紫外可见分光光度法ppt课件.pptx

紫外可见分光光度法第一节概述比色分析 利用被测物质的分子对紫外 可见光选择性吸收的特性而建立起来的方法 1 比色分析法分为 1 目视比色法 相对误差一般为5 20 2 分光光度法 根据物质对不同波长的单色光的吸收程度不同而对物质进行定性和定量分析的方法 2 分光光度法的特点 1 灵敏度高 一般可测定浓度下限为10 5 10 6mol L 1 达 g量级 的物质 2 准确度高 相对误差一般为2 5 3 设备和操作简单 价格低廉 4 分析速度快 5 应用广泛 3 第二节基本原理一 光的基本特性光是一种电磁波 具有波动性和粒子性 光子的能量式中 E为能量 1ev 1 602 10 19J h为普朗克常数 6 626 10 34J s 为频率 c为光速 299792458m s 为波长 4 波长 用 表示 可用相邻两个波峰或波谷之间的距离来表达 单位常用nm cm 注 1m 102cm 103mm 106 m 109nm 5 摘自GB T14666 1993 6 可见光 波长范围为380 780nm紫外光 10 380nm分10 200nm远紫外也叫真空紫外200 380nm近紫外 7 单色光 是指具有同一种波长的光 复合光 是指含有多种波长的光 8 1 透射比 用符号 表示当一束平行的单色光垂直照射到含有吸光物质的均匀透明溶液时 透射光通量和入射光通量之比 二 吸收光谱曲线 9 tr 透射光通量 0 入射光通量 可以用小数表示 也可用百分数表示 的范围 0 1 的单位 无 越大 溶液对光的吸收越小 10 2 吸光度 透射比倒数的对数 用A表示 A lg 1 lg A的范围 0 A的单位 无A越大 溶液对光的吸收越大 10 A 11 3 吸收光谱曲线简称 吸收曲线 吸收光谱以波长为横坐标 吸收程度为纵坐标作图所得曲线 12 最大吸收波长 max吸收曲线表明了某种物质对不同波长光的吸收能力分布 它的最高点所对应的波长叫最大吸收波长 用 max表示 13 三 光的选择性吸收与物质颜色的关系 1 可见光的颜色 白光 分成红 橙 黄 绿 青 蓝 紫 14 2 互补色 能复合成白光的两种颜色的光叫互补色光 特殊颜色 白色 无色 灰色 15 16 四 光吸收定律1 光吸收定律又叫朗伯 比耳定律 17 光吸收定律 当一束平行单色光垂直入射通过均匀 透明的吸光物质的稀溶液时 溶液对光的吸收程度与溶液的浓度及液层厚度的乘积成正比 通式是 A kbc它是紫外 可见分光光度法进行定量分析的理论基础 定量依据 18 k叫 吸光系数 它表示待测物质在单位浓度 单位厚度时的特征吸光度 k与物质的性质 入射光的波长和溶液的温度等因素有关 19 2 光吸收定律的适用范围 1 只适用于单色性 2 只适用于稀溶液 一般要求浓度小于0 01mol L 1以下 3 适用于紫外光 可见光 红外光 20 3 吸光度的加和性原理在多组分的体系中 在某一波长下 如果各种对光有吸收的物质之间没有相互作用 则体系在该波长的总吸光度等于各组分吸光度的和 即吸光度具有加和性 称为吸光度加和性原理 1 2 吸光度的加和性对多组分同时定量测定 校正干扰等极为有用 21 3吸光系数的二种表示方法 k值的单位和大小随着b和c的单位不同而不同 22 1 质量吸光系数 厚度以cm表示 浓度以g L表示的吸光系数叫 质量吸光系数 用 表示其单位为L cm g 此时 A b 23 2 摩尔吸光系数 厚度以cm表示 浓度以mol L表示的吸光系数叫 摩尔吸光系数 用 表示其单位为L cm mol 此时 A bc摩尔吸光系数越大 在分光光度法中测定的灵敏度也越大 