临床分子生物学检验绪论ppt课件.ppt

临床分子生物学检验 1 Contents 临床分子生物学定义及其发展 临床分子生物学检验内容及其应用 存在的问题以及标准化 1 2 3 临床分子生物学发展方向 4 2 1 临床分子生物学定义及其发展 临床医学的主要任务是什么 研究疾病的病因 诊断 治疗和预后 提高临床治疗水平 促进人体健康 临床检验的主要任务 3 1 临床分子生物学定义及其发展 临床检验 临床微生物检验 临床免疫检验 临床生化检验 临床分子生物学检验 临床血液学检验 4 1 临床分子生物学定义及其发展 望问闻切 5 1 临床分子生物学定义及其发展 公元前300年 希波克拉底提倡尿液检查诊断疾病 1500年 内科医生开始使用尿液颜色比对图进行直观尿液分析 1590年 hasjanssen发明了复式显微镜 1592年 伽利略发明了温度计 1684年 安东 范 列文虎克出版了第一本细菌绘图 6 临床分子生物学定义及其发展 临床分子生物学检验的定义 临床分子生物学检验 clinicalmolecularbiology 是利用分子生物学理论与技术从基因组 转录组 蛋白质组 代谢组等水平研究疾病的发生发展机制 疾病的预测与风险评价 疾病的临床诊断与治疗 以及疾病的预防与控制 7 1 临床分子生物学定义及其发展 第一代检验诊断早期细胞形态雪检验 第二代检验诊断20世纪50年代生化检验 第三代检验诊断20世界60年代免疫学检验 第四代检验诊断基因 分子生物学 检验诊断 以疾病表型改变为依据非特异滞后难以早期诊断 以疾病基因为探测对象特异性强 敏感可以早期诊断 临床检验的发展 8 第四代检验诊断 第三代检验诊断 1 临床分子生物学定义及其发展 9 1 临床分子生物学定义及其发展 1953年 Watson和Crick提出DNA双螺旋模型 现代分子生物学开始兴起 为分子检验奠定了基础 JamesWatson和FrancisCrick 10 1 临床分子生物学定义及其发展 1976年 美籍华裔科学家简悦威 YuetWaiKan 首次利用液相DNA分子杂交技术 进行了 地中海贫血的产前诊断 简悦威 汉族 医学家 美国国籍 国际医学界知名的遗传学和 脱氧核糖核酸 DNA 专家 第一阶段核心技术 分子杂交技术以基因突变位点 导致单基因疾病 为靶标 11 1 临床分子生物学定义及其发展 1985年 聚合酶链式反应 PCR 技术的创建 使大量获得靶DNA片段成为可能 大大提高检测的特异性和灵敏性 穆利斯 K B Mullis PCR技术的发明者 12 1 临床分子生物学定义及其发展 PCR仪 琼脂糖凝胶电泳仪 13 1 临床分子生物学定义及其发展 荧光PCR仪 凝胶成像系统 14 以PCR技术为基础 产生的衍生技术 PCR 限制性酶切片段长度多态性 PCR RFLP 等位基因特异性PCRPCR 单链构象多态性技术 PCR SSCP 实时定量荧光PCR QuantitativeReal timePCR 第二阶段核心技术 聚合酶链式反应 PCR 技术以基因组特异性序列 DNA RNA 为靶标为获得性 病原微生物 基因疾病 DNA RNA 的诊断提供了有效的方法 1 临床分子生物学定义及其发展 15 1 临床分子生物学定义及其发展 PCR电泳结果 Q PCR结果 16 1 临床分子生物学定义及其发展 最早的微阵列图片 生物芯片 一般指高密度固定在互相支持介质上的生物信息分子 如基因片段 DNA片段或多肽 蛋白质 糖分子 组织等 的微阵列杂交型芯片 17 1 临床分子生物学定义及其发展 18 1 临床分子生物学定义及其发展 基因芯片 基因芯片热图 第三阶段核心技术 生物芯片 biochip 高通量技术以基因组特异性核酸序列 DNA RNA 蛋白质分子为靶标为复杂性 多因素 多基因 疾病提供了有效的分子生物学检验方法 19 1 临床分子生物学定义及其发展 测序峰图 sanger 20 第四阶段核心技术 DNA测序技术 蛋白质质谱技术 以基因组特异性核酸序列 蛋白质分子 代谢物为靶标特点 高灵敏度 高特异性 高通量 高自动化 1 临床分子生物学定义及其发展 核酸测序技术为临床疾病扥分子诊断提供最精确的判定依据 是分子生物学检验的金标准测序方法 第一代 双脱氧末端终止法第二代 焦磷酸测序法第三代 单分子实时测序 大大降低成本 有望实现1000USD对人类基因组进行测序 