（环境工程专业论文）马拉硫磷降解菌的筛选及对马拉硫磷的降解.pdf

摘 要 农药在环境中的残留及污染全世界普遍关注的问题， 而我国是马拉硫磷生产 和使用大国，使用范围广、使用数量多，加上本身水溶性相比较大的特点，现已 对不同地区土壤与水造成了污染。基于对人类健康和环境的威胁，马拉硫磷在环 境中的残留分析和降解研究，具有实际应用价值。围绕马拉硫磷降解问题，本实 验主要研究以下内容。 1. 从模拟长期使用马拉硫磷农药的土壤中用摇瓶培养富集法和土壤直接富 集法筛选并分离出能够降解马拉硫磷的菌株，共分离出菌株 312 株。 2. 由于分离出的 312 株菌株在选择培养基固体平板上（含有 500 mg l-1马 拉硫磷的无机盐培养基）没有明显的生理特征变化来显示马拉硫磷的降解，所以 利用气相色谱逐个测定分离出的菌株活性。测定结果显示，有 4 株菌株对马拉硫 磷有降解活性，菌株编号分别为 b20、i2、i4、l19，采用 20 mg l-1马拉硫磷作 为唯一碳源时， 在 48 h 内的马拉硫磷降解率分别为 8.9%、 15.4%、 27%和 87.32%。 3. 经形态、生理生化分析，将 b20、i2、i4 和 l19 这 4 株高效降解菌株分 别鉴定为气单胞菌属（aeromonas）；埃希氏菌属（escherichia）；微球菌属 （micrococcus）和短波单胞菌属（brevundimonas sp.）。经 16s rdna 序列分析， l19与基因登录号为ab021415 (brevundimonas diminuta)的同源性达98,初步鉴 定 l19 菌株是缺陷短波单胞菌（brevundimonas diminuta） 4. 对 l19 菌株的降解特性进行了研究: 在 20 mg l-1、30、ph6.5 条件下， l19 菌株 48h 对马拉硫磷降解率达 87.32%，马拉硫磷农药降解率与降解时间呈 正相关。 5. 研究了 l19 菌株的最适生长条件， 通过温度单因素试验， 从 15 、 20 、 25 、30 和 35 5 个温度中确定 l19 菌的最适生长温度为 25 ；通过 ph 单因素试验， 从 ph 6.0、 ph 6.5、 ph 7.0、 ph 7.5 和 ph 8.0 等 5 个 ph 中确定 l19 菌的最适生长 ph 为 7.0； 关键词关键词：马拉硫磷，缺陷短波单胞菌，筛选，鉴定，降解特性 abstract the residue and pollutant of pesticides were attended by the whole world. the malathion that are produced and used in large scale in china, has caused pollution in different regions of soil and water due to its widely use scope, excessive quantity and much larger water-solubility than other pesticides. based on the threaten to the health of human beings and the environment, the study of the residue and degradation of malathion were significantly. on the degradation of malathion, the following contents were performed in the present thesis. 1. a total of 312 strains degrading chlorpyrifos were screened and isolated from soils simulated with residual malathion for a long time. 2. as the isolated 312 strains in selective medium plate (containing 500 mg l-1 malathion) did not show significantly the physiological characteristics change to indicate the degradation of malathion, gas chromatography (gc) was used to determine the degradation activity of the isolated strains one by one. the results showed that 4 strains, named as b20、i2、i4、l19, had ability to degrade malathion. when 20 mg l-1 malathion was used as the only carbon source, the degradation rates of malathion were 8.9%, 15.4%, 27% and 87.32% for the 4 stains within 48h, respectively. 