细胞生物学研究方法翟中和版.ppt

第3章细胞生物学研究方法 本章主要内容 细胞形态结构的观察方法细胞及其组分的分析方法细胞培养与细胞工程细胞及其生物大分子的动态变化模式生物与功能基因组的研究 第一节细胞形态结构的观察方法 病毒20 200nm支原体0 1 0 3 m细菌0 5 5 0 m动植物细胞20 30 m活细胞多是无色透明的 直径 显微镜观察范围肉眼观察范围 肉眼0 2mm光学显微镜0 2 m电子显微镜0 2nm扫描隧道显微镜样品制备技术 分辨率 一 光学显微镜 lightmicroscope 从细胞的发现 细胞学说的建立 直至今天光学显微镜仍然是细胞生物学研究的重要工具 1 目镜2 准焦螺旋3 物镜4 载物台5 反光镜 一 普通复式光学显微镜 组成 由3部分组成 光学放大系统 目镜与物镜 照明系统 光源和聚光镜 镜架及调节系统 一 普通复式光学显微镜 成像 放大的倒立虚像经物镜形成倒立实像经目镜进一步放大成虚像 一 普通复式光学显微镜 分辨率 分辨率 显微镜最重要的性能参数分辨率是指能区分开两个质点间的最小距离普通光学显微镜最大分辨率0 2 m 光源波长N 介质折射率 空气为1 油为1 4 物镜镜口角 最大140o Sin 2最大0 94 镜口角是指被观察点射入物镜前透镜的边缘光线之间的夹角 一 普通复式光学显微镜 样品制备 Figure9 10 11aMolecularBiologyoftheCell GarlandScience2008 二 相差显微镜和微分干涉显微镜 利用光线干涉的原理 将相位差转换成振幅差 实现对非染色活细胞的观察A 当两束光的相位相同时 相互干涉的结果使光波的振幅增加B 当两束光的相位相反时 则导致光波的振幅降低 二 相差显微镜和微分干涉显微镜 相差显微镜是在普通光学显微镜的基础上 添加 环状光阑 和 相差板 将光程差或相位差 转换成振幅差 体外培养MDCK细胞在普通 明视场 光学显微镜 A 和相差显微镜 B 下拍摄图像效果的比较 二 相差显微镜和微分干涉显微镜 微分干涉显微镜以平面偏振光为光源 使样品中厚度上的微小区别转化成明暗区别分辨率比普通光镜提高了一个数量级录像增差显微镜可以用来直接观察颗粒物质沿着微管运输的动态过程 Figure9 9MolecularBiologyoftheCell GarlandScience2008 Fourtypesoflightmicroscopy A Theimageofafibroblastincultureobtainedbythesimpletransmissionoflightthroughthecell atechniqueknownasbright fieldmicroscopy B phase contrastmicroscopy C Nomarskidifferential interference contrastmicroscopy D dark fieldmicroscopy Figure9 8MolecularBiologyoftheCell GarlandScience2008 正置显微镜与倒置显微镜比较 组成一样 倒置显微镜的物镜与照明系统颠倒 前者在载物台之下 后者在载物台之上 用于观察培养的活细胞 具有相差物镜 三 荧光显微镜 基本原理 荧光 分子吸收入射光能量后电子从基态跃迁到激发态 再从激发态回到基态而发出的可见光 波长比入射光长 三 荧光显微镜 基本原理 光源和光学系统与普通光学显微镜不同核心部件是滤光片系统及专用物镜镜头滤光片系统由激发滤光片和阻断滤光片组成 1 照明方式通常为落射式2 光源为紫外光或其他短波长的光3 有两个特殊的滤光片 发射滤片和阻断滤片 荧光显微镜光路系统 三 荧光显微镜 样品制备 免疫荧光技术荧光素直接标记技术绿色荧光蛋白 GFP 的基因与编码某种蛋白质的基因相融合表达两种以上荧光素标记同一样品 可同时显示不同成分在细胞中的定位 