环境管理_富营养化水体中藻毒素的危害及检测方法

富营养化水体中藻毒素的危害及检测方法 1 1水体富营养化1 2藻毒素简介1 3藻毒素的分类及危害1 4藻毒素的含量标准1 5藻毒素的检测方法1 6藻毒素的去除1 7研究展望 目录 水体出现富营养化现象时 浮游藻类大量繁殖 形成水华 淡水水体中藻类大量繁殖的一种自然生态现象 因占优势的浮游藻类的颜色不同 水面往往呈现蓝色 红色 棕色 乳白色等 这种现象在海洋中则叫做赤潮或红潮 是指在人类活动的影响下 生物所需的氮 磷等营养物质大量进入湖泊 河口 海湾等缓流水体 引起藻类及其他浮游生物迅速繁殖 水体溶解氧量下降 水质恶化 鱼类及其他生物大量死亡的现象 1 1水体富营养化 eutrophication 太湖 昆明滇池 苏州环城河 武汉中山公园 长江武汉段 水体富营养化化使得藻类疯长 其中有毒藻类产生大量 种类繁多的藻毒素 1 2藻毒素简介 藻毒素的分子量在1000左右 易溶于水 在水中是中性和带负电荷的分子团 在常规条件下几乎不与酸碱反应 在水中藻毒素的自然降解过程十分缓慢 同时它也有很高的耐热性 一般水处理工艺的混凝 沉淀 煮沸不能破坏它的毒性 1 3藻毒素的分类及危害 藻毒素 肝毒素 神经毒性藻毒素 细胞毒性藻毒素 皮肤毒性藻毒素 刺激毒性藻毒素 毒性作用 1 3 1 1 1 3 1 2 1 3 1按毒性作用分类 1 3 1 1肝毒性藻毒素以单环七肽微囊藻毒素 microcystin MC 和五肽节球藻毒素 nodularin 为代表 MC是毒性最大 分布最广 研究最多的藻毒素 一般记为环 D 丙氨酸1 L X2 赤 B 甲基 D 异天冬氨酸 MeAsp 3 L Z4 Adda5 D 异谷氨酸6 N 甲基脱氢丙氨酸 Mdha 7 MC产生并存在于蓝藻活细胞内 当蓝藻细胞衰老 死亡或溶解后MC从中大量释放到水体中 1 3 1 2神经毒性藻毒素主要有类毒素 anotoxin a 类毒素 s saxitoxin s 和麻痹贝类毒素 paralyticshellfishtoxins PSTs 3类 它们均为生物碱类物质 作用迅速 可影响乙酰胆碱的正常释放 导致神经肌肉过度兴奋而痉挛 最后致使动物呼吸受限窒息死亡 神经毒素不稳定 半衰期短 自然条件下即可迅速降解为无毒 藻毒素 富营养化形成形式 赤潮藻毒素 1 3 2 1 水华藻毒素 1 3 2按富营养化形成形式分类 1 3 2 2 1 3 2 2赤潮藻毒素海洋中大约有300种能够形成赤潮 而其中有毒的有70种左右 常见的赤潮藻毒素有 麻痹性贝毒 plalalyticshellfishpoison PSP 短裸甲藻毒素 blevitoxin BTX 溶血性毒素 hemolytictoxin 氨等 麻痹性贝毒 palalyticshellfishpoison PSP 是到目前为止分布最广 危害最大的一类 PSP主要有亚历山大藻 裸甲藻和膝沟藻等产生 PSP的毒素作用机制与河豚毒素相似 都是通过选择性阻断电压门控Na 通道 是神经及肌肉细胞Na 内流导致动作电位无法形成 海洋生物中 由于贝类对麻痹性贝毒具有极强的抵抗性 因此这种毒性就在贝类体内储存累计 人类或动物食用这些有毒贝类会产生一系列神经麻痹症状 严重的可能致命 短裸甲藻毒素 blevitoxin BTX 是一种混合的醚环类化合物 主要由短裸甲藻分泌而来 短裸甲藻主要危害神经系统 故而称之为神经性贝毒 NSP 它也是主要通过贝类积累毒素 人们食用染毒的贝类后中毒 溶血性毒素 hemolytictoxin 被认为是类似于Digitonin 洋地黄皂甙 的物质 使动物红血球细胞溶解破裂引起动物死亡 典型藻类 小定鞭藻 氨主要由夜光藻代谢产生 夜光藻是浮游生物 是甲藻中较为特殊的1个种类 具异养特性 其危害的对象主要为鱼类 