ENU与疾病动物模型ppt课件.ppt

ENU诱变与疾病动物模型 邵义祥 人类遗传性疾病 人类群体中约20 25 的人都患有不同种类 不同程度的遗传相关疾病 人类遗传学研究表明 4 5 新生儿患有遗传病 40 的低智能儿童是由遗传因素造成 现代医学研究已证实 癌症 糖尿病 冠心病 动脉粥样硬化 高血压病和精神分裂症等常见病与遗传因素密切相关 人类疾病动物模型的用途 由于个体遗传背景的差异及研究材料的限制 人类遗传疾病的深入研究必须通过动物模型实现 利用动物模型进行遗传疾病机理的深入研究借助动物模型进行实验性矫正或治疗 获得人类遗传病动物模型的方法 自发性动物模型基因组改造和修饰基因组诱变 基因驱动法与表型驱动法 基因敲除与插入 基因驱动特点 基因结构明确 时间长 代价高 效率低 诱导点突变 表型驱动特点 高通量 大规模 表型明确 随机 小鼠是第二个完成全基因组测序的哺乳动物 人类疾病有关的遗传基因中的90 在小鼠身上有相似的效果 小鼠容易获得 世代间隔短 饲养 管理 实验操作方便 小鼠是研究人类疾病和基因功能的最为理想的模式动物 成为研究人类疾病和试验新的治疗手段的理想模型 小鼠在人类遗传病研究中的独特作用 ENU诱变技术 随着越来越多的基因和微卫星标记被定位 突变基因的定位也会随之变得容易 因此对小鼠进行化学诱变将越来越变得低成本而高效益 ENU ethylnitrosourea 致突变技术是高通量大规模筛选新基因及发育突变技术的化学诱变方法 ENU诱变是一种表型诱变技术 研究者无需知道哪个基因以及这些基因的突变类型 即可直接针对某一未知基因突变导致的特定表型或疾病进行研究 ENU的结构 N ethyl N nitrosourea ENU诱变机制 烷基化反应作用位点 A N1 N3 N7G O6 N3 N7C O2 N3T O2 O4 N3复制 错配 未修复导致单碱基突变 screeningandtestingfordominantmutants screeningandtestingforrecessivemutants 诱变小鼠的筛查项目 ENU诱变的历史和现状 ENU诱变开始于上个世纪70年代 初期主要应用在肿瘤研究领域 在1985年左右 开始有报道用ENU诱变雄鼠而在后代当中获得突变系小鼠 这些突变小鼠某些酶的活性发生了改变 1995年以后 开始在世界范围内得到开展并主要用于基因功能的研究 1994年King等通过诱变获得生活规律异常的小鼠 1997年克隆了clock基因 这是表明ENU诱变技术独特优势的里程碑 国外进展 德国GSF1997 2003年期间共建立突变系小鼠267种 其中隐性突变50种 半显性突变5种 其余均为显性突变 到2000年英国MRC筛查突变小鼠26000只 得到突变系小鼠500种 到目前为止 世界上ENU诱变获得的突变系小鼠已有1000多种 国内进展 南京大学和扬州大学共同承担的 国家小鼠遗传资源库 项目 其中一项重要工作就是开展小鼠ENU诱变研究 2002 2004年资源库共建立了具有自主知识产权的转基因 基因剔除 化学诱变小鼠共167种 其中ENU诱变获得的有117种 在此基础上克隆了7个突变基因 清华大学生物科学与技术系发育生物学实验室用ENU诱导斑马鱼突变一共得到35种突变体 ENU诱变建立疾病动物模型 心血管疾病 代谢性疾病 神经系统疾病 免疫性疾病 肿瘤和出生缺陷等遗传高度相关性疾病已成为国际上生物医学研究的最热门领域 