pcr技术发展与展望.doc

。PCR技术的发展及展望摘要：PCR技术是遗传与分子生物学分析的根本性基石，近年来基于常规PCR技术开发出了许多新的用途。综述了PCR技术的主要扩展。关键词：PCR技术1971年Khorana等最早提出PCR理论：“DNA变性解链后与相应引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，重复该过程便可克隆tRNA基因”。因当时基因序列分析方法尚未成熟、热稳定DNA聚合酶还未发现及寡聚核苷酸引物合成仍处于手工和半自动阶段，核酸体外扩增设想似乎不切实际，且Smith等已发现了DNA限制性内切酶，使体外克隆基因成为可能，Khorana等的早期设想被忽视。1985年Mullis等用大肠杆菌DNA聚合酶工Klenow片段体外扩增哺乳动物单拷贝基因成功以及1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶(Taq酶)引入PCR，使扩增反应的特异性和效率大大提高，并简化了操作程序，最终实现了DNA扩增的自动化，迅速推动了PCR的应用和普及。 PCR(Polymerase Chain Reaction)即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下。以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点。通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。现已被广泛应用于农学、植物病理学等领域的研究。最初的PCR技术相当不成熟,但在随后的几十年里，PCR技术被不断改进。它从一种定性的分析方法发展到定量测定；从原先只能扩增几个kb的基因到目前已能扩增长达几十个kb的DNA片断1。到目前为止，PCR技术已有十几种之多。本文对其近年来的主要扩展及应用进行综述。1 .PCR技术的扩展1.1 AP-PCR技术1.1.1 AP-PCR技术的定义、来源及特点AP-PCR(Arbitrarily primed PCR)技术2，是指在对所扩增基因顺序一无所知的情况下主观上随意地设计或选择一个非特异引物进行PCR扩增，反应在不严格条件下扩增l至数轮后，再于严格条件下进行。通过比较扩增产物的指纹图,即可反映出待分析基因组的特征。AP-PCR技术由Williams等3于20世纪90年代建立它可以快速地从两个或更多的个体组织细胞中分离出差异基因或基因差异表达产物，具有简单、灵敏、有效和重复性好等特点。1.1.2 AP-PCR技术的应用AP-PCR技术是常规PCR技术在差异基因分离方面的扩展，主要应用在：(1)差异基因的分离，Liang和Pardee2应用AP-PCR技术对正常A31和肿瘤起源的BPA31细胞进行了鉴定，并分离得到了仅存在于正常细胞的N1及仅存在于肿瘤细胞的T1片段；(2)菌株鉴定，杨国玲等3采用AP-PCR技术对甲真菌病病原菌进行了快速鉴定；(3)遗传作图，Welsh等2成功地应用AP-PCR方法快速鉴定了重组鼠(C56BL/6JDBA/2J)扩增多态性在染色体图谱中位置。1.2 LP-PCR和彩色PCR1.2.1 LP-PCR和彩色PCR的定义LPPCR(Labelled primers PCR)即标记PCR，它是指利用同位素、荧光素等对PCR引物5端进行标记，通过PCR反应扩增，来检测目的基因存在与否。彩色PCR(Color Complement Assay)是指利用荧光染料标记引物的5端，不同荧光(荧光染料TAMRA呈红色荧光，JOE和FAM呈绿色荧光,COUM呈蓝色荧光)标记的引物同时参加反应,经PCR反应扩增后，根据不同荧光的色泽来判断目标基因是否存在及扩增基因的类型4。1.2.2 LP-PCR和彩色PCR的比较LP-PCR与彩色PCR由荧光PCR5那发展而来，彩色PCR是LP-PCR的一种。与常规PCR相比，LP-PCR更为直观,其省去了限制性内切酶酶解及分子杂交等繁琐步骤，并且一次可以同时分析多种基因成分，但是LP-PCR只能对产物进行定性鉴定。