3. by morphological, physiological and biochemical characteristics of the strain b20, i2, i4 and l19, were identified as aeromonas sp, escherichia sp, micrococcus sp and brevundimonas sp, respectively. strain l19 was identified as brevundimonas diminuta according to 16s rdna sequence analysis. 4. the degradation characteristics of strain l19 were studied. under the condition of 30, ph6.5, malathion of 20mg l-1 and shaking at 160 rmin-1, the degradation rate of l19 strain for malathion was 87.32% after cultured for 48h. the degradation ability of strain l19 on malathion was positively correlated to inoculated amount. 5. the optimal growth condition of strain l19 was studied. the optimal growth temperature and ph was studied by single-factor test, with tests of the temperature from 15, 20, 25, 30 to 35, and acidity from ph 6.0, ph 6.5, ph 7.0, ph 7.5 to ph 8.0. finally, the optimal growth conditions were determined as 25and ph 7.0 respectively. key words: malathion, brevundimonas diminuta, screening, identification, degradation characteristi 英文缩写词 缩写词 英文全称 中文全称 mg/l milligram/litre 毫克/升 ecd electronic capture detector 电子捕获检测器 fpd flame photometric detector 火焰光度检测器 gc gas chromatography 气相色谱 hplc high performance liquid chromatography 高效液相色谱 lle liquid-liquid extraction 液-液萃取 lpme liquid-phase microextraction 液相微萃取 mid multiple ion detection 多离子检测 mlle micro liquid-liquid extraction 液-液微萃取 mmlle microporous membrane liquid-liquid extraction 微孔膜液-液萃取 ms mass spectrum 质谱 od optical density 光密度 pcr ploymerase chain reaction 聚合酶链式反应 r/m revolution/minute 持久性有机污染物 spe solid phase extraction 固相萃取法 spme solid phase microextraction 固相微萃取 epa environmental protection agency 美国环保局 1 文献综述文献综述 1 有机磷农药简介 自 20 世纪 60 年代以来许多国家开始限制或禁止使用有机氯农药。 有机磷农药具 有药效高、品种多、防治范围广、成本低、选择作用高、药害小等特点，作为有机氯 的替代农药迅速在国内外大量生产和使用。 因为有机磷农药残留也带来严重的负面影 响，农药残留不仅会改变土壤的正常结构和功能，还会减弱土壤的正常生产能力。残 留在蔬菜、水果、粮食中的有机磷农药通过食物链富集在动植物体内蓄积，导致机体 正常生理功能失调，进而引起病变。有机磷农药残留问题也严重影响农产品的出口， 我国因“绿色壁垒”而被退回的农产品每年可达数十亿美元1。随着人类生活质量的不 断提高和环保意识的逐渐增强，有机磷农药的残留问题已越来越引起人们的关注，如 何消除有机磷农药对环境和人类的危害， 已成为关系人类健康和国民经济发展的重大 科学问题2。