21 1 临床分子生物学定义及其发展 蛋白芯片技术 22 1 临床分子生物学定义及其发展 检测到阳性胃癌蛋白指纹 23 2 临床分子生物学检验内容及其应用 狭义的讲 目前分子生物学检验的靶标主要以核酸为主广义上讲 临床分子检验的生物标志物包含基因组DNA 各种RNA 蛋白质以及代谢物 24 2 临床分子生物学检验内容及其应用 镰刀状红细胞贫血症的检测 一种常染色体退化遗传病引起原因 珠蛋白的 基因发生了一个点突变 基因的第6位密码子为GAG 编码谷氨酸 突变后为GTG 编码缬氨酸 检测方法 该突变导致该基因丢失了一个可被MstII切开的限制性内切酶位点 25 2 临床分子生物学检验内容及其应用 脆性X染色体综合征 脆性X染色体综合征导致患者智障 Martin Bell综合征 脆性X综合症是由于在人体内X染色体的形成过程中的突变所导致 已发现了致病基因FMR 1 它含有 CGG n三核甘酸重复序列 后者在正常人约为30拷贝 而在正常男性传递者和女性携带者增多到150 500bp 称为小插入 相邻的Cpg岛未被甲基化 这种前突变 premutation 无或只有轻微症状 现已可用RFLP连锁分析 DNA杂交分析 PCR扩增等方法检测 26 成年型多囊肾病 2 临床分子生物学检验内容及其应用 成年型多囊肾病是一种常染色体显性遗传病 发病率高 约1000人中有1名致病基因的携带者 起病较晚 多在30岁以后 主要为肾和肝中出现多发性囊肿 由于通过家系分析 已证实APKD的致病基因与 珠蛋白基因3 端附近的一段小卫星DNA序列即3 HVR 3 hypervariableregion 紧密连锁 而后者在人群中具有高度多态性 因此可以通过RFLP连锁分析进行诊断 27 2 临床分子生物学检验内容及其应用 乙型肝炎病毒的分子生物学检验 乙型肝炎病毒核酸的检验HBVDNA是病毒复制和传染性的直接标志 定量检测HBVDNA对于判断病毒复制程度 传染性大小 抗病毒药物疗效等有重要意义 PCR引物常根据其S C P和X基因中的高度保守序列来设计 荧光定量PCR技术能准确地反映HBVDNA的复制水平 病程变化和治疗恢复情况等 特异性高 支链DNA技术 核酸杂交技术等 28 丙型肝炎病毒的分子生物学检验 2 临床分子生物学检验内容及其应用 丙型肝炎病毒的核酸检测肝组织内HCVRNA检测可应用斑点核酸杂交技术 血清中HCVRNA检测多采用PCR 核酸杂交 bDNA 基因芯片 转录介导的扩增系统等技术 5 UTR区的序列最保守 种系变化程度及进化率很低 可用于区分主要基因型 29 2 临床分子生物学检验内容及其应用 埃博拉病毒的分子生物学检测 2014年埃博拉病毒感染在西非引起高致死性出血热疫情流行 目前对该病毒缺乏特异性的疫苗和治疗方案 早期快速诊断能明显降低感染死亡率 EBOV引物设计必须兼顾各亚型的敏感性 避免其他类似出血热病毒干扰 目前一般选择EBOV高度保守的GP或NP作为扩增的靶标设计引物和探针 利用逆转录PCR和实时定量荧光PCR相结合的方法来进行检测 30 结核分枝杆菌的分子生物学检验 2 临床分子生物学检验内容及其应用 结核分枝杆菌可通过呼吸道 消化道或皮肤损伤侵入易感机体 引起多种组织器官的结核病 其中以通过呼吸道引起肺结核为最多 PCR扩增所选靶序列主要有65kD抗原基因 MPB蛋白基因 rRNA基因 TBIS6110插入序列 染色体DNA的重复序列等 PCR RFLP real timePCR 等技术均可 2 临床分子生物学检验内容及其应用 31 2 临床分子生物学检验内容及其应用 禽流感的亚型目的基因错重PCR扩增 32 2 临床分子生物学检验内容及其应用 高血压的分子生物学诊断 目前关于原发高血压相关的易感基因的研究现状 1号染色体位于1p36 1的ECE1基因以及1q42 q43的AGT基因是人类血压调节的候选基因 2号染色体2p25 p24是原发高血压的易感位点 3号染色体位于3q21 q25的AGTR1A基因以及3p14 1 q12 3是与原发高血压相关 4号染色体位于4p16 3的ADD1基因与盐敏感性原发性高血压相关 7号染色体位于7q22 1的CYP3A5基因与盐敏感性原发性高血压相关 位于7q36的NOS3基因与妊娠高血压相关 11号染色体研究提示位于11q的数量性状遗传位点与血压的调节相等 