称方法灵敏度指标 24 第三节紫外 可见分光光度计 一 紫外 可见分光光度计基本组成部件共五个基本部件 25 一 光源 常用的光源分为 可见光源 热辐射光源 和紫外光源 气体放电光源 两类 26 热辐射光源用于可见光区 如钨丝灯和卤钨灯 钨灯和碘钨灯可使用的范围在340 2500nm 27 气体放电光源用于紫外光区 如氢灯和氘灯 氢灯和氘灯 它们可在160 375nm范围内产生连续光源 另外 光源的供电一般都要用稳压电源 即加有一个稳压器 28 二 分光系统 分光系统也叫单色器 单色器组成 入射狭缝 准光器 透镜或凹面反射镜 色散元件 聚焦元件和出射狭缝 29 单色器的核心部分是色散元件 色散元件主要是棱镜和光栅 30 棱镜有玻璃和石英两种材料 玻璃棱镜只能用于可见光域内 石英棱镜可用于紫外 可见和近红外三个光域 光栅可用于紫外 可见及红外光域 31 三 吸收池 比色皿 32 用于盛放试液的器皿就是吸收池 也叫比色皿 样品池 有玻璃和石英两种 玻璃吸收池只能用于可见光域内 石英吸收池可用于紫外 可见和近红外三个光域 33 常用的吸收池规格有 0 5cm 1 0cm 2 0cm 3 0cm 5 0cm等 34 二 吸收池使用方法拿 只能捏两侧的毛玻璃面 不可接触光学面 洗 依次用自来水 溶剂 待装液各润洗3次 装 吸收池高度的2 3 3 4 35 擦 先用滤纸吸干外壁 然后用擦镜纸或丝绸擦干 查 内部溶液无气泡 光学面外壁无垃圾 放 光学面对光路 垂直放入吸收池架 用吸收池夹固定 36 根据JJG178 2007规定石英吸收池在220nm处装蒸馏水 玻璃吸收池在440nm处装蒸馏水 以一个吸收池为参比 调节 为100 测定其它各池的透射比 透射比的偏差不大于0 5 的吸收池可配成一套 37 四 光检测系统 也叫检测器 光电器件作用 利用光电效应将光强度信号转换成电信号 常用的光检测系统主要有光电池 光电管和光电倍增管 38 1 光电池 用半导体材料制成的光电转换器 用得最多的是硒光电池 39 硒光电池 硒光电池的结构和作用原理 40 光电管 是在抽成真空或充有惰性气体的玻璃或石英泡内装上2个电极构成 红敏管625 1000nm蓝敏管200 625nm 41 光电管结构如图 1是光电管的阳极 镍环或镍片组成2是光电管的阴极 由金属片上涂一层光敏物质 如氧化铯 构成3为电池 4为放大器 42 光电倍增管 它是一个非常灵敏的光电器件 可以把微弱的光转换成电流 其灵敏度比前2种都要高得多 它是利用二次电子发射以放大光电流 放大倍数可达到108倍 43 1个光电子可产生106 107个电子 44 五 信号指示系统它的作用是放大信号并以适当方式指示或记录下来 常用的信号指示装置有直读检流计 数字显示或微处理机等 45 二 认识紫外 可见分光光度计的类别 一 单光束分光光度计 46 这类分光光度计的特点是 结构简单 价格便宜 不足之处是测定结果受光源强度波动的影响较大 因而给定量分析结果带来较大误差 47 二单波长双光束分光光度计 如普析TU 1901 48 双光束分光光度计 杂散光 电子学噪声 光源波动均可以抵消一部分 能进行波长扫描 暗电流 49 准双光束紫外可见分光光度计 部分抵消光源波动误差 电子学噪声 但因为只有一个吸收池 故杂散光不能抵消 50 三双波长双光束分光光度计 如瑞利UV 2200 51 1 2 52 优点 1 不用参比溶液 只用一个待测溶液 因此可以消除皿差和制备空白溶液产生的误差 2 测量的吸光度实质上是两个波长的吸光度差值 因此可以背景 杂质吸收干扰3 调节二波长差1 2nm 使二波长同时扫描可以记录一阶导数光谱其不足之处是价格昂贵 