毕业设计（论文）-铜绿假单孢菌色素产生最佳培养条件及色素稳定性研究.doc

河河 南南 科科 技技 大大 学学 毕 业 设 计 论 文 铜绿假单孢菌色素产生最佳培养条件及色素稳定性研究铜绿假单孢菌色素产生最佳培养条件及色素稳定性研究 THE OPTIMUM CULTURE CONDITIONS AND THE STABILITY OF THE PIGMENT OF PSEUDOMONAS AERUGINOSA PIGMENT PRODUCTION 姓姓 名 名 院院 系 系 动物科技学院动物科技学院 专专 业 业 动物医学动物医学 指导教师 指导教师 2014 年年 6 月月 3 日日 I 毕业设计 论文 任务书毕业设计 论文 任务书 指导教师填表 填表时间 2014 年 1 月 2 日 学生姓名 专业 班级 动医 102 班 指导 教师 课题 类型 论文 题目铜绿假单孢菌色素产生的最佳培养条件及色素稳定性研究 主要研 究内容 1 采用正交方法对产色素的最佳培养条件进行优化 如环境因素 中的温度光照等 营养因素中的碳源 氮源 无机盐及 pH 值 等 并确定最佳培养基组分 2 不同温度 pH 金属离子 光照 氧化剂 还原剂等外界因素 对色素稳定性的影响 并确定最佳保存条件 主要技 术指标 或 研究目标 对实验室筛选保存的铜绿假单孢菌产色素的最佳培养条件进行 优化 并进一步外界环境因素对色素稳定性的影响进行研究 试验结束后 完成 10000 字以上的毕业论文写作 并需要完成 大约 10000 英文字符 大约 2000 汉字 的英文资料的翻译工作 进度计划 2014 1 7 2014 2 28 查阅国内外资料 撰写开题报告 2014 3 1 2014 3 31 产色素的最佳培养条件优化 2014 4 1 2014 4 30 外界因素对色素稳定性的影响 2014 5 1 2014 6 15 整理试验数据 撰写毕业论文 准备论文答辩 主要参 考文献 1 丛延广 刘俊康 袁泽 等 形态受培养温度影响的绿脓杆菌菌 株 J 微生物学通报 2001 28 2 76 78 2 李永明 徐玲 陈宏远 鸡源铜绿假单胞菌的生物学特测定 J 中国兽医杂志 2004 40 9 21 22 3 龚良玉 王修林 李雁宾 等 铜绿假单胞菌产吩嗪类色素的分 离纯化及其对赤潮生物生长的影响 J 复旦学报 2004 43 4 494 499 4 徐海津 单志英 林伟利 等 铜绿假单胞菌色素代谢相关基因 的研究 J 微生物学报 2005 45 1 14 18 教研室主任签字 年 月 日 II 铜绿假单孢菌色素产生的最佳培养条件及 色素稳定性研究 摘 要 铜绿假单胞菌 P Aeruginosa 是在机体免疫力低下等特殊情况下引起机体感 染的一种条件致病菌 含绿脓素等多种致病因子 绿脓素为蓝绿色的吩嗪类化合 物 与该菌的感染性和致病性密切相关 同时 该色素又可作为抗菌剂和食品着 色剂进行应用 另外 对铜绿假单胞菌产色素培养特性的观察是微生物学本科实 验教学中的项目之一 而色素的产生及产生的浓度受诸多因素影响 在学生试验 中很多学生并不能观察到色素的产生现象或产生色素现象不明显 本实验通过对 铜绿假单胞菌培养组分不同碳源下 不同氮源下 不同无机盐下分别接种细菌观 察色素产生情况 在最佳培养组分基础上 培养条件不同温度 不同 pH 不同 光照下产色素的情况进行研究 可以发现在不同培养组分条件下 铜绿假单胞菌 的最佳碳源为乳糖 最佳氮源为蛋白胨 最佳无机盐 K2HPO4 在不同培养条件 下 铜绿假单胞菌的最佳培养温度为 37 最佳 pH 为 7 2 最佳光照条件为黑 暗 本研究有利于对铜绿假单胞菌绿脓素合成机制的研究 有利于学生实验教学 的顺利开展 也为该色素进一步的开发应用奠定基础 关键词关键词 铜绿假单胞菌 色素 培养组分 条件 III THE OPTIMUM CULTURE CONDITIONS AND THE STABILITY OF THE PIGMENT OF PSEUDOMONAS AERUGINOSA PIGMENT PRODUCTION ABSTRACT Pseudomonas aeruginosa P Aeruginosa is a condition caused by the infection of the pathogen in the immunocompromised and other special circumstances including pyocyanin and other pathogenic factors pyocyanin as blue green phenazine compounds and is closely related to the infection and pathogenicity At the same time the pigment can be used as antibacterial agent and colouring agent for food application Therefore to observe the cultural characteristics of pigments produced by Pseudomonas aeruginosa is one of