基因组序列的诠释PPT课件.ppt

1 2 基因组序列所包含的全部遗传信息是什么 基因组作为一个整体如何行使其功能 用什么方法寻找基因 研究基因的功能呢 3 基因组序列注释 annotation 研究基因组的最终目的不是为了仅仅得到基因组的全部序列 而是诠释基因组所包含的信息和基因组功能 在基因组中搜寻基因通过序列筛查定位基因 隶属生物信息学 实验分析确认基因基因功能的测定 4 功能性RNA基因的定位 1 通过序列筛查定位基因 一 在基因组中搜寻基因 基因的序列不是核苷酸的随机组合 而是具有明显特征的 计算机序列筛查是定位基因的强有力工具 是分析新基因组序列的首选方法 1 ORF 2 密码子偏爱性 3 外显子 内含子边界 4 上游调控序列 5 其他序列特征 蛋白质编码基因的定位 1 tRNA基因 2 其他功能RNA基因 5 ORF 每个编码蛋白的基因都含有ORF 它是由一系列密码子组成 通常以ATG开始 TAA TGA TAG结束 1 通过序列筛查定位基因之ORF 一 在基因组中搜寻基因 蛋白质编码基因 通过寻找起始密码子和终止密码子的ORF序列是寻找基因的一种重要的方法 6 成功寻找ORF ORFscanning 的关键在于终止子在DNA序列中出现的频率 1 通过序列筛查定位基因之ORF 一 在基因组中搜寻基因 蛋白质编码基因 随机序列中 GC 50 终止密码子每64bp出现一次GC 50 终止密码子每100 200bp出现一次由于多数基因ORF均多于50个密码子 大肠杆菌 317 酿酒酵母 483 人 450 因此最可能的选择应该是ORF不少于100个密码子 原核生物 无内含子 基因序列不重叠 无基因内基因 对于原核生物 简单的ORF扫描可以定位大多数基因 7 高等真核生物DNA的ORF的阅读障碍 存在大量的基因间序列 如人类基因组占62 很多基因含有内含子由于多数外显子长度 100个密码子 当读码延伸至内含子通常会遇到终止密码 难以判断读码的准确性 1 通过序列筛查定位基因之ORF 一 在基因组中搜寻基因 蛋白质编码基因 8 编码同一氨基酸的不同密码子称为同义密码 其差别仅在密码子的第3位碱基不同 特定生物体的基因中并不是所有密码子的使用频率都是平等的 如Leu的密码子有6个 TTA TTG CTT CTC CTA CTG 在人类基因中 绝大多数Leu都是由CTG编码的 而且几乎不由CTA和TTA编码 预期真正的外显子会表现出密码子偏爱 随机碱基序列却不会 1 通过序列筛查定位基因之密码子偏爱性 一 在基因组中搜寻基因 蛋白质编码基因 9 1 通过序列筛查定位基因之外显子 内含子边界 一 在基因组中搜寻基因 蛋白质编码基因 外显子和内含子的边界有一些明显的特征如 内含子的上游边界常见的顺序为5 AG GTTAAGT 3 下游边界多为5 PyPyPyPyPyPyNCAG 3 Py 嘧啶核苷酸 T或C 目前通过序列分析定位外显子 内含子边界是件碰运气的事 10 几乎所有基因 或操纵子 上游都有调控序列 它们与DNA结合蛋白作用 控制基因表达最常用的与转录起始位点相关的数据库是真核启动子数据库 EukaryoticPromoterDatabase EPD http www epd unil ch 1 通过序列筛查定位基因之上游调控序列 一 在基因组中搜寻基因 蛋白质编码基因 11 1 Kozak规则 即第一个ATG侧翼序列的碱基分布所满足的统计规律 若将第一个ATG中的碱基A T G分别标为1 2 3位 侧翼碱基序列具有以下特征 1 通过序列筛查定位基因之其他序列特征 一 在基因组中搜寻基因 蛋白质编码基因 第4位的偏好碱基为GATG的5 端约15bp范围的侧翼序列内不含碱基T在 3 6和 9位置 G是偏好碱基除 3 6和 9位 在整个侧翼序列区 C是偏好碱基 12 1 通过序列筛查定位基因之其他序列特征 一 在基因组中搜寻基因 蛋白质编码基因 2 3 端的确认3 端的确认主要根据Poly A 尾序列 真核基因的3 末端转录终止位点上游15 30bp处存在保守的加尾信号序列 AATAAA 3 个别生物基因组的特有组成也可作为判别依据 如脊椎动物基因组许多基因的上游都有大约1kb长的CpG岛 人类40 50 的基因上游都有CpG岛 水稻中相当比例的基因5 端含有很高的GC含量 13 1 通过序列筛查定位基因 一 在基因组中搜寻基因 功能性RNA基因 功能性RNA分子最重要的特征是能够折叠成二级结构 这些二级结构通过分子内碱基配对而形成 为了使分子内形成碱基配对 该分子中两部分的核苷酸序列必须是互补的 14 1 通过序列筛查定位基因之tRNA基因定位 一 在基因组中搜寻基因 功能性RNA基因 所有的tRNA都折叠成三叶草结构 