苯硫脲尝味的遗传学调查.doc

苯硫脲尝味的遗传学调查苯硫脲尝味的遗传学调查14级生物技术基地 摘要：本次实验通过苯硫脲基因分析、苯硫脲多态性分析、以及群体遗传分析三个实验，测定人群中PTC尝味基因的表现型和基因型，理解孟德尔遗传基因型与表现型的对应关系。了解酶切扩增多态序列技术的原理，学会用酶切扩增多态序列技术检测单核苷酸多态性。在分子水平上测定PTC尝味的基因型。计算群体中PTC尝味的基因频率，判断群体是否达到哈代温伯格平衡。Abstract: This experiment using phenyl thiourea genetic analysis, phenyl thiourea polymorphism analysis, and genetic analysis of three experimental groups, determination a group of people PTC taste gene phenotype and genotype, understand Mendel corresponding relationship between genotype and phenotype. To understand the principle of cleaved amplified polymorphic sequence technology, learn to cleaved amplified polymorphic sequence technical detection of single nucleotide polymorphisms. At the molecular level to determine the genotype PTC taste. Computing group in PTC taste gene frequency, to determine whether a group hardy - weinberg equilibrium.关键词：基因频率 ，尝味能力，PTC基因1.引言1.1基因频率与基因型频率基因频率：一个二倍体某特定基因座上某一等位基因占该座位上等位基因总数的比率。基因型频率：群体中某特定基因型个体的数目占群体个体总数目的比率。1.2 Hardy-Weinberg遗传平衡定律：哈代一温伯格定律也称遗传平衡定律，是由英国数学家哈代和德国医生温伯格分别于1908年和1909年各自提出的。两个等位基因的哈迪一温伯格定律的公式为：(p+q)2=p2+2pq+q2=1。其中p代表一个等位基因（如A）的频率，q代表另一个等位基因（如a）的频率, p2代表一个等位基因纯合子（如AA）的频率，q2代表另一个等位基因纯合子（如aa）的频率，2pq代表杂合子（如Aa）的频率。Hardy-Weinberg遗传平衡定律基本要点：a. 等位基因的频率世代相传不会改变；b. 子一代基因型频率也不改变，达到（p2，2pq，q2）平衡；c. 只需一个世代随机交配就能达到基因型频率的平衡。影响Hardy-Weinberg遗传平衡的因素：a. 基因突变；b. 自然选择；c. 群体大小；d. 迁移；e. 随机的遗传漂变;2.实验原理2.1苯硫脲尝味的遗传形式苯硫脲（phenylthiocarbamide，PTC）是硫脲的苯基衍生物，为白色结晶粉末，因含有硫代酰胺基（N-C=S）官能团而有苦涩味。能尝出1/750,000-1/50,000 PTC浓度溶液味道的人（苦涩味，少数人感到甜味）称为苯硫脲“尝味者”, 只能尝出PTC 浓度大于1/24,000 溶液的味道的人称为苯硫脲“味盲者（nontaster）”。图1.苯硫脲结构图PTC 尝味能力是受单基因控制的孟德尔遗传性状，是由位于7 号染色体上的一种苦味味觉感受器基因 TAS2R38 决定的，属于常染色体不完全显性遗传。尝味者中显性基因T的纯合子(TT)能尝出1750,000-16,000,000 的PTC 溶液的苦味，杂合子(Tt) 只能尝出1 480,000-l380,000 的PTC溶液的苦味。