53 第四节紫外可见分光光度法条件选择一 显色条件的选择 一 显色反应在光度分析中将试样中的待测组分转变成有色化合物的反应叫显色反应 54 显色反应常用的有两大类 一类是配位反应 Fe3 3SCN Fe SCN 3 另一类是氧化还原反应 Mn2 S2O82 MnO4 SO42 在这两类反应中 用得较多的是配位反应 此外还有 吸附显色反应 多元配合物显色体系 55 二 显色剂 与待测组分生成有色化合物的试剂叫显色剂 分为两种无机显色剂和有机显色剂 56 1 无机显色剂 57 2 有机显色剂 58 优点 生成的一般为螯合物 稳定性很好 一般离解常数都很小 CaY2 配合物的立体结构 59 具有鲜明的颜色 都很大 一般可达到104以上 所以测定的灵敏度很高 选择性好有些有色配合物易溶于有机溶剂 可进行萃取光度分析 提高了测定的灵敏度和选择性 60 3 常见的有机显色剂 磺基水杨酸 其结构式如下 可用于测定三价铁离子 61 邻二氮菲 邻菲罗啉 1 10 二氮菲 结构式为 在PH 3 9时与Fe2 生成红色螯合物 用于铁的测定 62 双硫腙 也叫二苯 硫腙 结构式为 测定很多重金属离子 如 铅 锌 铜 银 汞 镉等 63 偶氮胂 铀试剂 其结构式为 可用于测定铀 钍 锆等 64 三 显色条件的选择 显色条件主要包括显色剂用量 显色反应的酸度 显色温度和显色时间等 1显色剂用量 显色反应就是将待测组分转变成有色化合物的反应 其反应一般可用下式代表 65 1显色剂用量 显色反应一般可用下式代表 M R MR加R过量有利于反应向右进行 但不能太多 否则产生副反应 例如 SCN 测定Fe3 在实际选用时 一般是通过实验来确定的 66 实验的方法为 控制变量法吸光度 显色剂用量的曲线 其结果分为三种情况 67 a 在a b间选择显色剂用量 b 在a b 间严格控制用量 C 必须十分严格控制用量或者另换合适的显色剂 68 溶液酸度 1 酸度对金属离子存在形式的影响 很多高价金属离子都要水解 酸度较低时 不利于显色反应的进行 Fe2 3OH Fe OH 2 69 2 酸度对显色剂浓度的影响 很多显色剂都是有机弱酸 HR H R 而显色反应为M R MR所以酸度太高对反应不利 70 3 酸度对显色剂颜色的影响 酸度不同时 它们的颜色不同 需要控制酸度 避免颜色干扰 比如 二甲酚橙显色剂与金属离子形成的配合物为红色 它本身在PH 6 3时为柠檬黄色 而在PH 6 3时为红紫色 所以在PH 6 3时 就无法进行测定 71 4 酸度对配合物组成的影响 有些显色反应当酸度不同时 要生成配位比不同的配合物 其颜色也有所不同 如 Fe3 与水杨酸的配合物 PH 4Fe C7H4O3 紫色4 PH 9Fe C7H4O3 2 红色PH 9Fe C7H4O3 33 黄色 72 适宜的酸度要由实验来确定 3显色时间 显色反应的速度有快有慢 而且有些有色化合物放置过久也会褪色 适宜的显色时间要由实验来确定 73 4显色温度 一般显色反应在室温下进行 但是也有一些反应要加热到一定温度下才能进行 对不同的反应 应通过实验找出各自适宜的显色温度范围 74 二 测量条件的选择测量条件有 测定波长 参比溶液 吸光度测量范围 75 一 波长选择的方法选择原则是 吸收最大 干扰最小 1 一般选择 max作为测定波长 76 2 若 max附近若有干扰存在 如共存离子或所用试剂有吸收 则在保证有一定灵敏度情况下 可以其它波长进行测定 应选曲线较平坦处对应的波长 77 二 选择参比溶液参比溶液的作用 调节透射比100 A 0 