为了形成这种复杂的结构 所有配对的互补序列在RNA序列内必须按照特定的顺序进行排列 这些特征能够通过设计好的定位tRNA基因的计算机程序进行寻找 15 1 通过序列筛查定位基因之其他功能RNA基因定位 一 在基因组中搜寻基因 功能性RNA基因 rRNA和某些功能RNA也具有二级结构 能够通过序列特征很容易的鉴别出其基因 其他的功能RNA所含的配对碱基较少 对此 常用定位方法有 一个或多个茎环 发夹结构搜索与功能RNA基因相关的调控序列 对于紧凑的小基因组 在蛋白质编码基因之外的空白区搜索 16 同源查询 homologysearch 利用已存入数据库中的基因序列与待查基因组序列进行比较 从中查找可与之匹配的碱基序列及其比例用于界定基因的方法 依据 现有生物不同种属之间具有结构或功能相似的直系基因成员 它们在起源上一脉相承 存在有一定的保守序列 1 通过序列筛查定位基因 一 在基因组中搜寻基因 17 1 通过序列筛查定位基因 一 在基因组中搜寻基因 同源有如下几种情况 A DNA序列某些片段完全相同 B 开放读码框 ORF 排列类似 C 开放读码框翻译成氨基酸序列的相似 D 模拟多肽高级结构相似 E 孤独基因 缺少同源顺序的ORF 一般认为 氨基酸序列的相似性在25 以上可视为同源基因 这些结果均可作为基因判定的指标 可单独用 也可综合用 18 1 通过序列筛查定位基因 一 在基因组中搜寻基因 19 1 通过序列筛查定位基因 一 在基因组中搜寻基因 计算机方法进行基因定位的一大优点是能够将一套分析程序合并为单一的 集成系统 可平行利用不同的基因定位方法 并能自动比较结果 使被研究的基因组可以很迅速地被综合标注出来 20 1 通过序列筛查定位基因 一 在基因组中搜寻基因 人类一段15kb序列的Genotator浏览器标注 含有信息 可能启动子位置 GenPept库对应的蛋白质序列 已知的EST对应序列 重复序列 不同程序分析的外显子 下半部是对反向序列进行的分析 综合各结果 发现5个可能的外显子位置 黑色箭头所示 21 1 通过序列筛查定位基因 一 在基因组中搜寻基因 基因注释软件一般包括 基因组序列中确切转录为mRNA的序列 外显子 内含子的位置 基因编码的蛋白质顺序等 迄今为止 所有已开发的基因或基因组注释软件都只是针对某些特征编写 没有任何一个软件能毫无遗漏地包括所有情况 基因和基因组注释是一个不断完善的过程 需要根据不同的数据逐步进行检测与验证 22 2 实验分析确认基因 一 在基因组中搜寻基因 依据 任何基因都可以转录成RNA拷贝 根据mRNA的序列可以找到外显子的位置以及整个基因的组成 分子杂交 确定DNA片段是否含有表达序列cDNA测序 在DNA片段中进行基因作图 23 2 实验分析确认基因之分子杂交 一 在基因组中搜寻基因 Northernblot 指将待测DNA样品标记后与RNA杂交 若RNA中含有DNA的转录产物 会出现杂交信号但在操作中存在一些问题 分子杂交可确定DNA片段是否含有表达序列 24 Northern确认基因可能遇到的问题及对策 25 2 实验分析确认基因之分子杂交 一 在基因组中搜寻基因 Northern杂交不易检测到的基因怎么办 动物园杂交 zoo blotting 亲缘关系相近的物种 基因编码区相似性高 非编码区同源性低 因此将某一物种的DNA顺序与来自另一亲缘种的DNA片段杂交 如果产生阳性信号 则该区段可能含有基因编码区 26 Northernblot和Zooblot可以判断DNA片段中是否含有基因 但是不能给出基因定位信息 获得基因定位信息的最容易的方法是cDNA测序 2 实验分析确认基因之cDNA测序 一 在基因组中搜寻基因 cDNA测序可确定基因在DNA片段上的位置信息 cDNA是mRNA的复制本 因此与该基因的编码区对应 并且在编码区的两端还多出了同时被转录的前端序列和尾部序列 因此将cDNA序列与基因组DNA序列进行比较 就可以描述相应基因的位置并找到外显子 内含子边界 27 相关cDNA在cDNA文库中出现的频率 cDNA的完整性 2 实验分析确认基因之cDNA测序 一 在基因组中搜寻基因 cDNA捕获 cDNA筛选 排除无关克隆cDNA文库均一化 RACE技术获得全长cDNA序列 cDNA测序受两个方面的影响 通过对全长cDNA序列的测序 并与基因组DNA比较 即可确定基因所在的区域及外显子 内含子的位置 28 利用计算机分析基因功能实验分析确定基因功能其他的基因功能研究方法 二 基因功能的测定 29 1 利用计算机分析基因功能 二 基因功能的测定 种间同源基因 直系基因 不同物种之间的同源基因 来自物种分隔之前的同一祖先 种内同源基因 平行基因 