the projects of undergraduate experimental teaching in microbiology And the pigment production and concentration is affected by many factors in the student test many students can not produce the phenomenon observed pigment or pigment producing phenomenon is not obvious The experiment based on Pseudomonas aeruginosa culture components under different carbon sources different nitrogen sources inorganic salts were inoculated with bacteria observed pigment production At the optimum composition based on the culture conditions different temperature different PH different light on pigment production can be found in the different culture components under the conditions the best carbon source of Pseudomonas aeruginosa to lactose peptone was the best nitrogen source the best inorganic salt K2HPO4 Under different culture conditions the optimal culture temperature of Pseudomonas aeruginosa was 37 the optimum PH is 7 2 the best light into darkness This research is conducive to Pseudomonas aeruginosa pyocyanin synthesis mechanism benefit students experimental teaching but also lay the foundation for the development and application of the pigment further KEYKEY WORDSWORDS Pseudomonas aeruginosa pigment training component conditions IV 目 录 1 前言 1 1 1 铜绿假单胞菌的生物学特性 2 1 2 铜绿假单胞菌的流行病学 2 1 3 铜绿假单胞菌的致病性 3 1 3 1 绿脓素 3 1 3 2 外毒素 A 4 1 3 3 胞外酶 S 5 1 3 4 铜绿假单胞菌的防制 6 1 4 本研究的目地及意义 6 2 材料与方法 7 2 1 实验材料 7 2 1 1 菌株来源 7 2 1 2 实验试剂 7 2 1 3 试验所用器材及仪器 7 2 1 4 普通培养基的配制 7 2 2 实验方法 8 2 2 1 细菌的复苏培养 8 2 2 2 细菌的纯化培养 8 2 2 3 不同培养基组份对绿脓假单胞菌产色素的影响 8 2 2 4 不同培养基条件对绿脓假单胞菌产色素的影响 8 3 结果 9 3 1 细菌的复苏和纯化培养结果 9 3 2 细菌在不同培养组分与条件下培养产生色素的结果 10 3 2 1 不同培养基组分对绿脓假单胞菌产色素的影响 10 3 2 2 不同培养基条件对绿脓假单胞菌产色素的影响 18 4 讨论 24 4 1 铜绿假单胞菌的致病性方面 24 4 2 不同培养组分对铜绿假单胞菌色素产生的影响 25 4 3 不同培养条件对铜绿假单胞菌色素产生的影响 26 5 结论 26 5 1 铜绿假单胞菌在不同培养基组分下的色素的情况 26 5 2 铜绿假单胞菌在不同培养条件下的色素的情况 26 V 参考文献 27 致 谢 29 外文资料译文及原文 30 1 1 前言 铜绿假单胞菌是 1882 年首先由 Gersard 氏从伤口脓液分离得到 1 铜绿假单 胞菌 P Aeruginosa 原称绿脓杆菌 在自然界分布广泛 土壤 水 空气 正常 人的皮肤 呼吸道和肠道等都有该菌存在 铜绿假单胞菌为条件致病菌 在特定 的情况下能引起人及动物感染发病 常从正常禽的肠道 呼吸道和卵中分离出来 能引起各种年龄的禽发病 致死率在 1 90 以上 2 应激是幼禽暴发绿脓杆菌 病的主要原因 该菌给规模化养殖场和人类的健康造成了很大威胁 在人医上铜 绿假单胞菌能引起感染 还能引起人的关节炎和角膜炎等疾病 3 免疫力下降是 重要的发病诱因 绿脓杆菌的毒素残留还能引起食物中毒 4 但是完整皮肤是天 然屏障 活力较高的毒素亦不能引起病变 正常健康人血清中含有调理素及补体 可协助中性粒细胞和单核细胞巨噬细胞吞噬及杀灭铜绿假单胞菌 故亦不易致病 但如改变或损伤宿主正常防御机 