相应的实验动物学支撑 特别是相关疾病的动物模型的获得和建立成为了实验动物学研究的热点 小鼠疾病模型的开发与保种 美国的Jackson实验室保存了近2500多个品系的小鼠模型 英国MRC的哺乳类遗传学中心保存了1000多个品系的小鼠资源 意大利的欧洲小鼠突变系保存中心每年以开发150个突变系小鼠的速度建立了数百个基因工程小鼠模型 日本的熊本大学实验动物资源开发研究中心 CARD 自2000年建立以来 已收集保存了700多个转基因和基因剔除小鼠模型 国家遗传工程小鼠资源库建立以来 已收集 开发了264种小鼠模型品系 模型种类包括 糖尿病模型 生殖缺陷模型 心衰模型 生长迟缓模型 骨密度异常模型 肢体发育缺陷模型 听力异常模型 眼发育异常模型 稀毛 毛色变异模型等等 目前 世界上数以千计新的小鼠品系 模拟人类代谢性疾病 自身免疫疾病 老年性疾病和神经系统疾病的动物模型正在不断通过ENU诱变这个高通量筛选技术建立起来 进而相关基因被定位和克隆 随着基因组计划的进行 从表型到基因克隆的方法目前也日渐成熟和简化 ENU在建立人类疾病动物模型和开展基因功能研究中的主要优势 在相对短的时间内诱导产生较多的突变系小鼠 获得许多基因包括新基因的功能信息 只要得到能够遗传某种表型的突变小鼠 就可以通过配种形成任意控制的 超大家系 小鼠近交系有数百种 其中12个品系的微卫星数据已经建库且免费开放 便于对突变基因的定位及克隆 小鼠与人类病理过程的相似性 通过克隆小鼠的致病基因就可以通过同源检索得到人类的相应疾病的基因 ENU诱变无需知道哪个基因以及这些基因的何种突变导致特定的表型或疾病 这也使得发现新基因成为可能 ENU诱导的某些突变 导致非致死的表型和改变蛋白质的部分功能 而不是完全废弃 因此增加了研究者鉴定突变体的机会 而该突变体含有对某个基因座的丰富信息 总之 以ENU诱变为手段 通过模式小鼠研究功能基因或人类疾病已成为一种很有前景的手段和捷径 我们的部分研究工作 突变系小鼠的获得两种突变小鼠突变基因的定位两种突变小鼠模型性状的初步研究 ENU诱变 突变表型筛选及遗传试验技术路线 突变基因的定位技术路线 在G1代小鼠中 针对肉眼可见的神经行为 皮肤 毛发 五官 骨骼等可见表型筛查突变个体 筛查G1小鼠1650只 获得突变小鼠48只 在对G1突变小鼠的遗传试验及突变系小鼠保种过程中 繁殖小鼠1468只 确认能够稳定遗传的只有短尾 角膜浑浊和瞳孔异形突变小鼠等共7种 经卡方检验都属于单基因显性遗传 小鼠的ENU诱变结果 突变基因的微卫星定位体系 D1Mit372 D1Mit84 D1Mit273 D2Mit6 D2Mit17 D2Mit528 D3Mit268 D3Mit15 D4Mit17 D4Mit54 D5Mit352 D5Mit168 D6Mit274 D6Mit339 D7Mit246 D7Mit333 D8Mit4 D8Mit320 D9Mit325 D9Mit243 D10Mit3 D10Mit73 D11Mit163 D11Mit258 D12Mit136 D12Mit17 D13Mit18 D13Mit262 D14Mit50 D14Mit205 D15Mit226 D15Mit34 D16Mit189 D16Mit100 D17Mit33 D17Mit39 D18Mit52 D19Mit128 D19Mit33 泳道1 野生型D2品系小鼠对照 泳道2 