已有关于采用植物修复有机磷农药残留的研究，但是植物对生长环境的 要求相对较高，修复效率较低，应用还非常有限2。目前，研究主要集中在采用微生 物降解有机磷农药残留。 2 马拉硫磷的应用 马拉硫磷是一种低毒的有机磷杀虫剂，具有特殊的令人不愉快的气味，无色油状 液体， 分子式c10h19o6s2p， 其结构式如图1分子量330.35， 熔点2.83.7， 沸点120， 密度 1.4985，在水中的溶解度为 145mg/l3,4。 图 1 马拉硫磷结构式 马拉硫磷是一种接触杀虫剂，1980 全国推广防虫磷（马拉硫磷） ，70%优质马拉 硫磷乳油用于防治稻谷、玉米、小麦、大麦、高粱原粮的仓储害虫，对于控制农村储 粮与种子的严重虫害、提高国库虫害的综合防治、减少使用高毒熏蒸剂等方面发挥了 积极作用。直到现在，马拉硫磷和其混剂仍是粮食储藏中使用较多的谷物保护剂之一 5-7。 2 马拉硫磷对于玉米、小麦、高粱和许多其它禾本科农作物，特别是大米的主要害 虫中华稻蝗具有很好的触杀作用8-11。45%马拉硫磷乳油用于水稻，小麦，棉花、茶 树、蔬菜、果树、豆类等作物害虫的防治，减少了农业生产中的损失。 马拉硫磷还可用于防治蔬菜黄条跳甲、蚜虫、林木蝗虫、果树蝽蟓、蚜虫、茶树 长白蚧、象甲、棉花盲蝽蟓、蚜虫、水稻飞虱、蓟马、叶蝉、小麦黏虫、蚜虫、豆类 食心虫、造桥虫等多种害虫。近年来，有关马拉硫磷产品的登记较多。 3 马拉硫磷的生态毒理及在环境中的残留 3.1 马拉硫磷的生态毒理 尽管马拉硫磷被普遍认为是低毒杀虫剂， 但由于马拉硫磷的两个代谢产物马拉氧 磷和异马拉硫磷的毒性很高，美国环保局(epa)认为马拉硫磷具有潜在的污染地下水 的可能12。del-rahman13等将成年大鼠暴露于常用剂量的马拉硫磷中，发现短期内 不会产生明显的迹象，但是长期对神经具有毒性，可能诱发显着神经元病变。giri 等 14通过小鼠实验研究发现马拉硫磷是一种潜在的生殖细胞诱变剂。 plumb j15等证实 马拉硫磷抑制了鲶鱼的免疫功能。 舒静波16-17等检测结果显示接触马拉硫磷可使作业 工人的体液免疫功能、细胞免疫功能发生改变。betancourt m18利用猪的精子证明马 拉硫磷比二嗪磷和阿特拉津更能抑制精子的活力，甚至导致精子死亡。espinoza19 实验说明马拉硫磷可能减少男性体重与精索生存能力，抑制受精囊细胞增殖，并修改 精原细胞 dna 结构。 3.2 马拉硫磷在环境中的残留 按国家标准gb5127-1998 食品中敌敌畏、乐果、马拉硫磷、对硫磷最大残留限 量标准 ，在蔬菜、水果、食用油中最大残留量均不得检出马拉硫磷，但马拉硫磷残 留比较普遍。 中山市 2005 年蔬菜中有机磷农药残留量超标率为 30.1%， 其中马拉硫磷为 0.3%， 残留值为 0.0530.27mg/kg20-21。澳门地区 20002003 年市售叶类菜有机磷农药残留 检测显示，叶类菜残留马拉硫磷不合格率为 1.3%、2.2%、4.2%、1.6% 22。马拉硫磷 残留超标占 2005 年深圳市蔬菜有机磷农药残留超标样品的 14.29%23。 王凌等 2007 年发现莱州湾海域马拉硫磷含量为 29.1ng/l，虽然处于可接受的范 围，但其风险值已达到超过人们所能接受范围的边界，引起有关部门重视24。2007 年广西北海市海产品中有机磷农药残留调查显示：鱼类干海产品检出率为 21.2%，活 海产品检出率为 4.8%，鲜海产品检出率为 6.8%，甲壳类干海产品检出率为 25.0%， 软体类活海产品检出率为 8.3%，鲜海产品检出率为 6.3%，干海产品中有机磷农药残 3 留检出情况比较严重，引起高度重视25。 郭帅等 2008 年对济南市 9 个大型农贸市场销售的卷心菜、 小白菜、 菠菜、 青椒、 黄瓜、豆角、韭菜、花椰菜进行采样，发现存在多种农药残留严重超标的现象，有机 磷农药总检出率为 32.66%，总超标率为 25.63%，其中韭菜中马拉硫磷的检出率和超 标率分别为 5.65%和 4.44%26。 马晓艳等 2009 年从苏州市售 586 件蔬菜样品中共检测出甲胺磷、马拉硫磷等 7 种有机磷农药残留，残留情况比较严重的品种为包菜、花菜、韭菜、小青菜、菠菜、 小白菜，部分品种为复合农药残留。在所选蔬菜样品中，有机磷农药总检出率为 20.6%，总超标率为 15.2%，其中马拉硫磷超标率为 1.02%27。 马拉硫磷不仅在蔬菜、水体中被频频检出，在土壤中的残留也是不容忽视：2008 年周婕成等实验表明上海崇明农田土壤中，有机磷农药的残留量在 0.100.69mg/kg， 其中马拉硫磷检出率为 42.86%28。 4 农药提取技术 4.1 液-液分配萃取 液-液分配萃取法，即两相溶剂提取，是利用混合物中各组分在两种互不相容的 溶剂中分配体系数的不同而达到分离目的的方法。萃取剂应有良好的化学稳定性，不 易分解和聚合，且毒性应尽可能小。常用的萃取溶剂有石油醚、二氯甲烷、氯仿等。 萃取时溶剂用量第一次应稍多些，一般为水溶液的 1/3，萃取次数为 35 次。本实验 利用马拉硫磷在有机溶剂石油醚中溶解度大于在水中溶解度的性质， 在水相中加入与 水互不相溶的有机相石油醚，充分振荡后使得农药从水相中被提取到有机相中。