如皮肤黏膜破损 留置导尿管 气管切开插管 或免疫机制缺制损如粒细胞缺乏 低蛋白血症 各种肿瘤患者 应用激素或抗生 素的患者 在医院环境中常可从带菌发展为感染 烧伤焦痂下 婴儿和儿童的皮 肤 脐带和肠道 老年人的泌尿道 常常是铜绿假单胞菌败血症的原发灶或入侵 门户 铜绿假单胞菌是人类的三大致病菌之一 是引起肺炎的首要致病菌 受该 菌感染后 常可产生绿色脓汁 故习惯上称之为绿脓杆菌 铜绿假单胞菌能引起 动物发病 给养殖业造成了严重的经济损失 而且对人也有一定的危害 因此 对铜绿假单胞菌的研究既是保障养殖业健康发展的重要环节 也是保证人民身 体健康的重要举措 铜绿假单胞菌导致的致病性是有多种致病因子所引起的 包括菌体表面物质 内毒素 菌体外产生的物质 外毒素 A 绿脓素和各种细胞外酶 蛋白酶 弹性蛋 白酶 磷脂酶 胶原酶及碱性磷酸酶等 其中绿脓素为 P Aeruginosa 所特有 可 抑制机体吞噬细胞的吞噬作用 是一种抗菌素样物质 与感染性和致病性密切相 关 绿脓杆菌感染动物和人类的组织后 分泌绿脓素诱导嗜中性粒细胞凋亡 破 坏由其介导的免疫防御机能 绿脓素通过灭活 a1 蛋白酶抑制因子影响肺丝氨酸 蛋白酶活性 与肺囊性纤维化疾病密切相关 铜绿假单胞菌合成的绿脓素除了拥 有感染性和致病性以外 绿脓素等色素还具有抑制真菌和革兰氏阴性细菌生长的 作用 如对光滑念珠菌就具有很强的抑制作用 对柠檬酸杆菌属也表现出明显的 抗菌效果 而它作为食品着色剂 也有广阔的前景 我们知道许多微生物色素已 经商品化 法夫酵母的虾青素 粉红色的草酸青霉 棉蚜核黄素等 铜绿假单胞 菌色素也有饮料 糕点 糖果制造商作为着色剂的潜在特性 也可用于装饰盒陈 设的食品用等 2 1 1 铜绿假单胞菌的生物学特性 铜绿假单胞菌属于非发酵革兰氏阴性杆菌 菌体细长且长短不一 有时呈球 杆状或线状 成对或短链状排列 菌体的一端有单鞭毛 在暗视野显微镜或相差 显微镜下观察可见细菌运动活泼 扫描电镜下铜绿假单胞菌菌体两端钝圆 呈直 秆状 大小为 1 67 2 29 0 42 um 排列不规律 呈现不同层次 疏密不均的 分布状念 无芽胞 粘液型菌株有多糖荚膜或糖萼 具有抗吞噬作用 本菌为专 性需氧菌 生长温度范围 25 42 最适生长温度 25 30 特别是该菌在 4 不 生长而在 42 可以生长的特点可用以鉴别 本菌在普通培养基上生良好 菌落形 态不一 多数直径 2 3mm 边缘不整齐 扁平湿润 并能产生水溶性的色素 如绿 脓素 pyocynin 与带荧光的水溶性荧光素 pyoverdin 等 在血琼脂平板上形 成透明溶血环 液体培养呈混浊生 并有菌膜形成 铜绿假单胞菌分解蛋白质能力甚强 而发酵糖类能力较低 分解葡萄糖 产 酸不产气 不分解甘露醇 乳糖及蔗糖 能液化明胶 分解尿素 不形成吲 氧 化酶试验阳性 可利用枸椽酸盐 绿脓杆菌含有 O 抗原 菌体抗原 以及 H 抗 原 鞭毛抗原 O 抗原含有内毒素和原内毒索蛋白质两种成份 原内毒素蛋白 质是一种高分子 低毒性 免疫原性强的保护性抗原 不仅存在于不同血清型绿 脓杆菌中 而且广泛存在于假单胞菌属的其他细菌以及肺炎球菌 大肠杆菌 霍 乱弧菌等 G 细菌中 是一种良好的交叉保护抗原 另外 O 抗原可以分型 临床上培养的铜绿假单胞菌菌落能产生两种水溶性色素 一种是绿脓索 Pyocyanin 溶于氯仿 无荧光性 具有抗菌作用 另一种为荧光素 呈绿色 绿脓素只有绿脓杆菌能产生 具有诊断意义 而对于这两种色素生长的最佳条件 及保存条件是本项研究的重点 1 2 铜绿假单胞菌的流行病学 绿脓杆菌病的发生不分季节一年四季都可发生 人和各种动物对铜绿假单胞 菌都有易感性 由于该菌在自然界中分布广泛 因此 在烧伤外科创伤以及术 后或其他疾病如奶牛子宫炎 乳房炎等往往都会为该菌的继发性感染创造条件 在畜禽饲养管理条件低劣或幼年畜禽长途运输过程中因应激反应导致体质下降 特别是环境污染及注射用具消毒不严时 可经消化道 呼吸道的创伤引起群体绿 脓杆菌病的暴发流行 4 出生雏鸡接种马立克病疫苗时注射用具及疫苗的污染是 该病近年来常见的发病原因 3 1 3 铜绿假单胞菌的致病性 铜绿假单胞菌是医院内感染的主要病原菌之一 感染可发生人体任何部位和 组织 常见于烧伤或创伤部位 中耳 角膜 尿道和呼吸道 可引起心内膜炎 胃肠炎 脓胸 铜绿假单胞菌还常引起败血症 在小儿还可引如沙门氏菌肠炎及 霍乱样的症状 患代谢性疾病 血液病和恶性肿瘤患者 以及术后或某些治疗后 的患者容易感染此菌 铜绿假单胞菌可以通过交叉感染 环境污染 医源性感染 内源性感染等方式造成机体感染 尤其是患有其它基础疾病患者的下呼吸道感染 导致 PA 舯炎 6 铜绿假单胞菌在医院感染上的重要性不仅表现在感染的高发上 由于铜绿假单胞菌本身具有天然的后天获得的抗药性 耐药发展迅速 因此往往 给治疗上带来困难 铜绿假单胞菌有多种致病因子 包括菌体表面物质内毒素 菌体外产生的物 质 外毒素 A 绿脓素和各种细胞外酶 蛋白酶 弹性蛋白酶 磷脂酶 胶原酶及 碱性磷酸酶等 其中绿脓素为 P Aeruginosa 所特有 可抑制机体吞噬细胞的吞噬 作用 是一种抗菌素样物质 与感染性和致病性密切相关 铜绿假单胞菌感染动 物和人类的组织后 分泌绿脓素诱导嗜中性粒细胞凋亡 破坏由其介导的免疫防 御机能 而外毒素 A 