分子生药学.ppt

生药学这个学科的建立已经有近200年的历史 其间虽然也在不断的发展 然而对生药材鉴定技术而言 最初只是药材性状鉴别 也就是说药材的外部形态特征 色泽 断面 质地 气味等进行药材真伪鉴别 其后逐步发展为药材细胞组织形态特征为依据 其间还在真伪鉴别和质量研究中将理化方法引入 特别是以成分分析为依据 将各种光谱分析法应用得淋漓尽致 使生药学发展到一个新的高峰 分子生药学 生物分析技术 在分子水平上研究生药的鉴定 生产和成分的一门科学 所依据的主要是生药学和分子生物学的理论和方法 是生药学的一个极富前瞻性和前景性的分支 可以说 分子生药学不仅继承传统生药学的内容和使命 更将赋予生药学新的任务和挑战 分子生药学 生物分析技术 中国中医研究院中药研究所所长 黄璐琦 生药学中的一个分支学科 中药高产 优质 多抗性品种的培育濒危紧缺中药资源的保护和持续利用中药新的 便捷 准确的分子标识鉴定方法的研究从基因层次 为过去不能很好解决的问题如道地药材的研究 药材品质的定向调控等提供了新的方法和思路 分子生药学研究重点 药用植物的分子系统学研究药用植物种质资源的分子生物学研究生药的分子鉴定研究道地药材形成的分子机理研究珍稀濒危中药资源的遗传多样性分析和保护策略研究药用植物的抗性基因工程研究药用化学成分的生物转化及分子机理研究药用植物有效成分生物合成分子机理与调控的研究和药用植物细胞组织和转基因器官培养与活性成分生产等 分子生药学研究策略 分子遗传标记技术 通过直接分析遗传物质的多态性来诊断生物内在基因排布规律及其外在性状表现规律的技术 任何生物种或个体都具有特定的DNA多态性 通过直接诊断分析DNA的多态性 便能避开遗传特性表现过程中的环境因素 数量性状遗传或部分与完全显性的干扰 快速准确地鉴定药材真伪 DNA分子遗传标记技术已有20多种 认为五大类比较合适进行研究 分子生药学研究方法 1 以Southern杂交为基础的DNA分子标记技术2 以PCR为基础的分子标记技术3 以重复序列为基础的分子标记技术4 DNA序列分析 DNA分子遗传标记技术的优点 DNA分子标记不受发育时期和环境的影响 DNA分子标记在基因水平进行标记 不受取材部位 时间和环境的影响 而形态标记和生化标记都是基因表达的结果 其结果受发育和环境的影响 测定有时会不准确 DNA分子标记通常是共显性 表现的信息量大 可精确鉴定基因型组合 DNA分子标记多态性强 根据测得的大量标记位点绘制的连锁图 其多态信息量比形态标记高得多 利用DNA分子遗传标记和基因组序列分析技术 从居群 分子乃至基因水平上 准确刻划药用动植物遗传背景差异和亲缘关系 进而构建基于叶绿体基因组和 或 和基因组基因序列分析的重要药用动植物系统发育树 将是分子生药学基础研究的重心 目前可用于分子系统学研究的主要基因种类有 rbcL matK rps4 trnT trnF ITS等等 以叶绿体基因组片段为主 核基因应用较少但信息量巨大 生药的分子鉴定研究 高纯度的DNA模板的制备严格的TaqDNA聚合酶浓度和来源合适的镁离子浓度 太高会产生弥散背景 太低了得到的PCR产物条带淡 DNA复制原理的具体应用 PCR技术 PolymeraseChainReaction聚合酶链反应它是一种模拟天然DNA复制过程 在有DNA模板 DNA聚合酶 Taq酶 RNA引物和四种dNTP的情况下 通过高温变性 90 95 1 2min 低温退火 25 37 1 2min 中温延伸 60 75 90sec 5min 这样反复循环的过程中 在体外扩增特异性DNA片段的分子生物学技术 原理图 1 PCR反应成分 TaqDNA聚合酶引物浓度 一般0 1 0 5 mol LdNTP 一般为50 200 mol LMg2 模板 PCR对模板的要求不高 单 双链DNA均可 但样品中不能混有蛋白酶 核酸酶 DNA聚合酶抑制剂以及能与DNA结合的蛋白质 添加剂 DMSO 二甲基亚枫 提高扩增效率及特异性 1 理论上PCR合成产物的数量经过每轮循环都将增加一倍 应按2n 2n的指数方式递增 PCR反应30轮循环后 