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文档简介

编号：3-6主题：RNA-蛋白 Pull-Down概述：此方法是利用脱硫生物素末端标记的 RNA 和链霉亲和素磁珠标记的来高效富集RNA 结合蛋白（RBP）。RNA-蛋白Pull-Down的原理是将RNA与链霉亲和素磁珠结合。之后在蛋白质-RNA结合缓冲液中平衡RNA结合的磁珠，再加入蛋白裂解液。随后添加适当的缓冲液、涡旋振荡，并在磁力架上分离，洗涤磁珠。最后样品可通过非变性的生物素洗脱缓冲液或SDS- PAGE上样缓冲液洗脱，用于下游分析。目的：寻找与RNA相互作用的蛋白质步骤：(1) RNA 结合到链霉亲和素磁珠1) 加入 50 l 链霉亲和素磁珠到 1.5ml 的 EP 管，将 EP 管放入磁力架，吸去液体；2) 加入 50 l pH7.5 20mM Tris重悬磁珠；3) 重复步骤 1，2；4) 将 EP 管放入磁力架，吸去液体；5) 加入 50 l 1RNA Capture Buffer 重悬磁珠；6) 加入 50 pmol RNA探针到磁珠中，混匀；7) 室温孵育 30min；(2) 蛋白结合到 RNA1) 加入 50 l 链霉亲和素磁珠到 1.5ml 的 EP 管，将 EP 管放入磁力架，吸去液体；2) 加入 50 l pH7.5 20mM Tris 重悬磁珠；3) 重复步骤 1，2；4) 将 EP 管放入磁力架，吸去液体；5) 加入 100 l1Protein-RNA Binding Buffer 到磁珠，混匀；6)准备 Protein-RNA Binding Reaction Master Mix；7) 将 EP 管放入磁力架，吸去液体。加入 100 l Master Mix，混匀；8) 4孵育 60min；(3) 洗脱 RNA-Binding protein1) 将 EP 管放入磁力架，吸去液体；2) 加入 100 l 1wash buffer，混匀，将 EP 管放入磁力架，吸去液体；3) 重复步骤 1，2；4) 加入 50 l Elution buffer，混匀，37孵育 30min；5) 将 E
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