具有鱼毒素的性质 对水生生物有剧毒 它可麻痹和严重损伤鳃组织的呼吸上皮 对皮膜组织产生刺激和炎症 是病源微生物易于侵入 氨在碱性条件下 能形成毒性较强的非离子氨 NH3 因此在偏碱性的环境中 氨对有鳃的水生动物的危害更大 1 3 2 2水华藻毒素淡水水体中的藻毒素种类很多 尤其是蓝藻毒素 主要包括 肝毒素 hepatotoxins 作用于肝脏 神经毒素 neurotoxins 作用于神经系统 脂多糖 polysacchrides 内毒素 位于细胞壁外层 其他毒素 肝毒素包括 微囊藻毒素 microcystinMC 节球藻毒素 nodularin 其中微囊藻毒素是最重要的肝毒素 它是一种环状七肽 一般结构为 D Ala X D MeAsp D Asp Y Adda D Glu Mdha Dha 相对分子质量约为1000 MeAsp为D 赤 甲基天冬氨酸 Adda为 2s 3s 8s 9s 3氨基 9甲氧基 2 6 8 三甲基 10 苯基 4 6 二烯酸 Mdha为N 甲基脱氢丙氨酸 Dha为脱氢丙氨酸 X Y的不同以及Asp和Dha的甲基化和去甲基化 可以形成多种微囊藻毒素 毒性较大的是LR RR 和YR 其中L R Y分别代表Leu Arg和Tyr 而Adda和Glu对微囊藻毒素的毒性是必需的 微囊藻毒素主要存在于微囊藻 鱼腥藻 颤藻和念珠藻中 微囊藻毒素 微囊藻毒素的中毒症状大致可分为急性和慢性两类 此种肝毒素具有极高的细胞选择性和专一生物活性 其对生物体的主要作用靶器官是肝脏 其在生物机体内所引发的许多细胞学变化仅发生于肝脏 微囊藻毒素中毒也可表现为致突变或慢性致癌作用 它可以影响癌基因和抑癌基因的表达 节球藻毒素 节球藻毒素是1组环状五肽 一般结构为环 D MeAsp D Asp L Arg Adda D Clu Mdhb 其中Mdhb为N 甲基脱氢 氨基丁酸 相对分子质量为824 主要存在于泡沫节球藻中 节球藻毒素的致毒机理与微囊藻毒素类似 神经毒素 化学成分为生物碱 所以作用时间非常快 鱼腥藻 微囊藻 束丝藻 颤藻和束毛藻等能产生此类毒素 已知的神经毒素包括以下几种 鱼腥藻毒素 anatoxin 和其同系物 homoanatoxin 鱼腥藻毒素 s anatoxin s 石房蛤毒素 saxitoxin 新石房蛤毒素 neosaxitoxin 鱼腥藻毒素 anatoxin 和其同系物 homoanatoxin 鱼腥藻毒素 是1种低分子质量的生物碱 相对分子质量为165 主要由鱼腥藻产生 目前还发现颤藻 束丝藻 柱孢藻和微囊藻可以产生此种毒素 鱼腥藻毒素 是神经递质乙酰胆碱的类似物 它可与乙酰胆碱受体结合 但乙酰胆碱酯酶或真核生物中的任何酶均不能降解它 它与乙酰胆碱受体结合后可使肌肉因过度兴奋而痉挛 如果动物的呼吸系统受到影响 动物会因窒息而死亡 同系物 homoanatoxin 用丙酰基替代了鱼腥藻毒素 中C 2上的乙酰基 在颤藻 Oscillatoriaformosa 和 O rubscens 中都曾分离得到这种毒素 此毒素也为烈性的后突触神经肌肉阻断因子类毒素 毒性比鱼腥藻毒素 稍低 鱼腥藻毒素 s 鱼腥藻毒素 s 是N 羟基鸟嘌呤的单磷酸酯 到目前为止仅从北美洲发现 由水华鱼腥藻 Aph flosaquae 和 A Lemmermannii 产生 鱼腥藻毒素 s 是一种乙酰胆碱酶的烈性抑制剂 可以阻止乙酰胆碱酯酶对乙酰胆碱的降解 致使肌肉因过度兴奋而痉挛 其化学结构与鱼腥藻毒素 完全不同 但二者中毒症状很相似 鱼腥藻毒素 s 比鱼腥藻毒素 的致死作用强约10倍 石房蛤毒素和 新石房蛤毒素属麻痹性贝毒 石房蛤毒素和新石房蛤毒素属麻痹性贝毒 麻痹性贝毒的化学结构和毒性在赤潮藻类毒素中已述 在淡水中PSP主要存在于水华束丝藻 