PCR扩增应达到230个拷贝 约109个拷贝 但由于DNA聚合酶的质量 待扩增片段的序列及反应系统的条件等各种因素的影响 实际扩增效率比预期的要低 一般可达106 107个拷贝 平台效应 PCR反应中 当引物 模板与DNA聚合酶达到一定比值时 DNA聚合酶催化反应趋于饱和 即PCR反应不再增加 平台效应在PCR反应中是不可避免的 但一般在平台效应出现前 PCR产物的数量足以满足实验的需要 2 PCR反应条件的优化PCR方法操作简便 但影响因素颇多 因此需要根据不同的DNA模板 摸索最适条件 主要从 反应的特异性 敏感性 忠实性 扩增效率等四个方面衡量PCR反应的结果 循环参数变性退火延伸 PCR反应成分 3 PCR反应引物的设计引物的设计在整个PCR扩增中占有十分重要的地位特异性 扩增性 引物的序列应位于基因组DNA的高度保守区 且与非扩增区无同源序列 这样可以减少引物与基因组的非特异性结合 提高反应的特异性 引物长度 15 30nt为宜 引物过短或过长均可使反应的特异性下降 引物的碱基尽可能随机发布 避免出现数个嘌呤或嘧啶的连续排列 G C碱基的含量在40 60 之间 引物内部应避免形成二级结构 特别是引物的末端应避免有回文结构 二个引物不应有互补序列 特别是3 端应避免互补 以免形成 引物二聚体 浪费引物 引物5 末端碱基无严格限制 在与模板DNA结合的引物长度足够的条件下 其5 端碱基可不与模板DNA互补而呈游离状态 因此可在引物5 端加上限制性内切酶位点 启动子序列或其它序列等以便于PCR产物的分析克隆等 引物的5 端最多可加10个碱基而对PCR反应无影响 PCR产物的分子克隆 克隆PCR产物的目的通常是 建立用于杂交分析的克隆化DNA的永久来源 得到高质量的DNA序列结果 以及当PCR扩增产生复杂混合产物时用于分离PCR目的片段 PCR产物的直接克隆可以通过对扩增片段进行合适的末端处理而提高效率 基本方案产生T A突出端TaqDNA聚合酶往往在所有的双链DNA3 末端再加上一个非模板来源的核苷酸 通常为A 使PCR片段的平端克隆往往效率不高 当只有dTTP存在时 TaqDNA聚合酶可在载体的平端加上一个T 这样就会产生一个与A配对的突出端 遗传标记 Geneticmarker 遗传学中通常将可识别的等位基因称为遗传标记 但随着遗传学和基因概念的发展其内涵也发展 除基因标记外遗传标记主要包括 3 蛋白质标记 非酶蛋白质和酶蛋白质在非酶蛋白质中 用得较多的是种子贮藏蛋白 酶蛋白质主要是同功酶 4 DNA标记 也称DNA多态性标记 DNA分子标记 是DNA水平上遗传多态性的直接反映 1 形态标记 是指那些能够明确显示遗传多态的外观性状 如株高 粒色等的相对差异2 细胞学标记 是指能够明确显示遗传多态的细胞学特征 如染色体结构上和数量上的遗传多态性等 这里仅介绍遗传的分子标记中的几种重要的分子标记 1 同工酶标记 同工酶 Isozyme 是一类分子结构不同 功能相似 催化同样的生化反应的酶 同工酶标记是利用编码同工酶的等位基因与同工酶酶谱的相关性及其共显性的特点进行染色体定位和遗传连锁分析 2 DNA分子标记 基于DNA DNA杂交的DNA标记 RFLP标记 restrictionfragmentlengthpolymorphism DNA某一位点上的变异有可能引起该位点特异性的限制性内切酶识别位点的改变 包括原有位点的消失或出现新的酶切位点 致使酶切片段长度随之发生变化 这种变化引起的多态现象即为限制性片段长度多态性 RFLP 对RFLP的检测主要是用Southern杂交的方法进行 即利用限制酶酶解及凝胶电泳分离不同生物体的DNA分子 然后用经标记的特异DNA探针与之杂交 通过发射自显影或非同位素显色技术来揭示DNA的多态性 图Southern 基于PCR的DNA标记 随机引物PCR标记 RAPD randomamplifiedpolymorphicDNA 标记 随机扩增多态性DNA 用随机短引物 人工合成的六核苷酸 进行DNA的PCR扩增 所扩增的DNA区段是事先未知的 具有随机性和任意性 