以消除溶液中其他成分以及吸收池和溶剂对光的吸收和反射造成的误差实际上测定试液的吸光度是以通过参比溶液的光作为入射光 应根据待测组分的性质 选择合适的参比溶液 78 1溶剂参比 仅有显色剂与被测组分反应的产物有吸收时使用 2试剂参比 试剂有吸收或者会生成吸光产物时使用 79 此时 最好用溶剂参比 然后扣除试剂空白溶液的吸光度A空白校 A A空白A空白校 扣除试剂空白溶液后的吸光度A 以溶剂参比测得的溶液吸光度A空白 以溶剂参比测得的试剂空白溶液的吸光度 80 3试样参比 试样基体有吸收时采用其他参比如果试剂及试样基体都有吸收 此时有两种参比溶液 81 1 褪色参比 配制方法 用合适的掩蔽剂将被测组分掩蔽后再加显色剂和其他试剂 2 平行操作参比 用不含待测组分的试样 在相同条件下与被测试样同样处理 得到平行操作参比溶液 如血液中药物浓度的监测 用不含药物的血样制备平行操作参比溶液 82 三 选择吸光度测量范围任何光度计都有一定的测量误差 用透射比的读数误差 来表示不同的仪器 是不同的 约为0 3 2 同一台的仪器 大小不变的 83 三 选择吸光度测量范围任何光度计都有一定的测量误差 用透射比的读数误差 来表示不同的仪器 是不同的 约为0 3 2 同一台的仪器 大小不变的 84 测量结果的误差常用浓度的相对误差 c c表示 它的大小是与 的大小有关的 0 434 lg 85 下表是在 0 5 时不同透射比所对应的浓度相对误差 86 87 由上图可以看出 在15 65 之间测量误差较小 2 相应的最佳吸光度范围是0 2 0 8 最佳透射比 36 8 最佳吸光度A 0 434 控制吸光度范围的方法 1 控制溶液的浓度 2 选用适当厚度的比色皿 88 三 共存离子的干扰和消除 一 干扰离子的影响1 共存离子本身具有颜色 如Fe3 Ni2 Co2 Cu2 Cr3 等2 共存离子与显色剂或被测组分反应 妨碍显色反应的完成 3 共存离子与显色剂反应生成有色化合物或沉淀 89 二 干扰的消除方法1 控制溶液的酸度例如 以磺基水杨酸测定Fe3 时 若Cu2 共存 此时Cu2 也能与磺基水杨酸形成黄色配合物而干扰测定 若溶液酸度控制在pH 2 5 此时铁能与磺基水杨酸形成配合物 而铜就不能 这样就可以消除Cu2 的干扰 90 2 加入掩蔽剂 掩蔽干扰离子例如 以磺基水杨酸测定Cu2 时 若Fe3 共存 可以采用掩蔽剂草酸来消除3 改变干扰离子的价态以消除干扰例如 用铬天菁S显色Al3 时 若加入抗坏血酸或盐酸羟胺便可以使Fe3 还原为Fe2 消除了干扰 91 4 选择适当的入射光波长消除干扰例如用4 氨基安替吡啉显色测定废水中酚时 氧化剂铁氰化钾和显色剂都呈黄色 干扰测定 若选择用520nm单色光为入射光 则可以消除 因为黄色溶液在420nm左右有强吸收 但500nm后则无吸收 92 5 选择合适的参比溶液可以消除显色剂和某些有色共存离子干扰 如检测酸奶的亚硝酸盐指标 显色后在538nm波长测定 在前处理过滤后 一般的奶样滤液都是无色的 但就是草莓酸奶 过滤完后滤液是红色的 在测定中产生干扰 使测定结果偏高 如果采用试液参比 滤液为参比 扣除效果不错 93 6 分离干扰离子如采用电解法 沉淀法 溶剂萃取及离子交换法等分离 如果上述方法都不能使用 可以考虑利用双波长法 导数光谱法等新技术来消除干扰 94 第五节定量方法比色分析法分为目视比色法和紫外可见分光光度法 95 一 目视比色法是应用最早的比色分析法 仪器 比色管相对误差约为5 20 1 原理相同条件下两溶液颜色深度一样 即A相同 则 96 2 目视比色方法目视比色方法有两种 1 固定标准溶液浓度 调整两溶液的液层厚度 使标准溶液与被测溶液颜色深度一样 