TT：1/750,0001/6,000,000 11-14号Tt：1/480,000l/380,000 7-10号tt：1/24,000-尝不出苦味 1-6号2.2 人类苯硫脲尝味的基因人类的PTC尝味基因Homo sapiens taste receptor, type 2, member 38(TAS2R38)(NM_176817)，又名 PTC、T2R38 或 T2R61。绝大多数尝味者与味盲者的区别在于三处单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNPs)：一处是145 位，味盲者为 G145（编码丙氨酸ala），尝味者为C145（编码脯氨酸pro）；第二处是785 位，味盲者为T785（编码缬氨酸val），尝味者为C785（编码丙氨酸ala）；第三处在886 位，味盲者为A886（编码异亮氨酸ile），尝味者为G886（编码缬氨酸val）因此味盲者PTC 多肽中三处对应的氨基酸分别是ala49、val262 和ile262，被称为AVI等位基因，而尝味者的三处是pro49、 ala262和val262，被称为PAV等位基因。如表1所示。SNP1SNP2SNP3等位基因味盲者 GCACTGTTGCATCCTG145 (ala49)T785 (val262)A886 (ile296)AVI尝味者C145 (pro)C785 (ala)G886 (val)PAVCCACTGCTGCGTCCT表1 Fnu4HI识别位点（识别序列5-GCNGC-3）味盲者的PTC编码区有五个限制性内切酶Fnu4H1的识别位点（识别序列5-GCNGC-3），如果是尝味者，则其第785位SNP恰好形成了一个额外的Fnu4H1识别位点（GCTGC）。因此可以利用这个SNP造成的限制性位点多态性，设计引物扩增包含785位SNP位点的PTC基因编码区的一部分，然后用Fnu4H1切割扩增产物，根据是否能把扩增产物切开而判定是某个人的单倍型（haplotype）。3.PTC尝味能力的测定检测 PTC 味盲有纸片法(filter paper method)、结晶法(crystal method)、阈值法(threshold method)等几种不同的方法。近年来国际上研究者采用 1949 年 Harris 和 Kalmus 改进的阈值法。3.1实验材料3.1.1 主要仪器设备高压蒸气灭菌锅、磁力搅拌器、电子天平、超净工作台、恒温水浴锅、冰箱。洁净、经121高压灭菌20min的容量瓶、量筒、烧杯、螺口试剂瓶，一次性医用无菌PE手套、乳胶手套、滴管，一次性纸杯，记号笔。3.1.2试剂和材料（1）材料：受试者为全体修读遗传学大实验的学生。（2）试剂：苯硫脲（PTC）结晶，娃哈哈纯净水。3.1.3 溶液配制（1）原液（1号液）：称取PTC结晶0.65 g，加娃哈哈纯净水500 ml，在室温(20左右)下溶解12d（经常摇晃）（或60水浴中1 h充分溶解），PTC浓度约为1750，过滤灭菌。（2）稀释液：用娃哈哈纯净水逐级稀释原液214倍，编为2-14号（表2）。将配好的14种浓度的PTC溶液，过滤灭菌，分别置于灭菌过的100 ml螺口试剂瓶中。另取娃哈哈纯净水作为第15号液。编号123456789101112131415浓度（1/X）75015003000600012000240004800096000192000384000768000153600030720006144000蒸馏水表2 PTC溶液梯度的配制 3.2实验方法（1）让受试者正坐，仰头张嘴伸舌，用滴管滴23滴 15号液于受试者舌根部，让受试者慢慢咽下反复咂嘴品味液体尝味，然后用纯净水做同样的试验，交替给受试者尝味，避免受试者的臆意猜测而影响结果的准确。（2）询问受试者能否鉴别此两种溶液的味道。（3）若不能鉴别或鉴别不准，则依次用 141号溶液重复试验，直到能明确鉴别出PTC的苦味为止。（4）复尝味3次，3次结果相同时，才是可靠。（5）记录所品出苦味的液体的编号和稀释浓度。受试者民族生源地PTC尝味能力123456789101112131415张三李四表3.2 PTC尝味表型调查表注：统计民族、生源地是想调查PTC味盲分布与民族和地理位置是否有相关性。