17 F2角膜浑浊小鼠的检测结果 其中第9泳道发生重组 其余连锁 F2代B6角膜浑浊小鼠的微卫星检测 角膜浑浊小鼠突变基因的连锁分析 角膜浑浊小鼠突变基因的染色体定位 D17Mit33与D17Mit143聚丙烯酰胺凝胶电泳结果上图 第4泳道发生重组下图 无1例发生交换 12 13 14分别为D2 F1 B6 F2代短尾小鼠的微卫星检测 短尾鼠的突变基因连锁分析 228只F2 B6 D2 D2 109只短尾 短尾突变基因与各微卫星的连锁分析 短尾小鼠突变基因的染色体定位 角膜浑浊突变小鼠的生物学特性初步研究 突变品系的建立及其模型性状研究的技术路线 角膜浑浊小鼠 角膜浑浊小鼠和野生型小鼠的繁殖学指标比较 角膜浑浊小鼠后代的性别比 为 1 07有角膜浑浊表型的性别比 为 1 44 B6 Co与正常B6小鼠的脏器系数 角膜浑浊突变系与正常B6小鼠血常规的比较 角膜浑浊突变系与正常B6小鼠血液生化值的比较 角膜浑浊小鼠的角膜病理学特征 1 角膜浑浊小鼠的角膜病理学特征 2 角膜浑浊小鼠的角膜病理学特征 3 角膜浑浊小鼠的模型价值 我国盲人数约670万人 角膜浑浊是仅次于白内障的主要致盲原因 约占15 4 人类角膜病有多种类型 它们的致病原因更有许多假说 但由于缺乏合适的动物模型 相关研究一直未能深入 突变小鼠角膜中有大量钙质和异物沉积 类似于人的斑点状营养不良 而角膜上皮细胞和基质成纤维细胞的形态学变化又类似于人的先天性角膜化生症 目前尚不能确定其对应的人类角膜病类型 但遗传因素在其中的决定作用是毫无疑问的 对该小鼠的研究可能会对人类角膜病的正确分型及发病机制提供科学理论依据 短尾突变小鼠的生物学特性初步研究 短尾小鼠后代尾巴的不同形态 短尾小鼠的繁殖学指标 不同尾形小鼠的统计结果 各尾形所占百分比 短尾33 8 中尾9 9 正常尾56 3 性别 比值 0 75 脏器系数比较表 血常规比较表 血液生化值比较表 短尾小鼠脏器系数 血常规 血液生化结果 短尾小鼠的脾 脑 子宫 卵巢的脏器系数与B6有显著差异 短尾小鼠白细胞 单核细胞显著高于B6 结果表明 短尾小鼠的血红蛋白 碱性磷酸酶 血清总蛋白 白蛋白 白蛋白 血清总胆固醇都显著低于B6小鼠 所获短尾小鼠属于纵形肢体缺陷 与人类心手综合征 holt oramsyndrome HOS 属于同一类型 其突变基因与人类TBX5基因高度同源 心手综合征在人类的发病率约为十万分之一 短尾小鼠无疑是一个很好的骨骼畸形研究的动物模型 短尾小鼠的模型价值 短尾突变基因 T 的序列鉴定与分析 短尾突变基因序列鉴定与分析技术路线 实验方法 8 5天小鼠胚胎的获取RNA抽提 参照RNARTotalRNAIsolationSystem Promega公司 的说明书 在超净工作台内进行操作RT引物设计逆转录 参照Invitrogen公司SuperScriptTMFirst StrandSynthesisSystemforRT PCR试剂盒说明书操作高保真PCR扩增PCR产物回收 fastgene胶回收试剂盒回收 收集滤液 送上海生工测序 8 5天B6 St小鼠胚胎总RNART PCR扩增产物 得到了1494bp的特异性产物 突变T基因RT PCR产物电泳图 T基因 突变T基因的cDNA序列与数据库序列的比对 巢式PCR验证结果 1 正常小鼠胚胎T基因PCR电泳结果 2 短尾小鼠胚胎T基因PCR电泳结果 正常小鼠和突变小鼠的巢式PCR测序结果比