胞外酶 S 等也是熟知的毒力因子 1 3 1 绿脓素绿脓素 1 3 1 1 绿脓素的合成机制 目前 国内缺乏对铜绿假单胞菌色素形成机制的相关报道 国外近年来有许 多科学家涉足此领域 假单胞菌属中有很多种分泌色素的细菌 在有关荧光假单 胞菌中报导了关于荧光紫和绿脓素代谢中间产物酚嗪 1 羧峻合成的结构基因 7 随后 Mavrodj 报导了绿脓素合成的途径 8 绿脓素由色氨酸合成的重要中间产物 分枝酸 chori smic acid 开始合成 由七个基因组成的操纵子控制合成中间产物 酚嗪 1 羧酸 再由酚嗪 1 羧酸经过甲基化和脱羧 分别由绿脓杆菌特有的 phzM 哺 phzS 基因控制 合成酚嗪 1 羧酸的操纵子在绿脓杆菌基因组内有两个 分别 命名为 phzA1B1C1D1E1F1G1 和 phzA2B2C2D2E2F2G2 两个操纵子序列 99 同 源表达产物功能相同 在基因组上的位置相隔很远 上下游基因和转录调控元件 不同 铜绿假单胞菌存在两套几乎完全相同的操纵子来完成酚嗪 1 羧酸的合成 推测与其复杂的色素合成调控机制有关 需要进一步深入的研究 1 3 1 2 绿脓素的致病性 绿脓素是铜绿假单胞菌在某种特殊生理状态下分泌的次生代谢产物 由于与 感染性和致病性密切相关 被认为是一种毒力因子 铜绿假单胞菌感染动物和人 4 类的组织后 分泌绿脓素诱导嗜中性粒细胞凋亡 破坏由其介导的免疫防御机能 9 体外实验表明 绿脓素诱导浓度和时间依赖性的嗜中性粒细胞凋亡的加速过 程 5 小时内 50 毫克的绿脓素将嗜中性粒细胞凋亡的速度提高了 10 倍 而对于 单核细胞和呼吸道上皮细胞没有以上作用 绿脓素诱导的嗜中性粒细胞凋亡快速 而持续地产生活性氧中间产物并继发细胞内 cAMP 的降低 采用抗氧化剂或 cAMP 类似物处理嗜中性粒细胞可以明显地消除绿脓素的影响 可以说绿脓素诱 导的嗜中性粒细胞凋亡对临床上绿脓杆菌的持续感染是非常重要的机制 绿脓素通过灭活 1 蛋白酶抑制因子 alphal P1 影响肺丝氨酸蛋白酶活性 与 肺囊肿性纤维化疾病密切相关 10 囊肿性纤维化病 cyslj c brosis CF 是白种人种最 常见的致死性常染色体隐性遗传病 白种人最常患上此病 大约每 2 500 个初 生婴儿中 便有一个会患上这种基因遗传疾病 非洲人和亚裔人患上此病则较少 这是因为健康人呼吸系统存在蛋白酶和抗蛋白酶活性的动态平衡 一般认为 绿 脓素参与氧化还原 诱导细胞产生活性含氧物 reac tive oxygen species 活性含氧 物对 l 蛋白酶抑制因子有灭活作用 从而最终破坏平衡 Britjgan 发现 绿脓素 可能与 l 蛋白酶抑制因子发生直接相互作用 结合成过氧化物 导致蛋白酶活性 异常升高 造成组织的伤害 绿脓素和 1 羟基酚嗪还会抑制呼吸道上皮细胞的纤毛运功能力 利于绿脓杆 菌在呼吸道内形成生物被膜 所谓生物被膜是指细菌吸附于机体腔道 非活跃组 织细胞或人工植入物 如心脏瓣膜 导尿管 气管插管等 的表面 繁殖 分化 并分泌多糖基质 纤维蛋白 脂蛋白等 将其自身包绕其中而形成的具有复杂三 维结构的细菌聚集体膜状物 生物被膜作为一种屏蔽可以保护细菌免受机体免疫 系统或抗菌药物的杀灭 10 呼吸道粘膜主要靠复层柱状纤毛运动 并借助分泌物 粘附微生物 通过喷嚏 咳嗽 咯痰等方式将病原体排出体外 研究表明 绿脓 素和另一种铜绿假单胞菌酚嗪类代咐物 1 羟 j 基酚嗪均能引起纤毛运动渐进性减 慢并最终停滞 使气道净化能力减弱 便于菌落附着 从而有利于产生生物被膜 生物被膜一旦形成 无论是机体免疫系统 还是抗生素治疗 都难以奏效 铜绿假单胞菌合成的色素除了拥有感染性和致病性以外 绿脓素等色素还具 有抑制真菌和革兰氏阴性细菌的作用 1 3 2 外毒素外毒素 A 铜绿假单胞菌外毒素 A Pseudomonas aeruginosa exotoxin A PEA 是由假单胞 菌属铜绿假单胞菌 Pseudomonas aeruginosa 分泌的一种细胞毒性外毒素 是铜绿 假单胞菌重要的致病因子 1972 年 P v Liu 在临床分离株的培养液中 发现了 导致铜绿假单胞菌感染的毒性因子 外毒素 A 12 并指出铜绿假单胞菌外毒紊 5 A PEA 对皮肤黏膜有坏死作用 进入血液中能诱发败血症 在脏器组织细胞中 铜绿假单胞菌外毒索 A 与白喉毒素类似 都是在辅酶 I NAD 的存在下使延长因 子 2 EF 2 失活 导致多肽链无法延长 其机理是 PEA 的转移酶活性催化烟酰 胺腺嘌呤二核苷酸 NAD 水解成烟酰胺 N 和二磷酸腺苷核糖 ADPR 两部分 并 催化 EF 2 与 ADPR 共价结合 使 EF 2 发生腺嘌呤二磷酸核糖基化 失活 结果 肽链无法延长 蛋白质的合成随之终止 PEA 的 ADP 一核糖基转移酶活性能使 靶细胞的延伸因子 2 EF 2 发生核糖基化而失活 结果肽链无法延长 蛋白质的 合成随之终止 从而对细胞产生毒性作用 利用 PEA 的这一毒性作用 将其与靶 向蛋白 抗体或靶细胞膜受体配基 连接或融合制成的免疫毒素被广泛用于癌症的 靶向治疗 PEA 除具有上述细胞毒性作用外 还具有较强的免疫原性 在食品 中铜绿假单胞菌的鉴定 癌症治疗及作为抗原携带蛋白生产去势疫苗等方面都有 广阔的应用前景 它不仅可作为疫苗蛋白 