液- 液分配萃取法是天然有机化合物分离常用的方法， 特别是如果已经知道要得到的目的 化合物结构时，可以相似相溶原理选择合适的萃取剂把目的化合物萃取出。常用萃取 分离剂小极性的有石油醚、苯等；中极性有氯仿、乙醚等；大极性的有正丁醇，乙醇 等。该方法具有简单易行等优点，是提取水体样品中农药的主要方法29。 液-液分配萃取， 分为液-液萃取(liquid-liquid extraction, lle)、 液-液微萃取(micro liquid-liquid extraction, mlle)、微孔膜液-液萃取(microporous membrane liquid-liquid extraction, mmlle)和液相微萃取(liquid-phase microextraction, lpme)等方法。 液-液微萃取法30-31 (mlle)是对传统的液-液萃取法的改进，不仅具有传统液-液 萃取法操作简单的优点，而且减少了有机溶剂使用量。 微孔膜液-液萃取32-33(mmlle)，在环境样品中的应用可分为三类：以扁平膜为 基础的支撑液膜萃取（supported liquid membrane extraction, slme）和微孔膜液液萃 取（microporous membrane liquid-liquid extraction, mmlle）,以中空纤维膜为基础的 4 液相微萃取（hollow fibre-based liquid phase microextraction, hflpme） 。该法与传统 的液-液萃取具有相同的原理，对于复杂的环境样品，mmlle 的高选择性、高净化 效率更具优势。 。 mmlle 和目前被广泛用于样品前处理的 lle 和 spe 相比， mmlle 的优点是有机溶剂用量少，选择性高，净化效率高且获得的萃取物中干扰物质少，富 集倍数高，操作简单，可实现自动化且易于与其它分析仪器联用。 液相微萃取31, 34 (lpme)或溶剂微萃取（solvent microextraction, sme） ，是 1996 年发展起来的一种新型的样品前处理技术,液相微萃取技术是在液液萃取的基础上发 展起来的，与液液萃取相比，lpme 可以提供与之相媲美的灵敏度，甚至更加的富集 效果，同时，lpme 集采样、萃取和浓缩于一体，灵敏度高，操作简单快捷，lpme 又分为直接液相微萃取（direct liquid-phase microextraction, direct-lpme） ，适合于萃 取成份较单一的样品；液相微萃取（liquid-phase microextraction with back extraction, lpme） ，适用于萃取含量较少的样品；顶空液相微萃取（head space liquid-phase microextraction, hs-lpme） ，把有机溶剂悬于样品的上部空间而进行萃取的方法，使 用与挥发性或半挥发性有机化合物。 除了上面介绍的 mlle、 mmlle 和 lpme 萃取技术外， cflle(continuous flow liquid-liquid extraction)35和 pc-hfme(polymer-coated hollow fiber microextraction)36 提取技术也被用于水体中农药的提取。 4. 2 固相萃取 固相萃取法(solid phase extraction, spe)是 2 近年发展起来的一种样品前处理技 术，由液固萃取和柱液相色谱技术相结合发展而来。主要用于样品的分离、纯化和浓 缩，与传统的液液萃取法相比可以提高分析物的回收率，更有效的将分析物与干扰物 分离，减少样品预处理过程，操作简单、省时、省力。固相萃取大多数用来处理液体 样品，萃取、浓缩和净化其中的半挥发和不挥发性化合物，也可用于固体样品，但必 须先处理成液体。spe 装置有 spe 柱(spl cartridge)和辅件构成，spe 柱由柱管、烧 结垫和填料。spe 辅件一般有真空系统、真空泵、吹干装置、惰性气源、大容量采样 器和缓冲瓶。 该萃取法有如下优点：防止交叉污染；有机溶剂的低消耗；可配大容量采 样器、 快速浓缩干燥装置； 可以得到高纯度和浓缩的分离物； spe 小柱质量稳定， 样品回收率高，精密度好。 自 marble lk37首次将固相萃取技术应用于农药残留分析领域， 该法已成为应用 最广泛的水体中有机污染物分析前处理方法，随着技术的进步，固相萃取的提取效率 和范围也不断的得到发展38-39。 5 农药分析检测技术 5 农药残留检测是一项对复杂混合物中残留组分的分析技术， 农药残留的检测方法 很多， 传统的农药残留检测方法有比色法和容量法， 存在选择性差、 灵敏度低等缺陷； 近年来发展较快比较常用的的仪器分析方法有气相色谱法(gas chromatography，gc)， 高效液相色谱法(high performance liquid chromatography, hplc)；除此以外还有质谱 法，色谱-质谱联用等。 5.1 气相色谱法 气相色谱法是色谱法的一种，由于固定相不同，可以分为两种，用固体吸附剂做 固定相的叫气固色谱，用涂有固定液的担体作固定相的叫气液色谱。