Aphanizomenonflosaquae 卷曲鱼腥藻 Anabaenacircinalis 鞘丝藻 Lyngbyawollei 等中 它们可以作用于细胞膜上的钠通道使之关闭 抑制动作电位的产生 使乙酰胆碱不能释放 从而导致神经麻痹 脂多糖内毒素 是蓝藻细胞的组成部分 由脂A 核心寡糖和O特异多糖组成 蓝藻脂多糖内毒素的脂A与格兰氏阴性细菌的脂多糖不完全相同 种类更多 而且往往含有少量的磷酸 内毒素可激活单核 巨噬细胞 肝Kupffer细胞 血管内皮细胞等 并诱生一些炎性细胞因子及氧自由基等化学介质的释放 诱发全身炎症反应综合症 包括感染性休克 和肝脏等组织器官的严重损伤 目前已从裂须藻 颤藻 鱼腥藻和微囊藻中分离到 1 4藻毒素的含量标准 目前 各国一般还没有制定强制性的饮用水中藻毒素含量标准 已有的标准一般也只针对微囊藻毒素 LR含量 世界卫生组织 WHO 建议饮用水中藻毒素标准为1 0 g L 加拿大健康组织认为饮用水中可接受的藻毒素标准为0 5 g L 我国尚未制定饮用水中微囊藻毒素总含量标准 在2001年6月卫生部颁布的 生活饮用水卫生规范 中已将微囊藻毒素 LR的标准值列入 为0 001mg L 国家环境保护总局颁布的 中华人民共和国国家标准 GB3838 2002 中也在集中式生活饮用水地表水源地特定项目标准限值列出微囊藻毒素 LR的标准值 同样为0 001mg L 藻毒素的检测 通常为小鼠腹腔注射或口腔灌饲 根据其急性毒性筛选 粗略判断藻毒素含量 并结合毒素作用特点区分神经毒性或肝毒性 该法操作简单 但专一性和灵敏性相对较差 样品需要量大 无法精确定量和坚定藻毒素结构 PPIA法方便快捷 需要样品少 具有较好的重复性 可靠性 检测限极低 便于进行大批量样品检测 但只能用于藻毒素总量测定 无法鉴定毒素成分和区分毒素同系物 小鼠测试法 蛋白磷酸酶抑制试验法 PPIA MC对蛋白磷酸酶PP1和PP2A具有强烈的活性抑制作用 强度与毒素计量有关 呈典型的S型曲线 采用同位素标记PP A法和微量比色PP A法检测样品存在时PP的相对活力 可计算其中毒素的含量 无需任何前处理和浓缩处理 检测限即可分别达到0 25和0 1mg L 1 蛋白磷酸酶竞争性结合试验法 PPCBA PCR法 藻毒素对PP1和PP2A上Ser和Thr具有高亲和力 采用125 标记MC YR 将之与未标记的被测毒素一起与PP2A反应 竞争性结合PP2A达平衡后通过凝胶过滤分离PP2A结合相毒素和未结合相毒素 检测MC YR与PP2A结合体的放射性 依据标准曲线获得被测毒素含量 本法干扰因素少 检测限低至2 5pg 但也只能检测毒素总量 采用MC毒素合成酶基因 Mcy基因 进行产藻毒素藻株和非产毒株的鉴定 筛选 凡有产毒能力的藻细胞均可被检出 该法检测下限低 灵敏度高 方便快捷 可检测干藻粉 实验室培养物 无前处理的自然水样等 但不能定量和无法检测溶解的MC 本法可从神经毒性较强的含藻毒素目标物中检出微量MC的存在 但试验工作量较大 组织培养细胞毒性分析法 在肝细胞悬浮培养液中加入MC 据其导致细胞凋亡的程度区分产毒株 检测MC含量 评价MC毒性 通过把握凋亡中肝细胞裂解程度可进一步提高试验灵敏度 化学法可实现生物法通常无法实现的对藻毒素的精确定量和构型分析以及同分异构体鉴别 是最简单的定性测定方法之一 一般用Kieselgel60F254 0 2mm 薄层板 展开容积系列有CHCL3 MeOH H2O 26 15 3或者13 7 2 Rf值为0 33 EtOAC 2PrOH H2O 8 4 3或4 3 7 利用正相或反相硅胶制作的薄层板可提高分离效果 薄层色谱 TLC 高效液相色谱 HPLC 是最常用的的检测方法 通常先以反向或正向色谱柱分离纯化藻毒素 再采用238mm紫外光或荧光检测 