与LP-PCR相比，彩色PCR通常需要2种不同颜色的引物：一种作为基因检测引物；另一种作为控制条件的内对照。但是在检测多点突变时，彩色PCR需用更多的色彩4。1.2.3 LP-PCR和彩色PCR的应用LP-PCR和彩色PCR是常规PCR技术与标记技术相结合的产物，LP-PCR常被用于大量临床标本的基因诊断，同时可用于对PCR产物进行定性鉴定。彩色PCR常被用予检测基因的突变，染色体重排或转位，基因缺失及微生物的型别鉴定等，如被用于检测多突变点的遗传病4。1.3免疫PCR技术1.3.1免疫PCR技术的定义、来源及特点免疫PCR(immuno polymerase chain reaction，IM-PCR)是利用抗原抗体反应的特异性和PCR扩增反应的高灵敏性而建立的一种微量抗原检测技术，它综合了同相免疫反应和PCR的特点。免疫PCR技术是1992年Sano建立的一种检测微量抗原的高灵敏度技术6。与常规PCR及普通ELSA相比，免疫PCR优势明显，具体表现为：灵敏度增加，可以同时进行多种抗原/半抗原检测，有更宽的线性范围7。1.3.2免疫PCR技术的应用免疫PCR技术是常规PCR技术在医学免疫学领域的主要扩展。它常被用于：(1)激素和细胞因子的检测，Furuya等8运用免疫PCR技术对白介素-18进行了检测，灵敏度提高了10000倍；(2)生化酶类的检测，Chang等10通过改良的免疫PCR方法对大肠杆菌-葡萄糖苷酶进行了检测；(3)致病微生物的检测，Monteiro等10将磁珠技术和免疫PCR技术相结合，设计了一种能检测粪便中幽门螺杆菌的新方法；(4)寄生虫感染的检测，国内利用免疫PCR技术检测弓形虫C抗原，敏感性较ELISA法提高了200倍2；(5)其他毒素或蛋白的检测。宋云扬等11建立的检测金葡菌肠毒索B的双抗体夹心免疫PCR方法比ELISA灵敏度高1000倍。1.4原位PCR技术与原位反转录PCR技术1.4.1原位PCR技术与原位反转录PCR技术的定义原位PCR(in situ polymerase chain reaction)技术将PCR高效扩增与原位杂交的细胞定位相结合，在组织细胞水平。原位榆测单拷贝的特定DNA或RNA序列12。原位反转录PCR技术(in situ reverse transcription PCR，RT in situ PCR or in situ cDNA PCR)，简称原位RTPCR它是指先将细胞和组织进行处理(网定、酶消化)以获得适度的细胞通透性；再通过逆转录使mRNA转录成cDNA；然后把载玻片放人热循环机，对靶DNA等细胞内靶目标在原位进行PCR扩增(扩增反应中含有标记的单核苷酸)；最后通过检测标记产物的方法检测扩增产物13。1.4.2原位PCR技术与原位反转录PCR技术的比较原位PCR技术在进一步提高以单细胞底物进行PGD (preim plantation genetic diagnosis，PGD)的效率的前提下，由Thornhill14提出它具有细胞定位能力和高度特异敏感。原位反转录PCR技术是原位PCR技术的一种，它检测的靶序列为RNA，由Nuovo等151992年发明。具有操作简单、流程短、省时等优点；同时具有特异性差、容易出现非特异性DNA产物、造成假阳性、且扩增效率较低特别是石蜡切片16等缺点。1.4.3原位PCR技术与原位反转录PCR技术的应用原位PCR技术是常规PCR在细胞学领域的扩展，它常被用于感染性外源基因的检测、内源基因的检测与导入基因的检测等如对HIV、结核杆菌等进行的检测17。原位反转录PCR技术常被用于扩增和检测标本中罕见的mRNA，如定量细胞表达特殊mRNA的丰度、检测扩增产物的细胞起源及检测细胞群中基因表达的趋势等181.5定量PCR技术1.5.1定量PCR技术的定义及特点定量PCR(polymerase Chain Reaction)技术有广义和狭义两层含义。广义的定量PCR技术是指以外参或内参为标准，通过对PCR终产物的分析或PCR过程的监测，进行PCR起始模板量的定量。