按色谱分离原 理来分，气相色谱法亦可分为吸附色谱和分配色谱两类，在气固色谱中，固定 相为吸附剂，气固色谱属于吸附色谱，气液色谱属于分配色谱。按色谱操作形 式来分，气相色谱属于柱色谱，根据所使用的色谱柱粗细不同，可分为一般填 充柱和毛细管柱两类。 气相色谱具有精密度好、准确度和灵敏度高等优点，从 20 世纪 60 年代开始一直 被用于农药残留分析。随着毛细管柱代替填充柱的技术改进，用一根毛细管色谱柱同 时分离几十种农药已经实现；ecd（electronic capture detector，电子捕获检测器）等 高灵敏度检测器的应用，使农药痕量分析得到迅速发展，气相色谱最低检出限量可达 到 ng 和 pg 级。 马拉硫磷的熔点为2.85 ，沸点为156-157 (93.3pa)，蒸汽压为5.3310-3 pa(30 )，较容易气化，可以用气相色谱法进行测定。王江荣等40色谱条件使用的 是玻璃填充柱内装经二甲基二氯硅烷处理、 涂布了非极性或弱极性混合固定液的硅藻 土, 进样口温度220, 检测器240 ,柱温180 , 在此条件下, 马拉硫磷最低检出质 量比范围为0.010.03 mg/kg 万丽兵41等采用脉冲不分流进样模式，gc-fpd 法分析，外标法定量。方法检 测限为0.016 滋g/l；加标水平为1.00 滋g/l时，实际样品回收率为83.794.2% 火焰光度检测器只对硫、磷化物有信号,俗称硫磷检测器。翁炳贵1等hp - 5890 型气相色谱仪、 ecd 检测器、 石英柱(30m 0. 32mm) 色谱柱， 载气流速: 2. 0ml/ min , 汽化室温度: 220 ,色谱柱温度: 190 , 检测器温度: 220 , 柱头压:100kpa ,分流比: 1 :15 ,进样量:0. 5ul 。方法的最低检出浓度为:马拉硫磷0. 003mg/ l 5.2 高效液相色谱法 高效液相色谱法，适用范围较广，对于色相色谱不能测定的难挥发性的物质也具 有很好的检测效果。 姜燕42等ods-c18 柱（250mm 4.6mm）作为色谱分离柱，80甲醇：20水 （v/v）为流动相，流速为1.0ml/min，检测波长为220nm 的紫外检测器。研究结果 表明，在10-100mg/l 浓度范围内峰面积与进样量呈良好的线性关系，相关系数r 6 0.9999；检出限为6.5g/l（s/n3） 王岙43等采用tc2c18柱, 以甲醇和水体系为流动相, 建立了高效液相色谱法同 时测定水体中马拉硫磷的方法，方法检出限为马拉硫磷0. 00366mol/l。 5.3 离子迁移色谱仪 离子迁移谱仪( ion mobility spectrometer， ims) 适合应用于痕量物质的现场快速 检测，具有便携灵敏度高的优点。了采用便携式离子迁移谱仪( ims) 对敌敌畏和马 拉硫磷进行快速检测的分析方法。王建凤44等在大气压条件下，以63ni作为电离源， 干燥洁净的空气作为载气和迁移气，采用负离子模式进行操作，气路采用闭路循环模 式。在优化条件下( 进样口温度为180 ，迁移管温度为150 ，载气流量和迁移气 流量均为0. 6l /min) 进行检测，马拉硫磷检测时间小于10s，5ng。 除此以外，目前国内外检测马拉硫磷的方法还有：电化学法45-48 、酶联免疫法49、 流动注射法50、分光光谱法51-52、气相色谱法53-54、液相色谱法55、气质联用法56-57 和液质联用法58-59等。 6 马拉硫磷降解的研究进展 环境中马拉硫磷残留可经过多种途径被降解。 残留在土壤中的马拉硫磷主要经过 生物途径和水解而被降解； 在水体中， 除了生物途径和水解外， 马拉硫磷还可被光解。 马拉硫磷在土壤中的半衰期为 4-6 天；在 ph 值为 6 的水体中，半衰期是 56d60。在 水体中， 随着 ph 值和盐度增加， 马拉硫磷水解加速， 温度超过 26、 盐度超过 20ng/l 时，水解为马拉硫磷降解的主要途径61。 6.1 调控物理化学条件促进马拉硫磷降解 已有很多研究通过调控物理化学条件加速马拉硫磷的降解。董轶茹以纳米 tio2 载体制备了 hpa/znfe2o4-tio2 光催化剂，在溶液初始 ph 值为 13、h2o2 浓度为 6mmol/l、催化剂用量为 2g/l 的最优条件下，光照反应进行 100min 后，测得马拉硫 磷的降解率可达 87%62。傅强以高压汞灯为光源加速了水溶液中马拉硫磷光化学降 解， 当fe3+-h2o2质量浓度(mg/l)比为 0.358:3.58 时， 马拉硫磷的半衰期从 71.4min 缩短到 17.1min，光敏率达到 76.05%63。李歆琰使用超声辐射法降解马拉硫磷，加入 o3 或沸石后超声 30min，降解率分别达到 37.60%和 54.07%；对超声辐射后的样品再 采用电解法处理，马拉硫磷去除率可达到 91.53%64。鄢敏林试验证明，粉末活性炭 对纯水和过滤后水中的马拉硫磷的去除效果较好， 去除率随活性炭投加量的增加而升 高。 