以标准毒素为基准 既可以精确定量检测藻毒素 也可用于藻毒素异构体鉴定 HPLC检测灵敏度高 重现性好 但需要标准毒素 试验 HPLC检测灵敏度高 重现性好 但需要标准毒素 实验成本高 实验时间长 且对检测仪器精密度依赖程度高 质谱分析 MS 实验成本较高 但灵敏度高 液 质联用 LC MS 快速而精确 即使没有标准毒素 在已知毒素相对分子质量情况下也可定性和定量检测 微孔反相液质联用法检测毒素达到pg级 可用于分析有机大分子结构及其相对分子质量 原子轰击质谱分析法 FABMS 和液相次级离子质谱 LSIMS 可快速有效地确定毒素相对分子质量 毛细管电泳法 CE 利用其柱上富集功能 所需样品量少 采用激光诱导的荧光检测器提高检测灵敏度可避免放射性物质 灵敏度高 无需添加剂来提高分辨率 分析自动化 速度快 可快速达到分离和检测目的 免疫分析法 免疫分析法的原理 基于抗体与毒素之间的特异性反应 利用放射免疫法检测MCYST 线性范围为20 500ng ml 最低检测限为1 2ng 用MCYST毒素或藻类提取物直接包被在酶标板上 用酶标羊抗兔来检测免疫反应后结合在板上的MCYSH抗体 将抗体包被在板孔上 毒素和酶标毒素混合与抗体发生竞争免疫反应 检测MCYST线性范围0 5 10ng ml 最低检出限为0 2ng ml 需从不同的小鼠中 pAb2 m pAb3 r 制备抗体 检测MCYST LR时 RR YR等的交叉反应浓度在0 19 2 06ng ml之间 常用于检测大分子化合物 检测MCYSTs时 浓度线性范围为2 100pg ml 方法灵敏 特异 但是由于放射性危害 只能在实验室使用而不适合现场检测 需要样品少 前处理简单 专一性强 灵敏度高 可直接用于天然水体等现场分析 大批量样品的处理和筛检以及各种不同藻毒素同系物的检测 但其对多种同系物的识别需要广谱抗体 1 6藻毒素的去除 1 6 1以物理方法为主的降解途径1 6 1 1过滤和沉淀1 6 1 2活性炭吸附1 6 1 3膜滤1 6 2以化学方法为主的降解途径1 6 2 1氯化1 6 2 2臭氧消化1 6 2 3光催化1 6 2 4化学试剂氧化1 6 3以生物方法为主的降解途径1 6 3 1生物降解1 6 3 2人工湿地 1 6 1 1过滤和沉淀 常规水处理工艺中的滤料对溶解的藻毒素去除效果不佳 但对包容于藻细胞中还未释放的毒素则有一定去除效果 MorrisRJ等使用表面有细小纹理的高粘度的黏土矿石如高岭石和蒙脱石等来过滤藻毒素 粒径 2 m的矿石去除率能超过81 而粒径 0 1 m的矿石去除率只有27 左右使用表面较为粗糙的粉末状物质做滤料应该对藻毒素的去除都有一定的效果 同时去除率也与滤料的粒径大小有关 1 6 1 2活性炭吸附 水处理工艺中最常用的活性炭滤料为颗粒状活性炭 Granularactivatedcarbon GAC 和粉末状活性炭 Powderedactivatedcarbon PAC 活性炭和传统水处理工艺结合使用对藻毒素的去除率超过80 但藻毒素含量到0 1 0 5 g L时 活性炭很难继续去除 而且大量活性炭的使用会造成水处理成本的提高 将用过的GAC高温高压灭菌 处理效果将有降低 原因可能是破坏了其中有生物活性的膜 1 6 1 3膜滤 对藻毒素处理有良好效果的是超滤 反渗透和钠滤 超滤对藻毒素的去除效果可达98 反渗透能达到99 6 钠滤膜可完全截留水中的藻毒素 但技术的成本将非常高 所以目前只有少数发达国家进行小范围的应用 1 6 2 1氯化 一般认为属于传统水处理工艺的氯化对藻毒素的去除基本没有作用 但Nicholson等发现在pH 8的水样中通氯30min 残余氯浓度不小0 5mg L时 藻毒素浓度有明显降低 足够量的次氯酸钠在酸性及中性条件下也有明显的降解作用 