应用较少 例如 杜氏比色计法 就是如此 97 2 固定液层厚度 调整标准溶液浓度 使标准溶液与被测溶液颜色深度一样 98 如最常用的目视比色法 标准系列法 色阶法 99 3 比色管要求同样材质 同批制造 形状大小相同的平底玻璃管 管上带有刻度 一般为50ml或25ml 和塞子 100 二 紫外可见分光光度法相对误差约为 2 5 1 定量依据光吸收定律也叫朗伯 比尔定律A kbc 101 一 单组分样品的分析1 标准比较法在相同条件下测得一个标准溶液cS的吸光度AS和试液cx的吸光度Ax 则 102 一 单组分样品的分析1 标准比较法在相同条件下测得一个标准溶液cS的吸光度AS和试液cx的吸光度Ax 则 103 注意事项 cx与cs浓度应接近 cx与cs符合吸收定律 适于个别样品的测定 104 2 校准曲线法校准曲线是描述待测物质浓度或量与检测仪器响应值或指示量之间的定量关系曲线 分为 工作曲线 标准溶液处理程序及分析步骤与样品完全相同 和 标准曲线 较样品有所省略 如样品预处理 105 校准曲线法是使用最多的定量方法 106 注意事项 配制不少于六个 含空白浓度 浓度不同的待测组分的标准溶液 必要时候考虑基体的影响 使标液与试样溶液的组成保持一致 校准曲线绘制最好与批量测定同时进行 校准曲线的相关系数绝对值一般应大于或等于0 999 107 使用校准曲线时 应选用曲线的直线部分和最佳测量范围 不得任意外延待测试液的浓度最好在曲线中部 工作曲线应定期校准 工作曲线法适于成批样品的分析 108 工作曲线上标明 标准曲线的名称 所用标准溶液 或标样 名称和浓度 坐标分度和单位 测量条件 仪器型号 入射光波长 吸收池厚度 参比液名称 以及制作日期和制作者姓名 109 测定试样溶液含量 在相同条件下测定试样溶液的吸光度 由测得的吸光度在曲线上查得试样溶液中待测组分的浓度 或质量 也可以采用一元线性回归方程处理 简化步骤 同时避免绘制工作曲线的主观误差 最后根据试样的前处理过程 通过计算得到原来试样中待测组分的含量 110 校准曲线可以用一元线性方程表示 y a bx称一元线性回归方程 1 1 2 1 2 1 2 111 3 标准加入法 增量法 当试样中共存物不明或基体复杂而又无法配制与试样组成相匹配的标准溶液时 使用标准加入法进行分析是合适的 112 注意 相应的标准曲线应是一条通过坐标原点的直线 第二份中加入的标准溶液的浓度与试样的浓度应当接近 至少要采用四个点来制作外推曲线 标准加入法可以消除基体效应带来的影响 113 二 多组分定量测定定量依据除了光吸收定律外 还有吸光度的加和性原理 两种吸光组分的吸收光谱一般有下面两种情况 114 1 吸收光谱曲线不重叠或部分重叠可分别在波长 1和 2处测定组分x和y 相互不产生干扰 115 2 吸收光谱曲线重叠 116 1 解联立方程组可选定二个波长 1和 2并分别在 1和 2处测定吸光度A1和A2 1 1 1 2 2 2 解联立方程组 同时测定多组分 但准确度低 117 例吸取5 00ml10 0mg mLCr标准浓度溶液 10 00ml0 500mg mLMn标准浓度溶液 10 00mL未知样显色后定容为50ml 用1cm比色皿 用空白为参比溶液 分别在440nm和545nm处测定得到如下吸光度 计算出未知样中Cr6 和Mn7 两种离子的含量 mg mL 118 2 双波长分光光度法 只测定混合物中的一个组分 测定多组分的含量 混浊样品或背景吸收大的样品 采用双波长分光光度法 消除干扰 提高选择性 1 2波长组合选择的方法有等吸收点法和系数倍率法 119 1 常用的方法 