当马拉硫磷浓度为 1.25mg/l， 纯水、 过滤后水中的活性炭投加量分别为 12.0mg/l 和 20mg/l 时，反应 120min 后马拉硫磷剩余浓度均低于 0.25mg/l3。 7 6.2 利用生物技术促进马拉硫磷降解 生物降解的研究始于 20 世纪 40 年代，降解研究逐渐深入。目前，主要采用各种 微生物、高等植物和动物将污染物分解成小分子化合物，其中微生物是有机磷农药生 物降解的主要材料。 ramanathan m、harcourt r、 hasan h、guha a 65等已经从假单胞菌、放射性土 壤杆菌、黄曲霉、聚多曲霉、微球菌等种属中陆续分离得到可降解马拉硫磷的菌株； goda 分离的假单胞菌 is2 菌株 6 天即可将 50 mg l-1的马拉硫磷完全降解66； 夏会龙等利用凤眼莲进行有机磷植物修复的研究，发现凤眼莲可将 10mg/l 马拉 硫磷的消除速度提高 1.6 倍67。 张琼利用数学模型对铜绿微囊藻的生长以及较高浓度 马拉硫磷的水解和生物降解动力学进行了拟合， 结果表明铜绿微囊藻在马拉硫磷质量 浓度分别为 3.2mg/l 和 10mg/l 时可显着地促进其降解；当马拉硫磷的质量浓度为 10mg/l 时，水解和生物降解的半衰期分别为 74.8，37.7h68。 有机磷农药降解是一门涉及多学科的技术，对它的深入研究需要运用植物学、动 物学、微生物学、物理学、化学、工程科学等技术。随着研究的深入，将会研发出可 实用的综合性农药残留降解技术。 8 1 引言 1.1 研究的目的及意义研究的目的及意义 随着研究的深入，有机磷杀虫剂马拉硫磷对人和动物的危害程度、危害机理越来 越明确。随着社会环保意识的提高，人们越来越重视农药残留导致的环境问题。马拉 硫磷作为一种低毒高效的有机磷杀虫剂为农作物的高产、粮食储存带来了方便，但也 带来有机磷农药残留的安全隐患。 近几年马拉硫磷残留频频检出使得寻求各种途径有 效降解有机磷农药马拉硫磷刻不容缓。 本实验的目的是筛选出一株降解马拉硫磷的高 效菌株，本研究可为马拉硫磷污染的修复提供新的菌种资源和参考。 1.2 主要研究内容主要研究内容 1.2.1 分离纯化以马拉硫磷为唯一碳源的菌株 以校园农场土壤为材料模拟长期使用马拉硫磷农药的土壤环境， 从中分离以有机 磷农药马拉硫磷为唯一碳源的降解马拉硫磷菌株。 1.2.2 检测所筛选菌株的降解效果 将分离纯化得到的菌株接种于含已知浓度的马拉硫磷的基础培养基中， 设置对照 组，定时取出通过检测其中马拉硫磷农药残留，初步确定各菌株对马拉硫磷的降解效 果。 1.2.3 分析降解菌的生理生化特性 选取 4 株马拉硫磷降解菌株进行形态和生理生化特性研究，根据研究结果鉴定 4 株降解菌株的属（种）名称。 1.2.4 选择高效菌株 l19 进行进一步研究 选取马拉硫磷高效降解菌株 l19 进行 16srdna 鉴定，确定 l19 的种属，并进一 步通过实验分析菌株最适生长温度和最适生长 ph 值。 9 2 材料与方法 2.1 材料 2.1.1 培养基: 无机盐培养基69： k2hpo4， 0.2 g； mgso4 7h2o， 0.4 g； caso4， 0.08 g； (nh4)2so4， 0.2 g；fes04 7h2o，0.002 g；蒸馏水 1 l；ph 7.0-7.2。 牛肉膏蛋白胨培养基69：蛋白胨 10g；牛肉膏 5g；naci5g；蒸馏水 1l；ph7.0 选择培养基 69: 在牛肉膏蛋白胨培养基中加入一定浓度的马拉硫磷农药; ph7.0 基础培养基69:在无机盐培养基中加入一定浓度的马拉硫磷农药 ph6.2-6.5; 固体选择培养基69:在牛肉高蛋白胨培养基中加入 1.5 %的琼脂； 葡萄糖蛋白胨培养基: 葡萄糖 0.5g 蛋白胨 0.5g；k2hpo4，0.5g 蒸馏水 1l； 2.1.2 主要药品试剂 乙酸乙酯 分析纯 江苏强盛化工有限公司 石油醚（60-90） 分析纯 江苏强盛化工有限公司 无水硫酸钠 分析纯 扬州沪宝化学试剂有限公司 酵母抽提物 化学纯 安琪酵母股份有限公司 氯化钠 分析纯 上海建信化工有限公司试剂厂 蛋白胨 化学纯 杭州微生物试剂有限公司 mgso4 7h2o 分析纯 上海生工生物工程有限公司 k2hpo4 分析纯 无锡市亚盛化工有限公司 caso4 2h2o 分析纯 上海精化科技研究所 (nh4)2so4 分析纯 无锡市亚盛化工有限公司 feso4 分析纯 无锡市亚盛化工有限公司 马拉硫磷原药 93.5% 南通染化厂 uniq-10 试剂盒 试剂 上海生工-sk1201 10 2.1.3 主要仪器 dhp-9162 型电热恒温培养箱 上海一恒科技有限公司 tu-1800spc 紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司 sw-cj-1c 双人单面净化工作台 苏州净化设备有限公司 zhwy-2012c 恒温培养振荡器 上海智城分析仪器制造有限公司 zhwy-211c 恒温培养振荡器 上海智城分析仪器制造有限公司 fa/ja 系列电子天平 上海明桥精密科学仪器有限公司 dhg-9240a 型电热恒温鼓风干燥箱 上海一恒科技有限公司 starter 3c 实验室 ph 计 奥豪斯仪器（上海）有限公司 