也是一种重要的疫苗佐剂和疫苗载体 13 1 3 3 胞外酶胞外酶 S 铜绿假单胞菌胞外酶 S ExoS 目前已被认定是一种毒力因子 但是它在细菌 致病性上的精确作用尚不完全清楚 另外 ExoS 被命名为胞外酶 Exoenzxme 并 不意味着它具有像外毒素 如 PEA 那样的细胞外存在方式 它是由细菌合成后 在与宿主细胞直接接触过程中 通过 型分泌系统形成的蛋白运转孔道直接被运 输到宿主细胞中 14 Iglewski 等 15 1978 首先报道铜绿假单胞菌具有另外一种 ADPR 转移酶活性 的毒性蛋白 其酶促活性与 PEA 相似 但与 PEA 的作用机制不同 它作用于延 长因子 1 EF 1 1984 年他与 Ncias 等利用铜绿假单胞菌培养上清对所谓的 ExoS 进行了分离纯化结果提纯出 49KD 和 53KD 两个蛋白组分 即无 ADPR 酶活性的 53KDa 蛋白和有 ADPR 酶活性的 49KDa 蛋白 这两种蛋白都不溶于水 需要变 性剂才能纯化 所以给小鼠注射多达 5ug 22ug 小鼠的纯化胞外酶 s 蛋白时 不 表现出毒性 90 年代中期 对 ExoS 的研究取得了突破性进展 分子生物学研究证实所谓 的 ExoS 的 53KD 和 49KD 两种蛋白是由两个完全独立的基因所编码 49KD 蛋白 是真正的 ExoS 等 而 53KD 的蛋白是 ExoT 但是 ExoT 的 ADPR 转移酶活性只 有 ExoS 的 0 2 Pederson 等 16 2002 基于对 ExoS 研究的最新资料 提出了 ExoS 的蛋白功能区的作用方式 由 253 个氨基酸组成的 ExoS 蛋白分子 具有三 个不同的功能区 第一个功能区由蛋白质分子中 N 端第 1 234 位氨基酸残基组成 被称之为 ExoS N 该功能区具有 GTP 酶活化蛋白的作用 它可以加快 GTP 水解 6 成 GDP 从而导致宿主细胞骨架重组 第二个功能区由蛋白质分子中第 234 453 位氨基酸组成 它是 ExoS 的中心功能区 具有 ADPR 活性 这种活性作用 与菌株的毒力密切相关 尽管 ExoS 的 ADPR 活性功能区对多种底物都发生作用 但主要是作用于 GTP 酶家族的 Ras Rap 和 Rab 体外实验证实 当 Ras 分子中 Arg4l 被 ADP 核糖基化后 可以抑制 GTP 酶的活化 从而导致宿主细胞的死亡 因此 ExoS 可以通过两种不同的作用途径来抑制两种不同类型的 GTP 酶 第三 个功能区由 ExoS 蛋白分子中第 400 453 位氨基酸组成 该功能区可以与通过其 分子中的 DALDLA 序列结构与真核胞 14 3 3 蛋白结合 从而产生两种效应 一 是使 ADPRT 活化 二是与结合 14 3 3 蛋白的内源性蛋白发生竞争作用 这两种 效应的结果可导致宿主细胞的死亡 尽管 ExoS 在细菌致病机理中所起的详细作 用尚有待于进一步研究 但是通过对 ExoS 结构与功能区所发挥的三种毒性的协 凋作用 可以有效地破坏巨噬细胞的功能 从而导致细菌的侵入和扩散 1 3 4 铜绿假单胞菌的防制铜绿假单胞菌的防制 预防铜绿假单胞菌病 对于人类而言 应该加强医院器械 设备 环境的消 毒 伤患的伤口安全处理等 对于动物 则应从改善养殖场饲养管理条件 加强 兽医卫生措施着手 由于用药物后很易产生耐药性 所以发病后做药物敏感性试 验然后选择敏感的药物对治疗绿脓杆菌病是很有必要的 有报道认为高免血清注 射保护力为 100 大量注射庆大霉素亦有较好疗效 口服治疗的效果较差 但 对大群雏鸡而言为了节省工作量通过口服大剂量庆大霉素或链霉素亦有防治作用 有报道认为 大蒜素具有杀灭绿脓杆菌的作用 孙卜权等报道 18 郁金散治疗鸭绿 脓杆菌病效果显著 近年来 余丹凤等对黄芪多糖抗呼吸道绿脓杆菌感染进行了 实验研究 19 其实验表明 黄芪多糖能使缺损的黏膜上皮修复从而抵抗铜绿假 单胞菌在呼吸道的黏附 其药效与剂量有关 另外杨名贵 20 也报道了中西结合治 疗雏鹅绿脓杆菌病的实验 将郁金香 黄连 柏紫花地丁 仙鹤草 五味子 黄 芪 白芍 诃子 大黄 甘草用于病鹅和疑似病鹅的辅助治疗和假定健康鹅的疾 病防治 收到了理想的效果 这些实验给绿脓杆菌病的预防和治疗带来了新的思 路 1 4 本研究的目地及意义 铜绿假单胞菌是导致许多急性和慢性感染的重要细菌 广泛存在于环境中 由于铜绿假单胞菌对人类和动物都能引起严重疾病 可能在人禽间造成交叉感染 给人类公共卫生安全造成了严重隐患 因此 对铜绿假单胞菌病展开研究不但具 有重要的兽医卫生学意义 而且具有重大的医学公共卫生学意义 而铜绿假单胞 菌产生的众多毒力因子是其致病的重要原因 绿脓素也是其中重要的致病因子之 7 一 绿脓素的产生更是其鉴定铜绿假单胞菌的方法之一 因此 研究铜绿假单胞 菌显得尤为重要 近年来国内外学者对铜绿假单胞菌的分子遗传学 致病因子及 其致病机理以及检测等方面进行了大量的研究 取得了较大的进展 同时就本实验而言 本实验为了研究铜绿假单胞菌色素产生的最佳培养条件 及保存条件 通过对不同的培养组分碳源 氮源 无机盐 不同的培养条件温度 pH 光照等因素进行条件优化 确定出了最佳的培养条件和保存条件 对于以后 铜绿假单胞菌色素方面的相关研究提供参考 由于绿脓杆菌也常在工业管道中形 成 因此 本实验对铜绿假单胞菌合成机制的研究和对临床治疗及环境保护都有 