三 荧光显微镜 应用 在光镜水平上 对细胞内特异的蛋白质 核酸 糖类 脂质以及某些离子等组分进行定性定位研究的有力工具 荧光显微镜显示出在有丝分裂中期细胞中 纺锤体微管 绿色 中期染色体 蓝色 和原纤维状蛋白 fibrillarin 红色 等结构成分 四 激光扫描共焦显微镜 以激光为光源聚光镜和物镜同时聚焦到同一点上 排除焦平面以外的成像利用激光扫描装置和计算机高速采集与处理汇聚每一个点上的信息 形成清晰的二维图像分辨率比普通荧光显微镜1 4 1 7倍 四 激光扫描共焦显微镜 可通过 光学切片 叠加后重构出样品的三维结构 Figure9 20MolecularBiologyoftheCell GarlandScience2008 二向的 3DImageReconstruction z x y z x y z y y 荧光显微镜 a 和激光扫描共焦显微镜 b 二 电子显微镜 透射电镜transmissionelectronmicroscope TEM 扫描电镜scanningelectronmicroscope SEM 一 透射电子显微镜 电子束作为光源电磁透镜聚焦镜筒高度真空图像通过荧光屏或感光胶片记录 1 电子显微镜与光学显微镜的基本区别 Figure9 42 part1of2 MolecularBiologyoftheCell GarlandScience2008 光镜电镜光源可见光 300 700nm 电子束紫外光 200nm 分辨率200nm0 2nm透镜玻璃透镜磁透镜真空无要求1 33 10 3 10 5Pa 电子束的波长与加速电压有关 当加速电压为50 100千伏时 电子束波长约为0 0053 0 0037纳米 2 电子显微镜的分辨本领与有效放大倍数 电子显微镜分辨率可达0 2nm电镜的分辨本领是指电镜处于最佳状态下的分辨率 3 电子显微镜的基本构造 电子束照明系统成像系统真空系统记录系统 二 透射电镜制样技术 超薄切片技术 超薄切片 黑白图像 超薄切片技术显示的细胞超微结构 应用超薄切片技术 几乎可以观察细胞的各种超微结构 Figure9 45MolecularBiologyoftheCell GarlandScience2008 二 透射电镜制样技术 负染色技术 观察线粒体基粒 核糖体 蛋白颗粒及细胞骨架纤维甚至病毒等重金属盐沉积在铜网上 而样品未被染色 故名负染 分辨率可达1 5nm左右 二 透射电镜制样技术 冷冻蚀刻技术 包括冰冻断裂与蚀刻复型两步观察膜断裂面上的蛋白质颗粒和膜表面形貌特征 图像有立体感样品不需固定包埋 冰冻蚀刻电镜照片 透射电镜照片与冰冻断裂和冰冻蚀刻电镜照片比较 电镜三维重构与低温电镜技术 电镜三维重构技术低温电镜技术电子扫描断层成像技术 核孔复合物 三 扫描电镜技术 利用电子 探针 在样品表面进行 扫描 激发样品表面放出的二次电子成像 可以得到样品表面的立体形貌 三 扫描电镜技术 样品利用CO2临界点干燥法处理样品观察前喷镀一层金膜一般扫描电镜的分辨本领仅为3nm Figure9 49 part1of2 MolecularBiologyoftheCell GarlandScience2008 小结 光镜 透射电镜与扫描电镜原理比较 注意样品制备技术的差异 三 扫描隧道显微镜 探测微观世界物质表面形貌利用量子力学中的隧道效应具有原子尺度的高分辨本领可以在真空 大气 液体等多种条件下工作非破坏性测量 http en wikipedia org wiki File ScanningTunnelingMicroscope schematic png 第二节细胞及其组分的分析方法 一 用超离心技术分离细胞组分 差速离心 利用不同的离心速度所产生的不同离心力 将各种质量和密度不同的亚细胞组分和各种颗粒分开 差速离心 一 用超离心技术分离细胞组分 密度梯度离心 通过离心力的作用使样品中不同组分以不同的沉降率在密度梯度溶液中沉降 