ldzx-40b型立式自动电热压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂 h-4 数显恒温水浴锅 江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司 tgl-18r hema 冷冻高速离心机 珠海黑马医学仪器有限公司 aup-1-150g-1 艾科浦标准型实验室纯化水机 重庆颐洋企业发展有限公司 mdf-u5410 sanyo 医用低温保存冰箱 sanyo dyy-8b 型电泳仪 北京市六一仪器厂 js-680d 培清全自动凝胶成像分析仪 上海培清科技有限公司 wh3 微型旋蜗混合仪 上海沪西分析仪器厂 gc2010 岛津气相色谱 岛津制作所 ims-50 全自动雪花制冰机 北京市六一仪器厂 dm lb 荧光显微镜 leica kq-500b 超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司 2.1.4 引物 细菌 16srdna 通用引物： 5-aac tga aga gtt tga tcc tgg ctc-3： 5tac ggt tac ctt gtt acg actt-3 2.1.5 序列分析工具和软件 mega 4.0 软件 2.2 方法 2.2.1 降解菌的富集 采用两种方法进行富集：摇瓶培养富集法和土壤培养富集法。 （1）摇瓶培养富集法： 取校园土壤 5g 加入 50ml 三角瓶中，向三角瓶加入 50ml 含马拉硫磷浓度为 10 mg l-1无机盐培养基中，置于 30 2，160 r min-1摇床中培养 2 d，以后每 2d 按 10%的比例接种到含定量马拉硫磷的 50ml 选择培养基中同时加入定量新鲜校园土 11 壤，不断提高马拉硫磷的浓度直到 500mg l-1，新鲜土壤的添加量由 5g 不断减少至 0g， 马拉硫磷浓度变化以及新鲜土壤加入量的变化见表 2-1。 维持富集菌液 500 mg l-1 的马拉硫磷浓度，摇瓶富集培养试验结束 表表 2-1 富集试验马拉硫磷浓度及新鲜土壤加入量变化表富集试验马拉硫磷浓度及新鲜土壤加入量变化表 table 2-1 malathion content and fresh sludge addition in flask enrichment test 序号 时间/d 马拉硫磷浓度/mg l-1 土壤加入量/g 1 0 10 5.00 2 2 25 2.50 3 4 50 1.00 4 6 75 0.50 5 8 100 0 6 10 150 0 7 12 200 0 8 14 300 0 9 16 400 0 10 18 500 0 (2)土壤培养富集法 取新鲜校园土壤 500g，向该土壤中加入马拉硫磷乙酸乙酯溶液，混匀，使土壤 中马拉硫磷终浓度为 10mg l-1，以后每两天加入马拉硫磷乙酸乙酯溶液一次，土壤中 马拉硫磷浓度变化见表 2-2，使添加到土壤中的马拉硫磷累计达到 1000mg l-1，维持 土壤中 1000mg l-1马拉硫磷浓度，土壤富集培养实验结束。 表表 2-2 土壤富集试验中马拉硫磷累计浓度土壤富集试验中马拉硫磷累计浓度 table 2-2 the accumulation of malathion in soil enrichment test 序号 时间/d 马拉硫磷累计浓度/mg l-1 1 0 10 2 2 25 3 4 50 4 6 100 5 8 200 6 10 300 7 12 400 8 14 600 9 16 800 10 18 1000 取培养液，稀释涂布含马拉硫磷（500mg l-1）为惟一碳源的基础培养基固体平 板，30恒温培养 3d。分离纯化得单菌落保存备用。 2.2.2 降解菌的筛选分离及纯化 12 (1)摇瓶富集培养菌株的筛选分离 采取稀释平板法筛选分离纯化 取 0.5 ml 富集液，加入到 4.5 ml 无菌水中得到 10-1稀释液，再从 10-1稀释液中 取 0.5 ml 加入到 4.5 ml 无菌水中得到 10-2稀释液，依次稀释至 10-6； 取 10-110-6稀释液各 100 l 分别涂在含有马拉硫磷浓度为 500 mg l-1的固体选 择培养基平板上，30 倒置培养；从上述分离培养基上挑选形态不同的单菌落，在 固体选择培养基平板上划线，30 培养 2d；挑取固体选择培养基平板上划线形成的 单菌落，在马拉硫磷浓度为 20 mg l-1固体选择培养基螺口管斜面上划线，30 培养 2d 后置于 4 冰箱冷藏，用于斜面保种。 (2)土壤富集培养菌株的筛选分离纯化 采用稀释涂平板法分离菌株 称取 3 g 富集土壤样品，加入至马拉硫磷浓度为 500 mg l-1的 25 ml 选择培养基 中， 30 160 r min-1摇床中培养 12h 备用。 