（因此生源地统计的不是受试者户籍所在地，而是其家族或家庭成员长期生活的地方，如张三家庭成员多代居住在安徽省，3年前搬迁至河北省，现户籍河北省，那么记录安徽省）4实验材料与方法4.1 人口腔上皮细胞总DNA的提取4.1.1 主要仪器设备高速离心机、微量移液器、电磁炉、冰箱。牙签、1.5 mL灭菌微量离心管、微量移液器吸头（枪头）、离心管架，一次性医用无菌PE手套、记号笔。4.1.2 试剂和材料（1）材料：受试者，用灭菌牙签刮取口腔上皮细胞。（2）试剂：ddH2O4.1.3 实验方法（1）在1.5 ml灭菌微量离心管中加入100 L ddH2O。（2）用无菌牙签轻刮口腔腮内侧几次，刮下来的细胞在ddH2O中漂洗。（3）将上述样品煮沸3 min，直接插入冰中冷却3 min，再次煮沸3 min。使细胞破碎（4）离心机3000rpm离心20 s。（5）上清液可直接作为PCR模板。4.2 PCR扩增PTC基因片段4.2.1 主要仪器设备高压蒸气灭菌锅、小型瞬时离心机、PCR仪、制冰机、超净工作台、微量移液器、洁净、经121高压灭菌20min的1.5 mL灭菌微量离心管、PCR管、微量移液器吸头（枪头），离心管架， PCR管架，一次性医用无菌PE手套，记号笔。4.2.2 试剂和材料（1）材料：每实验小组受试者口腔上皮细胞基因组DNA（2）试剂：Taq DNA聚合酶，dNTPs，Tris碱，模板DNA 、P1 、P2 、rTaq Mix 、ddH2O PCR预期扩增产物303 bp。上游引物：hPTC Forward 5-aactggcagaataaagatctcaatttat-3下游引物：hPTC Reverse 5-aacacaaaccatcacccctatttt-34.2.3 配制PCR体系（TAKARA）50ul体系模板DNA 3ulP1 1ulP2 1ulrTaq Mix 25ulddH2O 20ul4.2.4 实验方法（1）依照PCR体系配制液体。（2）盖好盖后用手指轻弹管壁，混匀液体，13200rpm离心10 s（将液体甩到离心管底部）。（3）在管上做好标记后放入PCR仪中（等待其它学生一起运行）。（4）按下述程序设定运行PCR仪：94C94C55C72C72C4C预变性5 min变性30s退火 30 s延伸30s延伸10 min无限40 个循环（5）PCR产物4C保存备用4.3 PTC基因PCR扩增产物的电泳检测4.3.1 主要仪器设备电泳仪、水平电泳槽、电子天平、微波炉、凝胶成像仪、超净工作台、微量移液器、洁净、经121高压灭菌20min的、微量移液器吸头（枪头），离心管架， PCR管架，三角瓶，一次性医用无菌PE手套，记号笔，保鲜袋，微波炉用手套，4.3.2试剂和材料（1）材料：受试者PTC基因PCR产物（2）试剂：琼脂糖，100bp DNA ladder Marker、50TAE电泳缓冲液、loading buffer4.3.3 溶液配制1TAE电泳缓冲液（工作液）：取50TAE电泳缓冲液，去离子水稀释50倍。4.3.4 实验方法（1）配制1%琼脂糖凝胶：称取0.2g琼脂糖粉，放入三角瓶，加入20ml 1TAE电泳缓冲液，放入微波炉中加热，并不断取出混匀，注意观察烧瓶中的琼脂糖粉末，直至完全熔解（烫，戴手套）。20ml 正好倒一块胶（切不可让胶溶液溢出到微波炉中！）。（2）将胶液置桌面上室温冷却致热但不烫手，后加2ml核酸染料（约50-60。C）。（3）把梳子插到凝胶灌制模具的正确位置后缓缓倒入胶溶液。胶溶液倒至与模具的矮边缘相平即可。在桌面上静置10-20分钟待胶完全凝固。（剩下的胶溶液封口后留待以后再熔化使用），小心拔出梳子，凝胶没入电泳槽电泳液中，凝胶上有样品孔的一侧要朝向电泳槽的负极。（4）在凝胶上选择相邻的加样孔。用10ml的吸液头分别依次加入5mL 100bp DNA ladder Marker对照，加10mL PCR产物电泳样品。（5）（注意正负电极的位置连接正确）设置电泳仪参数U=120V、I=200mA、P=50W、T=00:30，PCR产物（1%）电泳15-25min。放入凝胶成像系统中拍照。4.4 PTC基因PCR产物酶切4.4.1 主要仪器设备小型瞬时离心机、恒温水浴锅、制冰机、微量移液器、洁净、经121高压灭菌20min的1.5 mL灭菌微量离心管、微量移液器吸头（枪头）、离心管架、一次性医用无菌PE手套、记号笔。