形成不同的沉降带 二 细胞成分的细胞化学显示方法 显色剂与细胞组分中特殊基团的结合通过显色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来判断蛋白质 核酸 多糖和脂质在细胞中的分布和相对含量 福尔根反应Feulgenstain 特异显示细胞内呈紫红色的DNA的分布原理 酸水解可以去除RNA 仅保留DNA 并除去DNA上嘌呤脱氧核糖核苷键的嘌呤 使脱氧核糖的醛基暴露 所暴露的自由醛基与希夫试剂 Schiff sreagent 反应呈紫红色 三 特异蛋白抗原的定位与定性 细胞内特异蛋白的显示可通过抗原 抗体特异结合的方法得以实现若抗体偶联荧光染料 则可以通过荧光显微镜 激光共焦显微镜观察为了观察特异蛋白在细胞内的精细定位 抗体需偶联电子致密物 胶体金 用电镜观察 一 免疫荧光技术 直接间接免疫荧光技术 A 间接免疫荧光技术 B 二 免疫电镜技术 在超微结构水平上研究特异蛋白抗原的定位免疫胶体金技术受到越来越多的青睐 四 细胞内特异核酸的定位与定性 原位杂交 用标记的核酸探针通过分子杂交确定特异核苷酸序列在染色体上或在细胞中的位置 原位杂交技术 光镜水平同位素标记或荧光素标记的探针电镜水平生物素标记的探针与抗生物素抗体相连胶体金标记结合 FISH FluorescentInSituHybridization 五 定量细胞化学分析与细胞分选技术 流式细胞术 流式细胞术是对细胞进行快速定量分析与分选的一门技术 在分析或分选过程中 包在鞘液中的细胞通过高频振荡控制的喷嘴 形成包含单个细胞的液滴 在激光束的照射下 这些细胞发出散射光和荧光 经探测器检测 转换为电信号 送入计算机处理 输出统计结果 并可根据这些性质分选出高纯度的细胞亚群 分离纯度可达99 flowcytometer 应用1 分析细胞中DNA RNA含量和细胞表面分子含量2 细胞 细胞组分的分选 第三节细胞培养与细胞工程 一 细胞培养 动物细胞培养 分为原代细胞和传代细胞细胞系 有限细胞系和连续细胞系细胞株 基本形态 成纤维样细胞和上皮样细胞贴壁培养和悬浮培养 动物细胞培养 原代细胞1 10代以内的细胞传代细胞在体外培养条件下持续传代培养的细胞接触抑制贴壁生长细胞分裂生长到表面接触时停止分裂生长的现象细胞系 Cellline 极少数细胞在传10代后可渡过危机而传下去40 50代次并仍保持原来的染色体的二倍体数量及接触抑制行为有限细胞系永生细胞系 细胞发生了遗传改变 染色体明显改变 有癌变特点细胞株 Cellstrain 单个细胞增殖而来 所有细胞具有相同的遗传性状 目前实验室中常用的几种细胞系 一 细胞培养 植物细胞培养 单倍体细胞培养 用花药或花粉在人工培养基上进行培养 通过发育成胚状体 然后长成单倍体植株 或者通过愈伤组织诱导分化出芽和根 最终长成植株 一 细胞培养 植物细胞培养 原生质体培养 体细胞经纤维素酶处理去掉细胞壁的原生质体经诱导分化长成植株 二 细胞工程 一 细胞融合与单克隆抗体技术 细胞融合灭活的病毒化学物质 如PEG 电融合同核体 homokaryon 异核体 heterokaryon 合核体 synkaryon 单克隆抗体与多克隆抗体 单克隆抗体的制备 二 显微操作技术与动物的克隆 细胞拆合 胞质体 核体物理法 机械法或短波光化学法 细胞松弛素显微镜下用显微操作装置对细胞进行拆合或微量注射 如核移植 显微注射基因等 克隆羊多莉的培育 第四节细胞及生物大分子的动态变化 MartinDN BaehreckeEHDevelopment2004 131 275 284 一 荧光漂白恢复技术 亲脂性或亲水性的荧光分子 如荧光素 绿色荧光蛋白等与蛋白或脂质耦联高能激光束的照射使某一区域荧光不可逆淬灭由于生物膜的流动性 淬灭区荧光强度逐渐恢复测定脂质或蛋白质在细胞中运动速率 fluorescencephotobleachingrecovery