取 0.5 ml 上述菌株富集液， 加入到 4.5 ml 无菌水中得到 10-1稀释液，再从 10-1稀释液中取 0.5 ml 加入到 4.5 ml 无菌水中得到 10-2稀释液，依次稀释至 10-6；取 10-110-6稀释液各 100 l 分别涂在含有马拉硫磷浓 度为 500 mg l-1的固体选择培养基平板上， 30 倒置培养； 从上述固体选择培养基上 挑选形态不同的单菌落，在固体选择培养基平板上划线，30 培养 2d；挑取固体选 择培养基平板上划线形成的单菌落，在马拉硫磷浓度为 20 mg l-1固体选择培养基螺 口管斜面上划线，30 培养 2d 后置于 4 冰箱冷藏，用于斜面保种。 2.2.3 菌株对马拉硫磷的降解及测定 （1）菌株对马拉硫磷的降解 富集菌液： 将分离纯化得到的菌株接种于含马拉硫磷(500 mg l-1)的牛肉膏蛋白胨 培养基中，30培养 12h，取 5ml 细菌培养液，8000 r min-1离心 10 min，弃上清液， 加入无机盐液体培养基 5 ml 震荡洗涤菌体， 再次 8000 r min-1离心 10 min， 弃上清液； 重复操作，洗涤菌体 3 次；最后加入 5 ml 无机盐培养基震荡悬浮菌体制成菌悬液待 用。 降解：降解实验采用 5 ml 体系，降解体系中马拉硫磷浓度为 20mg l-1。取灭菌 的 25 ml 比色管， 取 100l 浓度为 103 mg l-1马拉硫磷石油醚溶液于比色管底， 吹干， 每组设置 3 个重复；菌株组加入 1ml 待测菌菌悬液和 4ml 无机盐培养基；空白对照 组加入 5ml 无机盐培养基。完成后倾斜放置上述比色管于 30 ，160 r min-1的摇床 中避光培养，定时取样检测马拉硫磷残留量。 萃取： 取出经过黑暗降解的比色管， 向每只比色管中加入 3ml石油醚， 震荡 2min， 静置，待其分层后用灭菌移液管吸取上层石油醚，经无水硫酸钠过滤至 10ml 容量瓶 中.再用 3ml 石油醚重复萃取一次。用石油醚将容量瓶定容至 10ml。 13 检测：先配制马拉硫磷标准溶液，进气相色谱检测，根据出峰面积和已知标准溶 液浓度绘制标准曲线。再进萃取样品，根据标准曲线计算残留量。 (2)菌株对马拉硫磷降解测定以及数据分析 气相色谱条件66： 采用日本岛津 gc-2010 型气相色谱仪。 载气， 99.99高纯 n2， 压力 0.7mpa；柱流量为 4ml/min，分流比为 5，停止时间为 5min，spl 和柱箱的温 度分别至 240、210，ecd 检测器的温度 280及电流（1na） ，进样方式为分流， 进样量 2l； 色谱柱型号， db-5gc (agilent technologies)， 长度 30.0m， 内径 0.32mm， 膜厚 0.25l。 马拉硫磷残留浓度采用绝对标准曲线法进行计算，即取标准被测成分 按依次增 加或减少阶段法，各自调制成标准液，注入一定量后，按色谱图取标准被测成分的峰 面积或峰高为纵座标，而以标准被测成分的含量为横坐标，制成标准曲线。然后按单 体中所规定的方法制备试样液。取试样液按制标准曲线时相同的条件作出色谱，求出 被测成分的峰面积和峰高，再按标准曲线求出被测成分的含量。 马拉硫磷降解率计算 计算公式：%100 ck ck c cc r 式中，r 为菌株降解马拉硫磷降解率；c 为试验菌株降解一段时间后的马拉硫磷 残留量；cck为对照组的马拉硫磷残留量。 马拉硫磷的降解过程用一级动力学方程拟合：c = c0 e-kt 。式中：c为时间时 马拉硫磷的浓度（mgl-1）； c0 为体系中马拉硫磷的初始浓度（mgkg-1）； k为一 级反应速率常数（d-1）为反应时间（d） 降解半衰期计算式：t1/2 = 0.693 / k 。式中：t1/2 为马拉硫磷的降解半衰期。 2.2.4 菌株的鉴定与系统发育分析 降解菌培养特征的观察 (1)降解菌菌落特征的观察 吸取100ul菌液涂布于马拉硫磷浓度为1000mg/l的lb平板上，30 2倒置培养 48h。待长出单菌落后，观察菌落的形状、大小、颜色、光泽、表面状况、边缘、隆 起度、透光性、质地等。 (2)降解菌液体培养性状的观察 用接种环挑取单菌落接种于液体lb培养基中，30 2，160r/min摇床培养24h。 观察液体培养物是否产膜、浑浊、有无沉淀等。 生理生化特征鉴定参照 伯杰氏细菌手册 第 8 版相关内容进行70。 革兰氏染色、 半固体穿刺、淀粉水解试验、明胶液化试验、v.p.试验、吲哚试验、脲酶试验 14 (3)细菌基因组 dna 提取 细菌基因组 dna 提取采用 uniq-10 柱式细菌基因组抽提试剂盒（上海生工 -sk1201） 。以 l19 的基因组 dna 为模板，以 5-aac tga aga gtt tga tcc tgg ctc-3： 5tac ggt tac ctt gtt acg actt-3为引物 pcr 扩增其 16srdna。 pcr 反应体系每 25l 中含：10 pcr buffer(mg2+ free)2.5l；mgc12(25mmoll)1.5l；引 物 1(5moll-1)2l； 引物 2(5moll-1)2l； dntp mixture 2l； taq e (5u/l)0.125l, 加模板 dna 和灭菌 ddh20 至 25l71。 (4)细菌基因组扩增 pcr 反应条件：94预变性，5min，循环 1 次；94变性，45s，55退火，45s， 72延伸