双波长等吸收点法选出两束波长为 1和 2的单色光 使干扰组份或者背景的吸光度相等 120 这是双波长分光光度法定量分析的依据 2 1 1 干扰1 2 干扰2 1 2 1 2 1 2 121 影响因素 1 测定波长和组合波长的选择应使被测组分的 A值尽可能大 2 测定波长和组合波长应尽可能选择在光谱曲线斜率变化较小的波长处 3 干扰组分等吸收波长 组合波长 的选择必须精确 122 应用实例等吸收波长法的一个典型应用实例为收载于 中华人民共和国药典 中的抗菌消炎药复方磺胺甲噁唑片的含量测定 复方磺胺甲噁唑片中含有磺胺甲噁唑 SMZ 和甲氧苄 TMP 两个成分 当测定SMZ时 选择其最大吸收波长257nm为测定波长 可以在干扰组分TMP的光谱曲线上304nm附近找到等吸收波长为组合波长消除其干扰 当测定TMP时 选择239nm为测定波长 可以在干扰组分SMZ的光谱曲线上295nm附近找到等吸收波长为组合波长消除其干扰 分别对SMZ和TMP进行含量测定 123 2 系数倍率法应用实例系数倍增法一个典型应用实例为收载于日本药局方中的解热镇痛药阿斯匹林铝的含量测定 阿斯匹林铝中因含有分解产物游离子杨酸而干扰其测定 在阿斯匹林铝的测定波长278nm处水杨酸有干扰 而在水杨酸的最大吸收波长308nm处 阿斯匹林铝已无吸收 当用水杨酸对照品测得As 和As的比值K后 即可用系数倍增法对含有游离水杨酸的阿斯匹林铝进行含量测定 124 双波长分光光度计只使用一个吸收池 用两束波长为 1和 2的单色光交替照射到同一样品池 可以直接得到差值吸光度 lg 2 1 lg 2 0 1 0 lg 2 0 lg 1 0 2 1 2 干扰2 1 干扰1 2 1 2 1 2 1 125 三 高含量组分的测定示差吸光光度法又称差示分光光度法有时由于待测组分含量过高或过低 采取其它措施不能满足吸光度值在0 2 0 8 可采用示差分光光度法 126 示差法中按照参比溶液不同 分为3种 高吸光度法 低吸光度法 最高精密度法 127 高吸光度示差分光光度法是常用的示差法 有时把它简称示差法 检测器未受光照时 调节透射比为0 用一个浓度稍低于待测溶液的参比溶液调节透射比为100 相对 s 0 s 0 s 128 高吸光度示差分光光度法是常用的示差法 有时把它简称示差法 此法特别适用于A 1 参比溶液浓度于未知液越接近 误差越小 相对 相对 lg 相对 lg 0 434 相对 相对lg 相对 129 示差分光光度法对仪器和实验条件的要求对仪器的要求 仪器必须配备强的光源 好的单色器及稳定的电子系统 对吸收池要求 严格配对 温度控制 制做校正曲线和测量样品时 温度必须控制在 2 范围内 若精度要求更高 应有恒温装置 130 第六节紫外可见分光光度法其他应用一 定性分析1 紫外可见吸收光谱的特点紫外可见吸收光谱是分子或离子团吸收光产生的 故为分子吸收光谱分子的总能量等于电子的运动 原子间的振动和分子作为整体的转动能量之和 分 电 振 转 131 分子的能级 电子能级 振动能级 转动能级 电子能级的能级差最大 振动能级次之 转动能级的最小 132 跃迁条件 紫外 可见吸收光谱特点 带状 光谱 能级差 133 2 分子中电子的跃迁 1 分子中电子的分类分三种 n电子各轨道的能量 n 134 2 分子中电子跃迁的类型共有六种形式电子跃迁 较为常见是 n 和n 跃迁四种类型 饱和烷烃常用做紫外吸收光谱的溶剂 如己烷 环己烷 庚烷等 截止波长 己烷210nm 水210nm 甲醇215nm 二氯甲烷235nm 丙酮330nm 135 3 紫外吸收光谱常用术语 1 生色团能吸收紫外 可见光的基