33 2 临床分子生物学检验内容及其应用 肿瘤的基因诊断 肿瘤基因诊断的常用方法 PCR RT PCR Southernblot杂交技术 Northernblot杂交技术 基因芯片 基因测序等 胃癌 膀胱癌 乳腺癌 前列腺癌 结肠癌 胰腺癌 肺癌等 在p53 ERras等基因上会有点突变 结肠癌 肾癌 乳腺癌 脑瘤等CD44 muc 1 VLA 4等基因的拼接会产生改变 34 组织特异性基因标志物 2 临床分子生物学检验内容及其应用 存在于肿瘤及其起源的正常细胞中 不存在于其他细胞 如CEAmRNA AFPmRNA PSAmRNA等 血管生成因子 如血管内皮细胞生长因子 VEGF 等 肿瘤基因诊断的常用方法 PCR RT PCRSouthernblot杂交技术 Northernblot杂交技术基因芯片基因测序 35 2 临床分子生物学检验内容及其应用 结核分枝杆菌的耐药性检测 耐利福平分子机制 是由于其作用靶标 结核杆菌DNA依赖RNA聚合酶 亚单位的编码基因 rpoB 突变所致 当rpoB中507 533位密码子的核心区域 耐利福平决定区 RRDR 发生突变时 结合分歧杆菌表现为耐药 耐异烟肼分子机制 结核杆菌耐异烟肼与过氧化氢酶 过氧化物酶编码基因 katG 烯酰基还原酶编码基因 inhA 烷基过氧化氢酶还原酶编码基因 ahpC 2S酮酰基酰基运载蛋白合成酶编码基因 kasA 有关 主要是katG基因的点突变 缺失 插入 耐氨基糖苷类药物 rpsL基因发生突变耐吡嗪酰胺 pncA基因突变 36 2 临床分子生物学检验内容及其应用 16SrDNA是细菌分型最常用的目标基因 细菌中包括有三种核糖体RNA 分别为5SrRNA 16SrRNA 23SrRNA 5SrRNA虽易分析 但核苷酸太少 没有足够的遗传信息用于分类研究 23SrRNA含有的核苷酸数几乎是16SrRNA的两倍 分析较困难 而16SrRNA相对分子量适中 又具有保守性和存在的普遍性等特点 序列变化与进化距离相适应 序列分析的重现性极高 37 3 临床分子生物学的问题以及标准化 临床实验室分子诊断现已成为临床检验各学科分支中最具发展潜力的领域 其涉及病原体核酸 人类基因和各种蛋白等大分子的测定 是临床疾病诊断中不可或缺的手段 但在临床应用中 目前仍存在同一实验室不同检测批次间或不同实验室对同一标本检测间结果的差异 这已成为时常困扰临床医师 患者以及实验室技术人员的普遍性问题 仪器设备 试剂生产厂家和临床实验室本身在临床实验室分子诊断标准化中起着非常关键的作用 38 3 临床分子生物学的问题以及标准化 通常临床实验室分子诊断标准化应 主要包括以下几个方面 通常临床实验室分子诊断标准化应主要包括以下几个方面 一 临床标本采集 运送和保存的标准化 对这些标本的采集 运送和保存的标准化主要是对标本采集的具体方法 所用容器 采集量 采集时所用材料和用具 运送方式和不同时间中标本保存条件等做出明确而又详尽的规定 写成标准操作程序 二 临床标本制备处理和核酸提取方法的标准化 在抗原和抗体的 免疫学测定中 临床标本中存在的干扰物质 在抗原和抗体的 免疫学测定中 临床标本中存在的干扰物质 在抗原和抗体的免疫学测定中 临床标本中存在的干扰物质 可能会造成测定结果的错误 在检测前 对标本进行适当的稀释 加热或其他适当的预处理则可去掉这种干扰作用 在核酸和基因检测中 在核酸提取前 对标本进行适当 有效的预处理 对保证后续核酸提取以及扩增检测的成功非常关键 39 3 临床分子生物学的问题以及标准化 三 检测试剂和方法的标准化 组成一个可用于临床分子诊断的试剂和方法模式 可有多种选择 如PCR因其极高的检测灵敏度 很容易因以前扩增产物或标本间交叉污染 而出现假阳性结果 此外 标本中PCR抑制物的存在 扩增仪孔间温度的差异 试剂的浓度不合适以及标本中核酸提取的失败等 则容易造成假阴性结果 因此 试剂生产厂家在研发相应的临床分子诊断试剂时 必须仔细考虑上述因素 采用最理想的检测方法 四 检测结果分析的标准化 四 检测结果分析的标准化 四 检测结果分析的标准化 理想情况下 测定数据处理报告应达到下述要求 1 通俗易懂 要让所报告的结果 即使是不熟悉该试验的人 也能理解 2 定性测定结果明确 即反应或不反应 阳性或阴性 在正常范围内或不正常等 3 定量测定须有一定的线性范围 4 处理后