因此随机引物PCR标记技术可用于对任何未知基因组的研究 RAPD原理 ISSR Inter simplesequencerepeats 标记 简单序列重复区间扩增多态性 利用基因组中常出现的SSR本身设计引物 无需预先克隆和测序 SSR simplesequencerepeats 标记 简单重复序列多态性 又称微卫星DNA多态性 即由二核苷酸 三核苷酸或四核苷酸串联重复的拷贝数目不等而出现的多态现象 76 基于PCR与限制性酶切技术结合的DNA标记 AFLP amplifiedfragmentslengthpolymorphism 标记 扩增片段长度多态性 通过对基因组DNA酶切片段的选择性扩增来检测DNA酶切片段长度的多态性 AFLP揭示的DNA多态性是酶切位点和其后的选择性碱基的变异 AFLP原理 单核苷酸多态性的DNA标记 SNP singlenucleotidepolymorphism 标记 单核苷酸多态性 不同个体基因组DNA序列同一位置上的单个核苷酸的差别 其比较的不是DNA的片段长度 而是相同序列长度里的单个碱基的差别 SNP 主要类型的DNA分子标记的技术特点比较 RAPD标记已被广泛应用于分子生药学各方面 生物多样性 随着植物药研究的不断深入 可持续开发利用药用植物资源的问题越来越受到重视 应用RAPD技术进行药用植物生物多样性研究 可以在遗传多样性水平上了解天然产物多样性与物种 生态及地理分布的关系 挖掘潜在的药物资源 为开发新药寻找途径 RAPD方法可以检测物种的遗传多样性 探讨物种的亲缘关系和进化趋势 因此它是药用植物资源保护和种质资源保存的依据 特别是对濒危物种的研究更具有实际意义 舒艳群 白守梅 陈毓亨 RAPD技术在药用植物研究中的应用 中草药 1999 30 2 147 RAPD标记可用于生药分类 在DNA分子水平上鉴别生物不同种 亚种 变种甚至株 RAPD标记可用来制作生物类生药系统发育关系上的树状图 特别是种内水平 这为生药亲缘进化关系 寻找新的药用资源开辟了新途径 RAPD标记可用于构建基因图谱 进行基因定位 和对未知序列的DNA片段扩增与测序 RAPD标记亦可用于遗传连锁图谱的构建 指导药用植物育种 防止品种间杂化和自交 选育优良性状的品种 DNA分子鉴定前景广阔 我国生药品种繁多 来源复杂 根据最新统计 药用动植物约有12000种左右 但由于历史 地理 人为等因素 加之研究手段的局限性 长期以来我国生药仍处于品种混乱和质量难以保证的不利局面 很大程度上制约了中医药的发展 而DNA分子鉴定法 将使生药鉴定技术得以创新 而使得中医药的发展真正走向现代化 标准化 国际化之路 鉴定近缘生药品种 鉴定名贵易混淆生药 鉴定动物类生药 鉴定药材道地性 鉴定生药野生与家种 刻划生药质量标准化 鉴定中药原粉制剂 等方面具有重要应用价值 范例一 黄芪药材的植物来源复杂 药典 收载2种植物 膜荚黄芪 A membranaceusFisch Bge 和蒙古黄芪 A membranaceusFisch Bge Var mongholicus 此外还有地方不同属植物红芪 由于市面上黄芪经过加工后 多种形态发生变化 而且近缘种形态特征相似 仅从形态学 化学成分鉴定 困难较大 利用RAPD 随机扩增多态性 进行相关研究 就可以从基因水平揭示黄芪遗传本质 为黄芪鉴定提供依据 RAPD 叶绿体matk基金石斛鉴定真伪品兰科石斛属5种植物金钗石斛 铁皮石斛 束花石斛 粉花石斛 流苏石斛资源短缺造成石斛属30余种植物和近缘属的多种植物充斥与药材市场 因此有必要利用分子标记技术对真伪品进行区分 范例二 药典收录石斛 伪品 系统发育进化树 方法特点 利用DNA测序技术 测定真伪品石斛matk基因核苷酸序列变化 通过核苷酸序列变化程度 利用进化分析软件 进行系统发育树构建 得出亲缘关系 从核酸水平揭示真伪品区别 范例三 野生与杂交天麻的DNA标记鉴定天麻是 中国药典 收载名贵中药天麻的唯一入药品种 其块茎入药 天麻传统的原植物鉴定 性状鉴定 显微鉴定 理化鉴定等方法 均不能准确区分野生与杂交