FPR Figure10 36aMolecularBiologyoftheCell GarlandScience2008 二 单分子技术与细胞生命活动的研究 指在单分子水平上对生物分子的行为 构象变化 相互作用 相互识别等 的实时 动态检测以及在此基础上的操纵 调控等 useopticaltrapstoprobethesteppingofsinglemoleculesofkinesin Fluorescentimageofsinglemotorproteins left Motionoftwodiffusingkinesinmolecules green onamicrotubule red shownasatimeserieskymograph Schematic right Bydraggingdiffusingkinesinmoleculeswithlasertweezersoveramicrotubule thefrictionforcebetweenthemotoranditsmicrotubuletrackcanbemeasuredveryprecisely 三 酵母双杂交技术 在体内分析蛋白质 蛋白质相互作用利用转录激活因子的DNA结合域 DB 和转录激活域 AD 结合在一起才具有完整转录激活功能的原理 四 荧光共振能量转移技术 FRET 分子具有不同能级 分子中的外层电子 一般处于电子的基态S0 electronicgroundstate 的最低振动能级吸收光能以后 它可以被激发到第一电子激发态S1的任意振动能级 这 过程发生在10 15s时间内被激发的分子 首先释放能量回到S1的最低振动能级 此过程发生在10 12s内 然后从S1的最低振动能级回到S0的各振动能级 并以光子的形式释放能量 即发射荧光 FRET产生的条件 D A都能发荧光D的发射光谱和A的激发 或吸收 光谱必须有部分重叠D和A之间的距离必须小于10nm FRET的基本原理 检测活细胞内两种蛋白质分子是否直接相互作用如果两个蛋白相互作用 其中一个蛋白激发后发出的荧光可激发另一蛋白产生荧光 五 放射自显影技术 利用放射性同位素的电离射线对乳胶 含AgBr或AgCl 的感光作用 对细胞内生物大分子进行定性 定位与半定量研究两个主要步骤 即同位素标记的生物大分子前体的掺入和细胞内同位素的显示 根据实验要求选择合适的同位素 研究DNA合成时通常用氚 3H 标记的3H TdR研究RNA合成用3H U在研究含硫蛋白分子代谢时 用35S标记的蛋氨酸和半胱氨酸 对细胞或生物体内生物大分子动态研究和追踪 持续标记 脉冲标记显微放射自显影电镜放射自显影 胰岛B细胞电镜放射自显影结果 3H 亮氨酸脉冲标记完成10分钟后 被标记的胰岛素蛋白 黑色银颗粒 从粗面内质网进入高尔基复合体中3H 亮氨酸脉冲标记完成45分钟后 被标记的胰岛素蛋白进入分泌颗粒内 第五节模式生物与功能基因组的研究 Figure1 44MolecularBiologyoftheCell FifthEdition GarlandScience2008 一 细胞生物学研究常用的模式生物 模式生物通常个体较小 容易培养 操作简单 生长繁殖快由于基因在进化上的保守性以及遗传密码的通用性 从一种实验生物得到的有关基因性质或功能方面的信息往往也适用于其他生物 Whydoweneedmodelsystems AllcellsaredescendedfromacommonancestorSimplesystemstostudyabiologicalquestionExtrapolate 外推 resultstohigherorganismsAdvantageouscharacteristicsfoundinmodelorganismsAmenabletogeneticmanipulationReproducerapidlyTr