同一种生物内部的同源基因 常是多基因家族的不同成员 平行同源基因 直系同源基因 2019 12 28 30 31 1 利用计算机分析基因功能 二 基因功能的测定 同源基因一般不会有完全一致的核苷酸序列 当一个新基因的序列被确认后 根据同源性可以从数据库中查找已知序列的同源基因 根据进化的相关 可以根据已知的同源基因推测新基因的功能 同源性分析可以给出整个基因或其中某一区段功能的有关信息 32 1 利用计算机分析基因功能 二 基因功能的测定 核苷酸一致性 76 氨基酸一致性 28 33 34 35 酵母基因组大约含有6000个基因 30 是通过传统遗传学分析得到的 另外70 是用同源性分析获得 同源搜索为人类疾病基因确定功能 1 利用计算机分析基因功能 二 基因功能的测定 肌萎缩性侧索硬化症运动失调性毛细血管扩张症结肠癌囊性纤维化肌强直性营养不良多发性神经纤维瘤 36 基因失活在基因功能分析的作用基因的超表达用于功能检测 2 实验分析确定基因功能 二 基因功能的测定 基因剔除RNAi转座子突变库 37 基因的功能是一个过程 是从基因到表型的一系列生理生化反应过程 传统的遗传分析是从表型出发最终到达基因 正向遗传学 而在基因组计划中研究基因功能则是从基因出发 最终到达表型 反向遗传学 基因失活是基因功能分析的主要手段 2 实验分析确定基因功能 基因失活在基因功能分析的作用 二 基因功能的测定 38 1 基因剔除 knock out 最简单的基因失活方法 用一段无关的DNA片段来取代目标基因 主要原理 用一段无关的核苷酸序列取代目标基因的中间序列 并将其导入生物体内或目的细胞内 如果该基因所控制的表型变化了 就从反面验证了目标基因的功能 2 实验分析确定基因功能 基因失活 二 基因功能的测定 39 利用同源重组法使基因失活 2 实验分析确定基因功能 二 基因功能的测定 1 基因剔除 knock out 40 例一 酵母缺失盒的应用 41 tk胸苷激酶标记基因 gangcyclovirneor新霉素抗性基因 G418 例二 基因剔除小鼠的制备 tk tk tk tk tk tk tk neo neo neo neo neo neo neo 42 例二 基因剔除小鼠的制备 43 2 实验分析确定基因功能 基因失活 二 基因功能的测定 2 RNAi技术RNA干扰是通过双链RNA的介导 特异性地降解相应序列的mRNA 从而阻断相应基因表达的转录后水平的基因沉默机制 44 RNAi作用机理 dsRNA核酸内切酶Dicer把dsRNA切割成21 25bp的RNA链 这些小干扰RNA siRNA 的一条链与靶mRNA碱基配对 随后被RDE 1核酸酶降解 从而导致目标基因沉默 2 实验分析确定基因功能 基因失活 二 基因功能的测定 45 基因片段反向连接成反向重复序列 使表达的单链RNA自我配对形成发夹结构RNA hpRNA 2 实验分析确定基因功能 基因失活 二 基因功能的测定 RNAi设计 46 2 实验分析确定基因功能 基因失活 二 基因功能的测定 3 转座子插入突变转座子随机插入功能基因内 使其失活 也可以用于基因功能研究 缺点 转座或多或少是一种随机事件 转座后不可能预测其具体位置 更适用于整体研究基因组的功能 其中基因是随机失活的 通过检查感兴趣的表型变化的后代来鉴别出具有相似功能的各类基因 47 在正常情况下 基因产物的数量是有限制的 必须与其它基因的产物平衡 某一基因产物的过量和不足都会破坏这种平衡 造成生长和发育的异常 有两种技术可以实现过量表达 增加基因的拷贝数 采用强启动子 2 实验分析确定基因功能 基因的超表达 二 基因功能的测定 48 2 实验分析确定基因功能 基因的超表达 二 基因功能的测定 高拷贝克隆载体 基因过表达 49 许多蛋白质必须与其他蛋白质互作 才能表现其功能 当鉴定了这类蛋白质的某些成员 则可采用某些方法分离与之互作的其他蛋白质 噬菌体展示 phagedisplay 酵母双杂交 yeasttwo hybridization 3 其他的基因功能研究方法 二 基因功能的测定 50 噬菌体展示将外源DNA片段与噬菌体外壳蛋白基因融合后 以融合蛋白的形式定位在噬菌体表面 被展示在噬菌体的表面的多肽或蛋白可保持相对的空间结构和生物活性 3 其他的基因功能研究方法之噬菌体展示 二 基因功能的测定 51 52 酵母菌双杂交原理真核生物中 转录因子与基因上游的特定DNA序列结合 然后激活RNA聚合酶 起始RNA的转录 3 其他的基因功能研究方法之酵母菌双杂交 二 基因功能的测定 53 酵母菌双杂交系统中 将编码这2个功能域的DNA分别构建在2个独立的表达载体上 在一个表达载体中 DNA结合功能域的基因片段与待测蛋白质的基