着极其重要的作用 2 材料与方法 2 1 实验材料 2 1 1 菌株来菌株来源源 铜绿假单胞菌由河南科技大学预防兽医预备室保存 2 1 2 实验试剂实验试剂 革兰氏染色剂 草酸铵结晶紫 碘液 95 酒精 石碳酸复红 香柏油 二 甲苯 蒸馏水 75 医用酒精 牛肉膏 来自北京奥博星生物技术有限责任公司 葡萄糖 来自北京奥博星生物技术有限责任公司 乳糖 来自天津市天达净化材 料精细化工厂 蔗糖 蛋白胨 酵母膏 来自北京双旋微生物培养基制品厂 胰蛋白 来自北京奥博星生物技术有限责任公司 NH4 2SO4 来自天津石英 钟厂霸州市化工分厂 NaCl 来自汕头市化学试剂厂 KCl 来自汕头市化 学试剂厂 K2HO4 3H2O 来自汕头市化学试剂厂 2 1 3 试验所用器材及仪器试验所用器材及仪器 电热恒温培养箱 型号HH B11600 上海跃进医疗器械厂 电热恒温水 浴锅 H H S 型 上海博讯实业有限公司医疗设备厂 超净工作台 SW CJ IFD型 上海贺德实验设备厂 电子天平 型号BS210S 德国 Sartorius 公 司 冷藏冷冻箱 型号BCD 252CKX 河南新飞电器有限责任公司 8 2 1 4 普通培养基的配制普通培养基的配制 普通培养基 用电子天平称取牛肉膏 0 5 1g 蛋白胨 1g NaCl 0 5 琼脂 粉 1 5g 分别倒入灭菌的 100ml 三角瓶中 用量筒量取 100ml 蒸馏水 倒入三角瓶 加热搅匀盖上瓶塞摇匀 然后压线 将其与包好的平皿一并放入高压锅内 于 121 20min 高压灭菌 待温度降至 100 以下时取出 放入超净工作台内 然后 倒入灭菌过的平皿中 冷却后 放入冰箱备用 2 2 实验方法 2 2 1 细菌的复苏培养细菌的复苏培养 点燃酒精灯 将斜面保存有铜绿假单胞菌的试管塞子打开 将接种环在火焰 上烧至发红 等接种环冷却后 把菌从斜面挑出 然后分区 4 个区域 划线 划好后用记号笔在平板上表明菌种名称 日期 时间及姓名 最后将接好的平板 放入 37 恒温培养箱中培养 16 24h 在此期间 观察并记录细菌的生长情况及菌 落特征 2 2 2 细菌的纯化培养细菌的纯化培养 从培养好的普通培养基上的第四个区域内挑取单个菌落划线接种于另一空白 的普通培养基平板上 与上述同样划4个区域 做纯化培养 置培养箱中 37 培养12 24h后观察平板上细菌的生长情况 细菌的形态 大小 色泽 透明度 有无荧光等 如此反复 纯化3代 2 2 3 不同培养基组份对绿脓假单胞菌产色素的影响不同培养基组份对绿脓假单胞菌产色素的影响 2 2 3 1 碳源 在最佳无机盐基础上 保持氮源不变 配制不同的碳源牛肉膏 葡萄糖 乳 糖 蔗糖的培养基 37 下培养 接菌 16 小时后每隔两小时观察色素产生情况 直至颜色变淡 确定最佳氮源培养成分 2 2 3 2 氮源 在最佳无机盐及碳源基础上配制不同的氮源蛋白胨 酵母膏 胰蛋白 NH4 2SO4的培养基 37 下培养 接菌 16 小时后每隔两小时观察色素产生情况 直 至颜色变淡 确定最佳氮源成分 以此确定最佳培养组分 2 2 3 3 无机盐 9 保持碳源 氮源 pH 不变 配制不同的无机盐 NaCl MgSO4 KCl K2HPO4的培养基 37 下培养 接菌 16 小时后每隔两小 时观察色素产生情况 直至颜色变淡 确定最佳培养无机盐成分 2 2 4 不同培养基条件对绿脓假单胞菌产色素的影响不同培养基条件对绿脓假单胞菌产色素的影响 2 2 4 1 温度 在最佳培养组分基础上 分别在 17 27 37 47 下培养细菌 接菌 16 小时后每隔两小时观察色素产生情况 直至颜色变淡 确定最佳培养温度 2 2 4 2pH 在最佳培养组分及最佳温度基础上 分别配制 pH5 2 6 2 7 2 8 2 9 2 的 培养基 在最佳温度下接菌 16 小时后每隔两小时观察色素产生情况 直至颜色 变淡 确定最佳 pH 条件 2 2 4 3 光照 在最佳培养组分基础上和最佳温度和 pH 下 分别在光照 紫外线 黑暗下 培养 在接菌后 首先有一试管先在紫外灯下灭菌 2 小时后在与其他一样的环境 培养 并且以后每隔两小时在紫外灯下灭菌十几分钟 一直延续到结束 接菌 16 小时后每隔两小时观察色素产生情况 直至颜色变淡 从而确定最佳培养条件 3 结果 3 1 细菌的复苏和纯化培养结果 铜绿假单胞菌接种到普通固体培养基上 在普通细菌培养条件下培养 18 后 每隔两小时观察一次 直至色素比较明显 结果见图 1 10 图1 铜绿假单胞菌的培养 生长情况和形态特征 由图1可知 铜绿假单菌在普通固体培养基上的菌落形态为光滑 微隆起 边缘整齐 波状的中等大小菌落 由于产生水溶性绿脓素和荧光素 故能渗入培 养基内 使培养基为黄绿色 3 2 细菌在不同培养组分与条件下培养产生色素的结果 通过铜绿假单胞菌在不同条件下产色素的颜色变化过程 每两个小时观察一 次色素的情况 可以发现色素的一些变化过程 在一些明显的变化时间段作了详 细的记录 具体情况如下 3 2 1 不同培养基组分对绿脓假单胞菌产色素的影响不同培养基组分对绿脓假单胞菌产色素的影响 3 2 1 1 不同碳源对铜绿假单胞菌产色素的影响 在不同碳源的液体培养基下分别接种铜绿假单胞菌 16h 后 每两小时观察 色素产生变化 并对明显色素变化做详细记录 