而使用氯胺类化合物则没有这种效果加拿大某水处理厂的实验也表明对微囊藻毒素 LR进行氯化作用 能达到82 的处理效果 1 6 2 2臭氧消化 臭氧氧化技术被认为是21世纪最有前途的水处理技术之一 由于臭氧具有强氧化性 目前已被广泛应用在氧化助凝 除嗅 去除微量有机污染物 藻毒素等方面 并取得了较好的效果 朱光灿和何吕锡武等研究了紫外 微臭氧工艺降解微囊藻毒素 MCs 的动力学过程与特性 结果表明 MC RR MC YR和MC LR三种MC在紫外 微臭氧反应器中的降解过程为一级动力学反应 半降解时间分别为74 5 32 2和24 2min RositanoJ等在一定的溶解有机碳 dissolvedorganiccarbon DOC NOM pH下 对微囊藻毒素 LR浓度为20 g L 1的水样通臭氧5min 发现保持残余臭氧浓度在0 06mg L 1以上就检测不到剩余藻毒素的存在 但臭氧氧化过程也有一定的缺陷 主要表现在有机物矿化度较低 生成的小分子有机物可同化有机碳类成为醛类物质 在溴离子存在时 臭氧可氧化Br 为溴化有机副产物 其中的溴酸盐是基因毒性致癌诱变物 1 6 2 3光催化 MartinWelker等发现在腐殖质存在的条件下 经过8h自然光照射 微囊藻毒素 RR YR和LR分别减少到原有含量的44 5 53 3 和55 4 本方法的优越性在于腐殖质存在于绝大多数自然环境中 成本极低 目前最普遍的研究是用TiO2或TiO2 H2O2作为催化剂 在TiO2作催化剂的条件下藻毒素能达到良好的去除效果 而一定量H2O2的存在可以显著加强催化作用 BenjaminJP等经实验认为H2O2的最佳用量在0 005 0 1 间 同时降解副产物经盐水虾 Artemiasalina 生物测试无明显毒 ShephardS等已研制出实验室阶段的TiO2固定光催化反应器 含藻毒素的水样垂直流过可得满意效果 H2O2本身也能降解藻毒素 但单独使用降解率不高 1 6 2 4化学试剂氧化 普通氧化剂对藻毒素的处理效果不佳 但XingH等发现高铁酸盐能有效去除微囊藻毒素 LR 且氧化产物Fe OH 3能同时絮凝有机物达到减少TOC的目的 在此处理过程后加上光催化氧化的步骤则去除效果更佳 CornishBJ等利用Fenton试剂 5mM的H2O2和0 5mM的Fe2 共同作用 降解微囊藻毒素 LR 结果显示在30min后就检测不到藻毒素的存在 他们认为此方法的效果至少与TiO2催化光降解等同 若用等浓度的Fe3 代替Fe2 亦有降解效果 只是速度较慢 1 6 3 1生物降解 藻毒素会被自然水体中的微生物降解 但过程比较缓慢 CousinsIT等从发生过水华的水体中采集水样和底泥样并混合 在好氧条件下降解10 g L的微囊藻毒素 LR 7d后在HPLC上检测不到藻毒素的存在 同时实验发现生物降解的最初作用部位在藻毒素活性表达所必须的部分 故能明显消除藻毒素的毒性 但生物作用只能达到9 的完全矿化 微囊藻毒素 LR多数转化为毒性较小的中间产物 ParkHD等从一富营养化严重的湖泊中分离出Y2细菌 Sphingomonas的一种或类似它的一未知菌 它对微囊藻毒素 RR和LR的最大降解速率分别为每天13和5 4mg L 吕锡武等采用好氧和厌氧两种微型序批式反应器进行藻毒素的降解途径的研究 经24h处理后 好氧反应器堆总藻毒素去除率分别为RR92 7 YR90 6 LR93 6 同样条件下厌氧反应器为RR5 2 YR2 4 LR14 6 而对好氧反应器的微生物镜检显示 样品中有大量草履虫吞噬蓝藻 且有共生细菌存在 1 6 3 2人工湿地 人工湿地通过人工构筑的类自然湿地系统中的基质 植物 微生物 经物理 化学 生物学过程协同作用净化污水 吴振斌等人建立上行流和下行流的