4.4.2 试剂和材料（1）材料：受试者PTC基因DNA（2）试剂：限制性内切酶Fnu4H14.4.3实验方法（1）从制冰机中盛取碎冰（4C ），从冰箱中取出所需试剂，在碎冰中解冻。（2）配制酶切体系（50 ul）PCR产物 20ulddH2O 24ul10酶切缓冲液 5ulFnu4H1 1ul瞬时离心， 37C 水浴15-30min。4.5 PTC基因酶切产物的电泳检测4.5.1 主要仪器设备电泳仪、水平电泳槽、电子天平、微波炉、凝胶成像仪、制冰机、超净工作台、微量移液器、洁净、经121高压灭菌20min的微量移液器吸头（枪头），离心管架， 三角瓶，一次性医用无菌PE手套，记号笔，保鲜袋，微波炉用手套 4.5.2试剂和材料（1）材料：受试者PTC基因酶切产物（2）试剂：琼脂糖，100bp DNA ladder Marker、loading buffer4.5.3实验方法（1）配制2%琼脂糖凝胶：称取0.4g琼脂糖粉，放入三角瓶，加入20ml 1TAE电泳缓冲液，放入微波炉中加热熔解，制胶。稍加冷却后加2ml 核酸染料。（2）把梳子插到凝胶灌制模具的正确位置后缓缓倒入胶溶液。胶溶液倒至与模具的矮边缘相平即可。在桌面上静置10-20分钟待胶完全凝固。（剩下的胶溶液封口后留待以后再熔化使用），小心拔出梳子，凝胶没入电泳槽电泳液中，凝胶上有样品孔的一侧要朝向电泳槽的负极。（3）在凝胶上选择相邻的加样孔。用10ml的吸液头分别依次加入5mL 100bp DNA ladder Marker对照，加20mL PCR产物电泳样品（2mL样品，18mL loading buffer）。（4）（注意正负电极的位置连接正确）设置电泳仪参数U=60V、I=200mA、P=50W 、T=01:10，酶切产物（2%）大约电泳1小时10分钟。放入凝胶成像系统中拍照。5.实验结果与分析5.1小组成员尝味能力测试结果如下：受试者民族生源地PTC尝味能力123456789101112131415蒙古族内蒙古汉族内蒙古汉族山西经过对所有受试者统计得知：基因型人数TT25Tt96tt45总计166民族基因型人数总计蒙古族TT232Tt19tt11回族TT02Tt0tt2汉族TT22132Tt79tt31 图2.不同基因型PCR产物电泳结果 图3.PCR产物酶切电泳结果（注：图2 中从右向左依次为DNA ladder Marker，王芳，李纳以及本人的PCR电泳结果，图3中从右向左依次为DNA ladder Marker，王芳，李纳以及本人（4,5两个）的PCR产物酶切电泳结果。）从图2中我们可以看到，对比DNA ladder Marker,在300bp处有明亮的带。从图3 中，可以看到味盲者（2）只有一条明亮的带，303bp；说明受试者是tt纯合体。而尝味者（3,4,5）在238bp处有一条明亮的带，在303bp处有一条很暗的条带。理论上PCR产物预期只有一条约300 bp的带。酶切产物中如果只有一条与PCR产物同样位置的带，说明是tt纯合体（303 bp）；如果只有两条带，一条暗淡，在前方较远处（64 bp），另一条明亮比PCR产物带稍靠前（238 bp），说明是TT纯合体；如果有三条带，一条明亮、与PCR产物位置相同，另一条比PCR产物带稍靠前，还有一条暗淡、在前方较远处，则说明是Tt杂合体。（如图4）图4. PTC基因片段的CAPS分析结果示意图5.2总体实验数据处理：对所测的数据依据哈代温伯格定律：T基因频率：p=f(T)=f(TT)+f(Tt)=（225+96）/（1662）=0.440t基因频率：q=f(t)= f(tt)+f(Tt)=（245+96）/（1662）=0.560平衡群体基因型频率的计算：依据哈代温伯格公式可得：(p+q)2=p2+2pq+q2=1TT基因型频率: p2=0.4400.440=0.194Tt基因型频率: 2pq=20.4400.560=0.493Tt基因型频率: q2=0.5600.560=0.314(以上为理论值)实际基因型频率：TT基因型频率：25/166=0.151Tt基因型频率：96/166=0.578tt基因型频率：45/166=0.271卡方检验：假设我们所在班级的群体是一个遗传平衡群体，检测个基因型理论值之间的吻合程度进行验证，可以用卡方检验，如下：理论数=理论频率总数TTTttt合计实验观察数（O）259645166理论数（C）328252166偏差（OC）-714-7（OC）2C1.532.390.944.86通过查表，比较，发现当自由度= 2 时，卡方= 4.86，适合度大于0.05，差异不显著，所以整体是一个平衡体系。