结果见图 2 图 3 图 4 图 5 图 6 图 7 图 8 图 9 图 10 图 11 图 2 16h 时铜绿假单胞菌产色素请情况 图3 24h时铜绿假单胞菌产色素情况 11 图 4 1d15h 铜绿假单胞菌产色素情况 图5 2d15h铜绿假单胞菌产色素情况 图 6 3d15h 铜绿假单胞菌产色素情况图 7 6d15h 铜绿假单胞菌产色素情况 12 图 8 6d21h 铜绿假单胞菌产色素情况图 9 7d 铜绿假单胞菌产色素情况 图 10 7d15h 铜绿假单胞菌产色素情况图 11 21 8d 铜绿假单胞菌产色素情况 由图2可知 16h时可以观察到牛肉膏为浅黄绿偏黄 葡萄糖 乳糖 蔗糖均 为浅蓝绿色其中乳糖颜色相对更深 由图3可知 24h时可以观察到牛肉膏为浅黄 绿偏绿颜色最深 乳糖颜色稍浅仍为浅蓝绿色 葡萄糖 蔗糖为浅蓝绿色且颜色 最浅 整体颜色均有加深 由图4可知 1d15h时可以观察到整体颜色进一步加深 葡萄糖 乳糖 蔗糖均为蓝绿色 牛肉膏黄绿色偏绿 但是乳糖颜色最深 牛肉 膏颜色稍浅 由图5可知 2d15h时可以观察到牛肉膏黄绿色 葡萄糖 乳糖 蔗 糖均为明亮蓝绿色 乳糖颜色最深 由图6可知 3d15h时可以观察到牛肉膏为黄 13 绿色 乳糖亮蓝绿色 葡萄糖颜色稍浅也为亮蓝绿色 蔗糖为灰蓝绿色且蓝绿色 明显 以后两天的颜色都无明显变化 由图7可知 6d15h时可以观察到牛肉膏为 黄褐色 乳糖蓝绿色且颜色最深 葡萄糖稍浅蓝绿色 蔗糖灰绿色偏灰色 由图 8可知 6d21h时可以观察到牛肉膏黄褐色 乳糖蓝绿色颜色最深但相比较3小时 前已变浅 葡萄糖颜色比乳糖浅很多为灰蓝绿色且偏灰 蔗糖为灰褐色 由图9 可知 7天时可以观察到牛肉膏黄褐色 乳糖蓝绿色颜色最深 葡萄糖浅蓝绿色 蔗糖深灰绿色只有稍绿 由图10可知 7d15h 牛肉膏黄褐色 乳糖蓝绿色颜色 最深 葡萄糖浅蓝绿色 蔗糖深灰绿褐色 由图11可知 最终8d时 可以观察到 牛肉膏黄褐色 乳糖深蓝绿色 葡萄糖浅蓝绿 蔗糖深灰褐色 所以选择的最佳 碳源成分是乳糖 3 2 1 2 不同氮源对铜绿假单胞菌产色素的影响 在不同氮源的液体培养基下分别接种铜绿假单胞菌 16h 后 每两小时观察 色素产生变化 并对明显色素变化做详细记录 结果见图 12 图 13 图 14 图 15 图 16 图12 16h铜绿假单胞菌产色素情况图13 24h铜绿假单胞菌产色素情况 14 图14 2d15h铜绿假单胞菌产色素情况 图15 5d15h铜绿假单胞菌产色素情况 图16 6d15h铜绿假单胞菌产色素情况 由图12可知 16h时可以观察到含蛋白胨 胰蛋白 NH4 2SO4成分的为浅黄 绿色偏黄 酵母膏红褐色不易观察颜色变化以后忽略 由图13可知 24h时可以 观察到蛋白胨与胰蛋白均为黄绿色偏黄 且蛋白胨颜色较深 NH4 2SO4为浅黄 绿色偏黄 由图14可知 1d15h时可以观察到颜色加深 但变化情况不变 2d15h 时可以观察到蛋白胨深黄绿色 胰蛋白稍浅 NH4 2SO4为黄绿偏黄色 以后两天 15 变化不大 由图15可知 5d15h可以观察到蛋白胨为灰绿色较深 胰蛋白灰绿色 稍浅 NH4 2SO4为黄色 蛋白胨颜色最深 由图16可知 最终6d15h可以观察到 蛋白胨深黄褐色偏黄 胰蛋白深灰褐色 NH4 2SO4为黄褐色 所以选择的最佳 氮源成分是蛋白胨 3 2 1 3 不同无机盐对铜绿假单胞菌产色素的影响 在不同无机盐的液体培养基下分别接种铜绿假单胞菌 16h 后 每两小时观 察色素产生变化 并对明显色素变化做详细记录 结果见图 17 图 18 图 19 图 120 图 21 图 22 图 23 图 24 图 25 图 26 图17 16h时铜绿假单胞菌产色素情况图18 24h铜绿假单胞菌产色素情况 16 图19 48h铜绿假单胞菌产色素情况图20 2d15h铜绿假单胞菌产色素情况 图21 3d15h铜绿假单胞菌产色素情况图22 4d15h铜绿假单胞菌产色素情况 图23 5d15h铜绿假单胞菌产色素情况图24 6d15h铜绿假单胞菌产色素情况 17 图25 6d21h铜绿假单胞菌产色素情况图26 7d3h铜绿假单胞菌产色素情况 由图17可知 在16h 可以观察到MgSO4呈浅黄绿色且偏黄 NaCl KCl K2HPO4均呈浅黄绿但偏绿 且K2HPO4颜色较深 由图18可知 24h 时可以观察到MgSO4颜色为黄绿色偏黄 但是颜色最深 K2HPO4颜色稍浅 为黄 绿色偏绿 NaCl KCl 黄绿色偏绿 颜色均较浅 由图19可知 48h 2d 时可 以观察到颜色较24h变化不大 但是颜色整体更深 由图20可知 2d15h时可以观 察到 颜色整体更深 K2HPO4和MgSO4颜色最深 但是K2HPO4为蓝绿色 MgSO4为灰黄色 NaCl KCl为明显黄绿色但偏黄 由图21可知 3d15h时可以观 察到 K2HPO4和MgSO4颜色最深 但是K2HPO4为深灰绿色绿色较深 MgSO4为 灰黄色 NaCl KCl为明显黄绿色但偏黄 由图22可知 4d15h时可以观察到 K2HPO4和MgSO4颜色变化不明显 NaCl KCl为明显黄绿色但偏绿 且NaCl比较 KCl颜色明显更深 由图23可知 5d15h时可以观察到 K2HPO4和MgSO4颜色最 深 但是MgSO4为灰褐色 K2HPO4仍为灰绿色偏绿 