNA杂交 是一个不常见的弱碱基配对结构 对它的破坏所需能量最少 当聚合酶暂停时 RNA DNA杂交链从终止区的弱键rU dA处解开 51 依赖型终止作用所需的序列长50 90个碱基 该区域的共同特征是RNA富含C残基而G残基很少 可以在新合成的RNA中形成松散的发卡结构 一个 依赖型终止子的终止效率随 富C 少G 区域的长度而增加 A 终止子序列特征 2 依赖型终止子 52 因子是 基因编码的蛋白质 是一种酶 它具有ATPase的活性和解链酶的活性 6聚化的 因子在水解ATP的情况下 它沿着5 3 方向转录物的3 端前进 直到遇到暂停在终止点位置的RNA聚合酶 因为该区有发卡结构 导致聚合酶的暂停 随后 因子通过解链酶的活性解开转录泡 transcriptionbubble 上的RNA DNA形成的杂交双螺旋 使RNA转录物得到释放 从而终止转录 B 因子终止机理 53 B 依赖 因子的终止模型 因子 六聚体蛋白 水解各种核甘三磷酸促使新生RNA链从三元转录复合物中解离出来 从而终止转录 54 因子沿着RNA追赶聚合酶 当聚合酶在依赖于 因子的终止子处作短暂停顿时将其捕获 从而导致转录终止 55 总结 转录的基本过程 56 五 抗终止 1 抗终止作用 是在抗终止因子的帮助下 RNA聚合酶跃过终止子通读后续基因的能力 抗终止作用决定RNA聚合酶在终止子位点处终止还是通读下去 57 2 抗终止的意义 抗终止 Ant