5.3蒙古族实验数据处理：对所测的数据依据哈代温伯格定律：T基因频率：p=f(T)=f(TT)+f(Tt)=（22+19）/（322）=0.359t基因频率：q=f(t)= f(tt)+f(Tt)=（211+19）/（322）=0.641平衡群体基因型频率的计算：依据哈代温伯格公式可得：(p+q)2=p2+2pq+q2=1TT基因型频率: p2=0.3590.359=0.129Tt基因型频率: 2pq=20.3590.641=0.460Tt基因型频率: q2=0.6410.641=0.411(以上为理论值)实际基因型频率：TT基因型频率：2/32=0.062Tt基因型频率：19/32=0.594tt基因型频率：11/32=0.344卡方检验：假设我们所在班级的群体是一个遗传平衡群体，检测个基因型理论值之间的吻合程度进行验证，可以用卡方检验，如下：理论数=理论频率总数TTTttt合计实验观察数（O）2191132理论数（C）4151332偏差（OC）-24-2（OC）2C11.070.3082.378通过查表，比较，发现当自由度= 2时，卡方= 2.378，适合度大于0.05，差异不显著，所以整体是一个平衡体系。5.4回族数据处理：由于回族人数太少，只有2人，误差太大，所以实验数据未进行分析。5.5汉族实验数据处理：对所测的数据依据哈代温伯格定律：T基因频率：p=f(T)=f(TT)+f(Tt)=（222+79）/（1322）=0.466t基因频率：q=f(t)= f(tt)+f(Tt)=（231+79）/（1322）=0.534平衡群体基因型频率的计算：依据哈代温伯格公式可得：(p+q)2=p2+2pq+q2=1TT基因型频率: p2=0.4660.466=0.217Tt基因型频率: 2pq=20.4660.534=0.498Tt基因型频率: q2=0.5340.534=0.285(以上为理论值)实际基因型频率：TT基因型频率：22/132=0.167Tt基因型频率：79/132=0.598tt基因型频率：31/132=0.235卡方检验：假设我们所在班级的群体是一个遗传平衡群体，检测个基因型理论值之间的吻合程度进行验证，可以用卡方检验，如下：理论数=理论频率总数TTTttt合计实验观察数（O）227931132理论数（C）296638132偏差（OC）-713-7（OC）2C1.692.561.295.54通过查表，比较，发现当自由度= 2 时，卡方= 5.54 ，适合度大于0.05，差异不显著，所以整体是一个平衡体系。6.注意事项:实验前应做好试剂的配制、用品灭菌等准备工作。配制各种试剂，必须要使用重蒸水。使用后的器皿必须认真清洗干净，洗完后还要用重蒸水冲洗三次。凡是可以进行灭菌的试剂与用具都必须经过高压蒸汽灭菌后进行使用，防止其他杂质或酶对DNA、RNA或蛋白质的降解。凡是基因工程操作所用的一切塑料器具（Eppendorf管、吸头等），在使用前都应装入盒子和瓶子中灭菌，且装盒或装瓶过程中都应采用镊子，或戴上一次性手套进行操作，不可以徒手去取，严防手上杂酶污染。限制性内切酶等工具酶保存于50%的甘油中，-20可以长期保存。应自始至终将酶保持在0以下，取酶时不能用手指接触储存酶的部分。在需要加酶的时候将酶从冰箱中取出，放在冰盒里，用完后立即放回冰箱，尽量缩短酶离开冰箱的时间。对于Eppendorf管、吸头（tip）与非玻璃离心管等只能湿热灭菌，然后放置在50温箱中烘干后使用。每次吸头用毕应更换，不要互相污染试剂。实验中加入任何试剂后应注意样品的混匀，保温等反应后的样品也应离心摔一下(短促离心10s)后再进行下步的实验。实验过程中应