狭义的定量PCR技术又称为实时荧光定量PCR技术(real-time fluorescent quantitative PCR，FQ-PCR)它是严格意义上的定量PCR技术，指用外标法(荧光杂交探针保证特异性)通过监测PCR过程(监测扩增效率)达到精确定量起始模板数的目的同时以内对照有效排除假阴性结果(扩增效率为零)，1996年南美国Applied Biosystems公司推出与常规PCR技术相比定量PCR技术不仅实现了对DNA模板的定量同时具有灵敏度更高、特异性和可靠性更强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点19。1.5.2定量PCR技术的应用定量PCR技术实现了PCR技术从定性分析到定量测定的发展，它常被应用于临床微生物、食品微生物、临床肿瘤学的检测、肿瘤耐药基因表达的研究、细胞因子的表达分析等方面。其中，临床微生物和食品微生物是定量PCR应用中最重要的两个方面，彭年才等192010年自主研发了用于食品安全检测的实时定量PCR仪，并已投入产业化应用。1.6多重PCR技术1.6.1 多重PCR技术的定义及特点多重PCR(multiplex PCR)是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，它最明显的优点是省时、省力、能够快速检测和鉴别病原体20，另外，多重PCR还可以精确地估计一个样品中模板数量。1.6.2多重PCR技术的应用多重PCR技术将多个PCR反应放在同一个体系内，进一步提高了 PCR反应的效率，它被广泛地用于病原体鉴别、性别鉴定、连锁分析、法医研究、模板检测和基因的疾病诊断等方面。1.7反向PCR技术1.7.1反向PCR技术的定义及特点反向PCR(reverse PCR)，又称为染色体缓移(chrornosme walking)22，它是指利用在已知序列内部没有切点的限制性内切酶对此段DNA进行酶切，在DNA连接酶作用下自连形成环状DNA分子，然后利用方向合适并与已知序列两端互补的引物，以连接成环的DNA为模板，经PCR扩增得到已知序列的旁侧DNA片段。与常规PCR技术相比反向PCR优势突出，但它需要从许多酶中选择限制酶或者说必须选择一种合适的酶进行酶切另外，由于大多数有核基因组含有大量中度和高度重复序列，在YAC或Cosmid的未知功能序列中有时也会存在这些序列从而导致反向PCR得到的探针与多个基因序列杂交，影响扩增效果。1.7.2反向PCR技术的应用反向PCR技术在检测病毒、转座子等在基因组中的整合位点，建立基因组步移文库及研究基因的上游调控元件等方面较常规PCR技术优势明显22，Souer等1995年将反向PCR技术与差别筛选法相结合，从矮牵牛W138中分离得到了高效转座子标签dTphl标记的基因。1.8锚定PCR技术1.8.1锚定PcR技术的定义及特点锚定PCR(Anchored PCR)23，又称同定PCR它以基因组总DNA为模板，用一条基因特异性引物进行线性PCR扩增，产生单链扩增产物；在末端转移酶的作用下，在单链DNA分子的3末端加上多聚胞嘧啶；用巢式基因特异性引物与多聚胞嘧啶配对的锚定引物对加尾的产物进行PCR扩增PCR产物连入载体后进行测序鉴定。与常规PCR技术相比。锚定PCR技术特异性高、有较长的步行距离，一次实验可以获得15 kb左右的目的片段，同时它无需对基因组总DNA进行限制性内切酶消化段连接反应，另外其操作过程较其他方法简单，大约2-3个工作日就能完成。1.8.2锚定PCR技术的应用锚定PCR技术解决了常规PCR技术所不能完成的已知片段侧翼序列的克隆问题，是常规PCR技术的又一重大扩展。1.9兼并引物PCR技术1.9.1 兼并引物PCR技术的定义兼并引物PCR(degenerate primer PCR)是指针对由密码子的兼并性引起的。单以氨基酸顺序推测编码的DNA序列的不精确性，设计成对兼并引物。通过PCR扩增所有编码已知顺序的核酸序列。