NaCl KCl为黄绿色偏绿 由图24可知 6d15h时可以观察到MgSO4为灰褐色 K2HPO4为灰绿色偏绿 二者 颜色最深 NaCl为浅灰绿色 KCl黄绿色 由图25可知 6d21h时可以观察到 K2HPO4为深灰绿色MgSO4为深黄褐色 NaCl KCl为灰褐色稍偏绿 由图26可知 最终在7d3h时可以观察到 K2HPO4颜色为深灰绿褐色 MgSO4为深黄褐色 KCl 为稍浅黄褐色 NaCl为灰黄褐色 所以选择的最佳无机盐成分为K2HPO4 18 3 2 2 不同培养基条件对绿脓假单胞菌产色素的影响不同培养基条件对绿脓假单胞菌产色素的影响 3 2 2 1 不同温度对铜绿假单胞菌产色素的影响 在最佳培养组分下液体培养基下分别接种铜绿假单胞菌 在不同温度下培养 16h 后 每两小时观察色素产生变化 并对明显色素变化做详细记录 结果见图 27 图 28 图 29 图 30 图 31 图 32 图 33 图 27 16h 时铜绿假单胞菌产色素情况图 28 2d15h 铜绿假单胞菌产色素情况 图 29 1d15h 铜绿假单胞菌产色素图 30 3d15h 铜绿假单胞菌产色素情况 19 图 31 5d15h 铜绿假单胞菌产色素情况图32 6d15h铜绿假单胞菌产色素情况 图 33 6d21h 铜绿假单胞菌产色素情况 由图27可知 16h时可以观察到 27 37 为浅黄绿色 无明显差异 17 47 没有颜色变化 由图28可知 24h时可以观察到27 37 为黄绿色 偏绿 37 颜色更深 17 有少量菌为很浅黄绿色 47 没有颜色变化 由图29 可知 1d15h可以观察到 整体颜色均有加深 17 为浅黄绿色 27 为黄绿色 偏黄 37 为黄绿色偏绿 47 没有颜色变化 后来一天变化不明显 由图30可 知 3d15h到4d15h时可以观察到 17 27 为黄绿色 17 相对浅 37 灰蓝 20 绿便蓝绿色 47 没有颜色变化 由图31可知 5d15h可以观察到17 为浅灰绿色 27 为灰黄色 37 为深灰绿色但是偏绿色 47 没有颜色变化 由图32可知 6d15h可以观察到17 为浅灰绿色但是已经偏黄色 27 为灰黄色 37 为深灰绿 色且颜色最深 47 没有颜色变化 由图33可知 最终6d21h时可以观察到17 为 浅灰黄色 27 为灰黄褐色 37 仍为深灰绿色47 没有颜色变化 所以选择的 最佳环境温度是37 3 2 2 2 不同 pH 对铜绿假单胞菌产色素的影响 在最适温度 最佳培养组分但是不同 pH 下液体培养基中分别接种铜绿假单 胞菌 培养 16h 后 每两小时观察色素产生变化 并对明显色素变化做详细记录 结果见图 34 图 35 图 36 图 37 图 38 图 39 图 40 图 41 图34 16h铜绿假单胞菌产色素情况 图35 24h铜绿假单胞菌产色素情况 21 图36 2d15h铜绿假单胞菌产色素情况图37 3d15h铜绿假单胞菌产色素情况 图 38 4d15h 铜绿假单胞菌产色素情况图39 6d15h铜绿假单胞菌产色素情况 22 图40 7d铜绿假单胞菌产色素情况图41 7d21h铜绿假单胞菌产色素情况 由图34可知 16h时可以观察到pH5 2 pH6 2 pH7 2 pH8 2 pH9 2均为黄 绿色 pH9 2颜色偏黄 其他颜色差别不明显 由图35可知 24h时可以观察到 PH5 2 pH6 2为浅蓝绿色 pH7 2 pH8 2 pH9 2均为黄绿色 颜色加深且PH9 2 黄色深 由图36可知 2d15h可以观察到 pH5 2深蓝绿色 pH9 2黄绿色偏黄二 者颜色最深 pH6 2稍浅蓝绿色 pH7 2 pH8 2黄绿色 由图37可知 3d15h可以 观察到pH5 2 pH6 2深蓝绿色 pH9 2黄绿色偏黄 三者颜色比昨天深 pH7 2 pH8 2黄绿色 由图38可知 4d15h可以观察到 pH5 2颜色开始偏黄 pH6 2深蓝绿色 pH9 2深黄绿色黄色明显 pH7 2 pH8 2黄绿色偏黄 由图39可 知 6d15h可以观察到pH5 2 pH7 2 pH8 2 灰褐色稍偏绿 pH6 2深灰绿色 pH9 2黄褐色 由图40可知 7d可以观察到pH9 2黄褐色且颜色最深 pH6 2深灰绿 色 颜色深的和pH9 2差不多 pH5 2灰褐色稍偏黄 pH7 2 pH8 2浅黄褐色 由 图41可知 7d21h可以观察到pH9 2深黄褐色 pH5 2 pH7 2 pH8 2黄褐色 pH6 2灰绿褐色 绿色已变淡 所以最佳pH6 2最好 3 2 2 3 不同光照对铜绿假单胞菌产色素的影响 在最适温度及 pH 最佳培养组分下的液体培养基中分别接种铜绿假单胞菌 在不同的光照条件下培养 16h 后 每两小时观察色素产生变化 并对明显色素变 化做详细记录 结果见图 42 图 43 图 44 图 45 图 46 图 47 23 图42 16h铜绿假单胞菌产色素情况图 43 24h 铜绿假单胞菌产色素情况 图 44 铜绿假单胞菌产色素情况图 45 6d15h 铜绿假单胞菌产色素情况 24 图46 7d15h铜绿假单胞菌产色素情况图47 8d15h铜绿假单胞菌产色素情况 在紫外灯下 光照及黑暗条件下 色素的变化经历了有黄绿偏黄 到深黄绿 以及最终的灰褐色 但是每一阶段黑暗光照条件下颜色变化差别不明显 紫外线 颜色一样只是相对一直