1.9.2兼并引物PCR技术的应用兼并引物PCR技术是常规PCR技术在蛋白领域的应用，具体表现在两个方面：(1)寻找新蛋白已被测定的一段氨基酸序列的相应基因；(2)寻找其有进化上保守结构域的蛋白质家族新成员的基因25.陶爱林等26采用该技术成功进行了蓰草花粉过敏原全长同源基因的克隆。1.10重组PCR技术及其应用1.10.1重组PCR技术的定义重组PCR(recombinant PCR)是通过DNA重叠序列的衔接作用。使多个DNA分子融合在一起的体外扩增技术27。它包括三个阶段：(1)制备用于重组的DNA组件；(2)组件分子作为引物互为模板延伸；(3)克隆和定向筛选重组产物28。1.10.2重组PCR技术的应用重组PCR技术的出现，使常规PCR技术得到进一步扩展，它是PCR技术在核酸与蛋白两个领域应用的结晶。重组PCR技术的应用主要表现在：(1)精确解析大分子功能和相互作用的结构基础，如标定活性位点的关键残基、确认已知蛋白中未知功能的结构域、揭示配体一受体识别过程中相互临近的区域等。(2)探索顺式作用元件的调控机理，揭示mRNA的非翻译区的功能、确定启动子和增强子成分的功能等。(3)嵌合受体在研究信号途径和胞内定位中具有独特的“钓鱼”优势，用功能已知的分子和待研究对象嵌合来研究结合TGF之后的TGFR二聚化形式和内向整流型钾通道的脂筏定位过程29,30，(4)开发新型载体，比如通过DNA重排来增强绿色荧光蛋白(GFP)的荧光稳定性；(5)升级分子标记，通过DNA改组已经获得的重组拟南芥K+转运蛋白可以使植株内的钾离子富集度提高261；(6)重组PCR在蛋白体外定向进化中的的应用最引人瞩目；(7)基于重组PCR技术的分子育种(molecular breeding)在疫苗研发中有着广阔的应用前景以HIV病毒疫苗研制为例，2002年运用DNA shufling技术突破了HIV的宿主专一性，得到了高复制率的嵌合猿-人免疫缺陷病毒(SHIV)24。2.展望PCR作为一项“革命性的技术”，不仅推动了遗传与分子生物学的发展而目在其它领域科学家的努力与创新下。其不断与该领域的核心技术相结合，极大地推动了此领域的发展。另外，PCR技术从问世便成为生物学界的一大热点，它在烟草领域的应用由来已久，它的出现对烟草领域的研究者们造成了极显著的影响同时也极大地促进了烟草领域的研究。总之随着科学技术的不断进步PCR技术必将得到新的发展，以之为基础的新技术将不断出现，它在烟草领域研究中的作用亦日渐明显。参考文献：1黄留玉PCR最新技术原理、方法及应用M北京：化学工业出版社20052孟祥文，李 璞AP-PCR技术及其应用J国外医学遗传学分册199518(3)：117-1203杨国玲,孙晓岩,李文利,等AP-PCR快速鉴定甲真菌病病原菌的研究J真菌学杂志20072(2)：89-914陈尚武不同种类的PCR技术及其应用J贵阳医学院校报199314(3)：113一l165Findlay I,Quirke PHall JF1uorescent PCR：a new technique for PGD of s ex and single gene defctsJ.J Assist Reprod Genet,199613(2)：966sano TCasandra L，Smith CI,et alImmuno PCR：Versensitive antigen detection by means of specific antibody DNA conjugate JScience1992258：120-1227黄杰免疫PCR技术及其应用研究进展J国际检验医学杂志。200627(8)：7097128 Furuya DYagihashi AYajima Tet a1An immuno-polymerase chain reaction assay for human interleukin-18J.J Immunol Methods2000，238(12)：173一1809Huang SH，Chang TCDe tection of 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